C9orf72介導的小膠質細胞功能異常與肌萎縮性側索硬化和額顳葉癡呆相關性研究進展

郭冬芬 禹文峰 姚源蓉

(1貴州醫科大學分子生物學重點實驗室，貴州 貴陽 550004；2貴州省人民醫院神經內科)

肌萎縮側索硬化(ALS)和額顳葉癡呆(FTD)都是一種漸進性、致死性的神經退行性疾病，二者都伴有神經元的丟失且在臨床表現、病理機制、神經行為特征和遺傳病因上有部分重疊。二者的發病機制尚不明確，據報道有基因突變，包括9號染色體開放閱讀框72基因(C9orf72)、TAR DNA結合蛋白基因 (TARDBP)和肉瘤融合蛋白基因(FUS)等。其中C9orf72 G4C2六核苷酸重復(HRE)是最常見的導致ALS和FTD發生的基因突變〔1,2〕。由于運動神經元的丟失是ALS和FTD的主要病理標志，因此早期的研究主要集中在以神經元病變為中心，然而最近的研究表明神經退行性疾病中存在非神經元細胞類型的病變，包括星形膠質細胞、少突膠質細胞和小膠質細胞〔3〕。野生型C9orf72在囊泡運輸和溶酶體功能中發揮重要作用，研究發現C9orf72突變與神經炎癥和吞噬異常相關，神經炎癥是ALS和FTD的病理性特征，特點是小膠質細胞的激活并釋放促炎癥因子與神經毒性物質；其次，自噬與吞噬之間存在相似性，自噬異常會影響小膠質細胞的吞噬功能。本文就C9orf72通過影響小膠質細胞的功能從而參與ALS和FTD的發生發展進行綜述。

1 小膠質細胞與神經炎癥

小膠質細胞是先天免疫系統的組成部分，占中樞神經系統細胞的5%～12%〔4〕。正常情況下，小膠質細胞能夠感知其周圍的環境，通過其分支來實時監測微環境，尋找潛在的信號，采取進一步的行動。同時，小膠質細胞還能分泌多種神經營養因子，如神經生長因子和堿性成纖維細胞生長因子來促進突觸形成，因此正常狀態下的小膠質細胞對于神經元的發育和維持很重要〔5〕。但當受到刺激時，小膠質細胞會被激活，根據其受到的刺激不同，可以極化為不同的表型。分別為促炎癥型(M1型)和抗炎癥型(M2型)。M1型小膠質細胞能產生促炎癥介質，包括一氧化氮合酶、白細胞介素-1β、腫瘤壞死因子α，對神經元產生毒性作用〔6〕。而M2型具有吞噬作用，同時還能產生抗炎因子及神經營養因子，能減少神經系統的炎癥反應，促進神經修復，起到神經保護作用〔7〕。因此激活的小膠質細胞對于調控神經炎癥具有重要意義。研究發現炎性級聯反應可能是ALS和FTD發病機制之一，在阿爾茨海默病(AD)和帕金森病(PD)患者大腦中，都發現有激活的小膠質細胞〔8〕，且兩種疾病中都伴隨炎癥發生。用環氮氧化物四甲基哌啶處理ALS模型鼠(SOD1G93A轉基因鼠)，可緩解ALS模型鼠的體重下降、改善運動缺陷及減少運動神經元的丟失。且檢測到給藥后，脊髓前角的小膠質細胞反應活性顯著降低，同時炎癥因子的基因表達也相應下調，這表明四甲基哌啶可能通過減少小膠質細胞的活化及其介導的神經炎癥從而延緩ALS的發展〔9〕。因此，激活的小膠質細胞介導的神經炎癥可能直接影響包括ALS在內的多種神經退行性疾病的發生發展〔10〕。

2 C9orf72與ALS/FTD的神經病理

C9orf72的G4C2六核苷酸重復擴增，是ALS和FTD最常見的遺傳病因。野生型的C9orf72能翻譯成鳥嘌呤核苷酸交換因子，參與調節神經元和免疫細胞的囊泡轉運和自噬〔11〕。在正常人體內，該基因為2～3個重復，而在發生C9orf72突變的ALS患者體內，其重復為66～4 400個。C9orf72 HRE造成疾病的可能機制有3個，包括由于C9orf72單倍表達不足造成功能丟失、由C9orf72擴增重復序列而產生的核糖核酸(RNA)團簇、與重復相關的非抗胸腺細胞球蛋白(ATG)依賴翻譯產生雙肽重復蛋白(DRPs)〔12〕。這些DRPs主要有5種，包括poly-GA、poly-GP、poly-GR、poly-PR、poly-PA。研究發現，當發生C9orf72 HRE時，最容易受到危害的就是神經元，主要是因為發生C9orf72 HRE時，單倍體不足導致其表達下調，致使運動神經元中的溶酶體數量下降，從而導致DRPs在神經元積累對其產生毒性〔13〕，ALS病變區域包括運動皮層、額葉皮層和脊髓前角，都發現poly-GR的聚集〔14〕。除了直接危害神經元參與ALS/FTD發生，近年來還發現C9orf72 HRE與炎癥相關。據Burberry等〔15〕報道，小鼠中C9orf72同源基因的功能缺失突變，可引起多種炎性因子的釋放，導致致命性的自身免疫性疾病。另外，對C9orf72基因缺陷的小鼠脊髓中的小膠質細胞進行分析，結果顯示促炎細胞因子白介素-1β、白介素-6表達均上調〔16〕。綜上，C9orf72突變除了直接危害神經元外，還可能通過引起小膠質細胞功能異常，從而參與ALS和FTD的發生。

3 C9orf72激活小膠質細胞介導炎癥

C9orf72在ALS患者退化的神經元和膠質細胞亞群中選擇性高表達〔17〕。據報道發生C9orf72突變的額顳葉變性患者中CD68抗原免疫活性和小膠質細胞形態與正常對照組明顯不同〔18〕。同樣，C9orf72突變的ALS患者體內小膠質細胞的鈣離子接頭蛋白(Iba)1和CD68免疫反應性也比散發性ALS病例更高〔19〕。這提示C9orf72的突變可能會導致小膠質細胞激活。在6月齡小鼠脊髓的神經元表達Poly-GA后，檢測到激活的小膠質細胞的標志物Iba1、CD68的免疫活性明顯增加，而在神經元未表現出Poly-GA病變的腦部區域沒有檢測到CD68、Iba1活性〔20〕。同時，與野生型對照組小鼠相比，對神經元中特異性表達poly-GA的小鼠，進行poly-GA疫苗接種后，發現其脊髓中的小膠質細胞激活減少〔21〕。這表明，DRPs在神經元中積累并對其產生毒性的同時，還能激活小膠質細胞。另外，對ALS、FTD和發生C9orf72突變的ALS患者尸檢額葉皮層組織進行分析，發現攜帶C9orf72突變的ALS患者額葉皮層中與星形膠質細胞和小膠質細胞有關蛋白顯著增加，且通過對C9orf72突變的ALS患者和沒有C9orf72突變的ALS患者間進行蛋白對比分析，發現在C9orf72突變的ALS患者中，有明顯蛋白表達的增加或下降，且這些蛋白表達的變化與神經炎癥相關，從而確定了C9orf72突變與神經炎癥相關〔22〕。同樣的，與正常對照組相比，神經元特異性表達poly-PR的小鼠，小腦和脊髓處激活的星形膠質細胞、小膠質細胞數量明顯增加，運動皮層和脊髓中與炎癥相關的3個基因，包括補體基因補體成分1q子成分A(C1qa)、CD68基因、髓樣細胞觸發受體2基因表達均上調，且小鼠出現運動功能障礙和神經變性〔23〕。綜上，C9orf7功能異常可能通過激活小膠質細胞，嚴重擾亂免疫內環境，導致系統性自身免疫性疾病并引起神經炎癥，進一步加重對神經元的危害，從而導致ALS和FTD相關病理。

4 C9orf72介導的自噬異常與小膠質細胞的關系

除了通過激活小膠質細胞引起神經炎癥參與ALS和FTD過程，C9orf72的另一主要功能就是調控自噬。研究發現，C9orf72可以與史密斯-馬蓋尼斯綜合征染色體候選基因(SMCR)8和WD重復域蛋白(WDR)41形成復合體共同調控自噬——溶酶體通路，C9orf72或SMCR8的表達異常，都會導致自噬異常〔24〕。當C9orf72表達下調時，自噬的功能受到影響而減弱，從而不能清除這些DRPs的聚集，如小鼠皮層神經元中敲除C9orf72，發現有反式激活反應-DNA結合蛋白(TDP)-43包涵體在神經元胞漿聚集〔25,26〕。已有報道，在多種神經退行性疾病中存在自噬功能異常，如AD、PD、亨廷頓病、ALS〔27〕。除了通過自噬影響DRPs的形成，近年來還發現C9orf72可能通過自噬異常而影響小膠質細胞的吞噬功能從而參與ALS和FTD的發生發展。作為大腦中先天免疫系統的主要參與者，小膠質細胞能協調大腦的炎癥反應，對中樞神經系統的損傷做出反應，并調節可溶性炎癥介質的釋放及吞噬中樞神經系統中的特異性碎片〔28〕，因此小膠質細胞吞噬功能異常可能會導致神經疾病，如在小鼠和人的顳葉癲癇中都有發現小膠質細胞吞噬功能的慢性損傷〔29〕。據Nash等〔30〕報道，一種能保護神經免受氧化應激損傷的蛋白質DJ-1的表達不足會影響自噬功能，自噬功能異常后會導致小膠質細胞吞噬并清除α-核突觸蛋白的能力下降。同樣有研究顯示，脂多糖激活Toll樣受體(TLR)4后，自噬通量和自噬相關基因在小膠質細胞中的表達明顯受到抑制，同時小膠質細胞的吞噬功能也受到自噬影響下降〔31〕。以上結果表明自噬異常可以影響小膠質細胞的吞噬功能。除此之外，已有研究證實，小膠質細胞中與吞噬相關的一些基因的突變會導致小膠質細胞吞噬功能的異常，參與神經退行性疾病的發生發展，如選擇性在小膠質細胞表達的髓樣細胞觸發受體2基因突變導致功能喪失，會改變小膠質細胞的炎癥應答和減弱其吞噬功能〔32〕，從而與ALS、FTD、AD、PD的發生相關。同樣，在小膠質細胞和神經元中都有表達的顆粒蛋白前體基因，其突變也會導致細胞的吞噬功能異常〔33〕。另外，對C9orf72敲除的小鼠脊髓中分離的小膠質細胞進行分析，發現細胞因子白介素-1β和白介素-6水平升高，其潛在機制可能與其溶酶體功能異常相關〔16〕。由于野生型的C9orf72具有調節自噬和溶酶體功能的作用，因此推測，當C9orf72功能異常時，也可能會通過自噬異常進而影響小膠質細胞的吞噬功能，進一步加重神經變性的危害，從而參與ALS和FTD。

綜上，C9orf72的G4C2六核苷酸重復擴增，是ALS和FTD最常見的遺傳病因，C9orf72突變時主要危及神經元〔34〕，但近年來的研究發現C9orf72突變還可能危及非神經元細胞類型〔3〕，如在攜帶C9orf72突變的患者體內發現有激活的小膠質細胞，同時伴隨炎癥因子的釋放〔19,22〕，基于這些已有的研究，本文概述了C9orf72可能通過激活小膠質細胞介導神經炎癥發生，并可能影響小膠質細胞的吞噬功能，從而參與ALS和FTD的發生發展。這一途徑將為ALS和FTD發生機制研究提供新思路。