PELGE-克班寧納米粒在大鼠體內的組織分布及藥動學研究Δ

崔利利，孔淑君，王輝黃秋艷汪紅梅馬云淑（.云南中醫藥大學中藥學院，昆明 6000；2.南京中醫藥大學藥學院，南京 2002；.迪沙藥業集團有限公司，山東 威海 264200；4.云南省高校外用給藥系統與制劑技術重點實驗室，昆明 6000；.云南省傣醫藥與彝醫藥重點實驗室，昆明 6000）

克班寧[crebanine（Cre），化學結構式見圖1]是從防己科千金藤屬云南地不容Stephania yunnanensisH. S.Lo中提取的生物堿[1]，具有抗炎、抗心律失常、抗腫瘤作用，臨床價值較高[2-9]。但有研究表明，Cre的半數致死量（median lethal dose，LD50）為9.382 mg/kg，毒性較大，使得其研發和應用受到了限制[6]。聚乙二醇-（聚乳酸-羥基乙酸）-聚乙二醇三嵌段共聚物[polyethylene glycolpoly lactide（acid-hydroxyacetic acid）-poly ethylene glycol triblock copolymer），PELGE]的生物相容性較好，可延長藥物在血液中的循環時間，并縮短其代謝時間[10-11]，故本課題組前期制備了以PELGE為載體的Cre納米粒（PELGE-Cre-NPs）。相關藥動學研究結果顯示，與Cre注射液相比，PELGE-Cre-NPs在家兔體內的滯留時間顯著延長[12]。有研究指出，藥物在不同生物體內存在質或量的種屬差異[13]。基于此，本研究擬進一步探討PELGE-Cre-NPs在大鼠體內的組織分布情況及組織藥動學特征，以期為該制劑后續的藥效學研究提供理論基礎支撐。

圖1 Cre的化學結構式

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器包括1260 Infinity型高效液相色譜（HPLC）儀（美國Agilent公司）、HSC-12A型氮吹儀（天津市恒奧科技發展有限公司）、XHF-1型內切式勻漿機（寧波新芝生物科技股份有限公司）、TGL-16G型臺式離心機（上海安亭科學儀器廠）、XK96-A型快速混勻器（姜堰市新康醫療器械有限公司）等。

1.2 主要藥品與試劑

PELGE-Cre-NPs（批號 2016011003，Cre含量 1.5 mg/mL，包封率90.32%）、Cre對照品（批號20141101，純度99.2%）均由云南中醫藥大學藥劑實驗室自制（制備方法參考文獻[14]）；鹽酸維拉帕米對照品（內標，批號100223-200102，供含量測定用）購自中國食品藥品檢定研究院；氯化鈉注射液（批號2106304B，規格500 mL∶4.5 g）購自安徽雙鶴藥業有限責任公司，作生理鹽水用；75%乙醇（批號121002）購自昆明遠方生物制品有限公司；甲醇為色譜純，乙酸乙酯等其余試劑均為分析純，水為純化水。

1.3 實驗動物

SPF級SD大鼠54只，雌雄各半，體質量180～220 g，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，動物生產許可證號為SCXK（湘）2019-0004。

2 方法與結果

2.1 溶液的制備

2.1.1 對照品溶液 精密稱取Cre對照品適量，用甲醇溶解制成質量濃度為1 000 μg/mL的儲備液，再用甲醇進一步稀釋制成質量濃度為 520、260、130、65、32.5、16.25、8.125 μg/mL的系列標準溶液，于4 ℃條件下保存，備用。

2.1.2 內標溶液 精密稱取內標2 mg，置于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，制成質量濃度為200 μg/mL的內標溶液，于4 ℃條件下保存，備用。

2.2 生物樣品處理方法

取大鼠的心、肝、脾、肺、腎、腦組織樣品各適量，精密稱定，分別加生理鹽水少許，用組織勻漿機以5 000 r/min勻漿，再加生理鹽水，制成每3 mL含1 g組織的樣品。精密吸取上述組織樣品0.5 mL，置于離心管中，精密加入“2.1.2”項下內標溶液20 μL、甲醇20 μL、乙酸乙酯3 mL，渦旋萃取3 min，再以4 000 r/min離心10 min，吸取上層有機相2.4 mL，置于5 mL離心管中，于50 ℃水浴中以氮氣流吹干，殘渣加甲醇200 μL，渦旋1.5 min復溶，經0.22 μm濾膜濾過，取續濾液20 μL進行HPLC分析。

2.3 樣品分析方法的建立與驗證

2.3.1 色譜條件 以Agilent ZORBAX Extend-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）為色譜柱，甲醇-0.01%三乙胺溶液（75∶25，V/V）為流動相；流速為1 mL/min；檢測波長為280 nm；柱溫為30 ℃；進樣量為20 μL。

2.3.2 方法學考察 （1）專屬性考察：分別取未給藥大鼠的心、肝、脾、肺、腎、腦組織適量，除不加Cre對照品和內標溶液外，其余按“2.2”項下方法處理后，制成空白組織勻漿液，按“2.3.1”項下色譜條件進樣分析，得大鼠空白組織樣品色譜圖（圖略）；將一定量的Cre對照品溶液（5 μg/mL）加入空白組織勻漿液中，按“2.2”項下方法處理后，再按“2.3.1”項下色譜條件進樣分析，得含對照品和內標空白組織樣品的色譜圖（圖2A）；尾靜脈給藥后5 min處死大鼠，取各組織并制備得含藥的心、肝、脾、肺、腎、腦組織勻漿液樣品，按“2.2”項下方法處理后，再按“2.3.1”項下色譜條件進樣分析，得含藥組織樣品的色譜圖（圖2B）。由圖2可知，大鼠各組織中的內源性物質對Cre和內標的測定無干擾。

圖2 Cre專屬性考察的HPLC圖

（2）標準曲線繪制與定量下限考察：精密量取大鼠空白心、肝、脾、肺、腎、腦組織勻漿液0.5 mL，置于10 mL離心管中，分別加入“2.1.1”項下Cre系列標準溶液適量，制成 Cre質量濃度分別為 0.312 5、0.625、1.25、2.5、5 μg/mL的系列心組織樣品，質量濃度分別為0.312 5、0.625、1.25、2.5、5、10、20 μg/mL的系列肺組織樣品和質量濃度均分別為0.312 5、0.625、1.25、2.5、5、10 μg/mL的系列肝、脾、腎、腦組織樣品。取上述系列組織樣品，按“2.2”項下方法處理后，再按“2.3.1”項下色譜條件進樣分析，記錄峰面積。以Cre質量濃度為橫坐標（c）、Cre與內標的峰面積比值為縱坐標（A）進行線性回歸，結果見表1。由表1可見，各組織樣品中，Cre在各自檢測質量濃度范圍內與峰面積比值的線性關系均良好（R2＞0.999），定量下限質量濃度均為0.312 5 μg/mL。

表1 大鼠各組織樣品中Cre的回歸方程和線性范圍

（3）精密度與準確度試驗：分別于同日內6個不同時間點和3 d內按“2.3.2（2）”項下方法配制Cre低、中、高質量濃度和定量下限質量濃度的心、肝、脾、肺、腎、腦組織樣品，按“2.2”項下方法處理后，再按“2.3.1”項下色譜條件進樣分析，以RSD考察日內、日間精密度，以實測質量濃度與理論質量濃度的比值考察準確度，結果見表2。由表2可知，Cre各組織樣品的日內、日間RSD均小于10%，準確度為81.85%～118.83%。

（4）穩定性試驗：分別按“2.3.2（2）”項下方法配制Cre低、中、高質量濃度的各組織樣品，按“2.2”項下方法處理后，分別于室溫放置24 h、-20 ℃放置24 h、反復凍融（-20 ℃～室溫）3次后，按“2.3.1”項下色譜條件進樣分析，記錄峰面積。結果顯示，各樣品中Cre峰面積的RSD均小于10%，符合生物樣品方法學考察的相關要求[15]。

2.4 PELGE-Cre-NPs在大鼠各組織樣品中的分布情況

將大鼠分為9組（每個時間點為1組），每組6只，雌雄各半。大鼠禁食、不禁水24 h后，以5 mg/kg的劑量（以Cre質量計，劑量設置參考文獻[16]）尾靜脈注射PELGE-Cre-NPs，隨后分別于5、15、30、60、90、120、180、240、300 min時解剖大鼠，取心、肝、脾、肺、腎、大腦組織樣品，用生理鹽水清洗表面，以濾紙吸干后，按“2.2”項下方法處理后，再按“2.3.1”項下色譜條件進樣分析，記錄峰面積，以內標法計算各組織樣品中Cre的含量。大鼠尾靜脈注射PELGE-Cre-NPs后各時間點心、肝、脾、肺、腎、腦組織樣品中Cre含量的變化情況見圖3。由圖3可知，給藥后5、15、30、60、90 min，Cre在大鼠各組織樣品中的含量由高到低依次為肺、腎、脾、肝、腦、心；給藥后120、180、240、300 min，Cre在大鼠各組織樣品中的含量由高到低則變為肺、脾、腎、肝、腦、心。與本課題組前期研究[17]的Cre注射劑相比，PELGE-Cre-NPs在大鼠各組織中的分布明顯增加，代謝時間有所延長，初步達到了長循環的目的。

圖3 尾靜脈注射PELGE-Cre-NPs后不同時間點大鼠各組織樣品中Cre含量的變化情況

2.5 PELGE-Cre-NPs在大鼠各組織樣品中的藥動學特征

使用DAS藥動學軟件對大鼠各組織樣品中Cre的濃度數據進行非房室模型擬合，大鼠6個組織的平均藥-時曲線見圖4，主要藥動學參數見表3。以藥-時曲線下面積（AUC0-t）為Cre組織分布的評價指標[18]，結果顯示，Cre在大鼠各組織樣品中的分布由高到低依次為肺、腎、脾、肝、腦、心；以平均滯留時間（MRT0-t）為Cre滯留的評價指標，結果顯示，Cre在大鼠各組織樣品中滯留時間由長到短依次為脾、肝、心、肺、腎、腦；此外，Cre在心、肝、脾、肺、腎、腦組織中的末端消除半衰期（t1/2z）分別為4.83、5.93、3.75、4.99、3.89、3.95 h。

圖4 尾靜脈注射PELGE-Cre-NPs后大鼠各組織樣品中Cre的平均藥-時曲線（±s，n＝6）

表3 尾靜脈注射PELGE-Cre-NPs后大鼠各組織樣品中Cre的主要藥動學參數（非房室模型，±s，n＝6）

表3 尾靜脈注射PELGE-Cre-NPs后大鼠各組織樣品中Cre的主要藥動學參數（非房室模型，±s，n＝6）

AUMC0-t：藥物與時間乘積對時間t的積分；VRT0-t：滯留時間的方差；Vz：分布容積；CLz：清除率；cmax：達峰濃度

參數AUC0-t/（mg·h/L）AUMC0-t/（mg·h2/L）MRT0-t/h VRT0-t/h2 t1/2z/h Vz/L CLz/（L/h）cmax/（μg/g）心肝脾肺腎腦18.86±1.66 36.53±1.24 1.94±0.12 2.18±0.05 4.83±1.98 1.02±0.23 0.15±0.06 8.47±2.43 43.36±4.99 85.27±3.06 1.97±1.02 2.17±0.07 5.93±2.34 0.47±0.08 0.06±0.02 21.81±5.56 51.36±5.34 101.84±3.87 1.98±1.23 2.10±0.05 3.75±1.87 0.33±0.07 0.06±0.02 22.05±6.75 81.86±12.34 154.80±6.55 1.89±0.21 2.25±0.07 4.99±2.54 0.24±0.06 0.03±0.01 48.16±13.98 53.31±3.19 100.04±2.06 1.88±0.06 2.10±0.03 3.89±1.05 0.33±0.04 0.06±0.01 29.19±5.64 27.73±4.76 51.28±3.23 1.85±0.19 2.21±0.09 3.95±2.67 0.64±0.15 0.11±0.03 17.94±6.12

3 討論

組織分布實驗結果顯示，尾靜脈注射PELGE-Cre-NPs后，Cre在大鼠體內的各個組織中均有分布：給藥后5、15、30、60、90 min，Cre在大鼠各組織中的含量由高到低依次為肺、腎、脾、肝、腦、心；給藥后120、180、240、300 min，Cre在大鼠各組織中的含量由高到低則變為肺、脾、腎、肝、腦、心。此外，隨著時間的推移，大鼠各組織樣品中Cre的含量皆在下降，且不同組織間Cre含量的差異有縮小趨勢。

組織藥動學研究結果顯示，Cre在肺組織中的AUC0-t最大[（81.86±12.34）mg·h/L]，t1/2z較長[（4.99±2.54）h]，提示PELGE-Cre-NPs在大鼠肺組織中的分布較多且消除較慢。Cre在肝組織中的AUC0-t居中[（43.36±4.99）mg·h/L]，t1/2z最長[（5.93±2.34）h]，MRT0-t也較長[（1.97±0.12）h]，提示PELGE-Cre-NPs在大鼠肝組織中也有一定分布，且消除時間較長。Cre在心組織中的AUC0-t最小[（18.86±1.66）mg·h/L]，但其MRT0-t[（1.94±0.12）h]長于該藥在肺組織中的MRT0-t[（1.89±0.21）h]，提示PELGE-Cre-NPs雖在心組織中的分布較少，但滯留時間較長。Cre在腦組織中亦有所分布，提示該藥能透過血腦屏障，這可能與Cre為弱堿性的小極性化合物有關。

通過對比本課題組前期組織分布研究[17]結果發現，與Cre注射劑相比，制成PELGE-Cre-NPs后，Cre在心、肝、脾、肺、腎、腦組織中的平均含量（給藥后120 min）分別由 1.39、1.66、1.56、2.53、1.56、1.42 μg/g 升至 3.37、7.82、10.11、14.11、9.82、4.93 μg/g，提示劑型的改變使Cre在大鼠各組織中的分布均有所增加，初步達到了長循環的目的。但由于2項實驗的操作條件有所不同，故劑型的分布差異有待后續研究進一步驗證。

綜上所述，PELGE-Cre-NPs在大鼠各組織中均有分布，以肺組織為主，心組織較少；該藥在各組織中的消除有所不同，在心、肺、肝組織中的消除較慢。