天智顆粒的化學成分及入血成分定性分析Δ

楊成，胡鍇，韓鵬昭，宋軍營，張振強，孫寧，王潘，謝治深，李中華（.河南中醫藥大學藥學院，鄭州 450046；.河南中醫藥大學中醫藥科學院，鄭州 450046）

天智顆粒是根據天麻鉤藤飲研制而成的一種中成藥[1]，主要由天麻、鉤藤、石決明、杜仲、桑寄生、茯神、首烏藤、槐花、梔子、黃芩、川牛膝以及益母草12味中藥組成。按君、臣、佐、使理論，各藥相輔相成，使天智顆粒具有平肝潛陽、補益肝腎、益智安神之功效[2]。現代藥理研究表明，天智顆粒可以通過提高膽堿能神經功能和抗氧化酶活性，抑制腦內興奮性氨基酸的神經毒性，來改善血管性癡呆的癥狀[3]，臨床主要用于治療肝陽上亢的中風引起的智力減退、認知障礙等[4]，但其藥效物質尚不明確，且關于天智顆粒的化學成分分析的報道亦較少。因此，有必要進一步研究該藥所含的化學成分，進而明確其藥效物質基礎，建立科學的用藥依據和質量控制方法。

超高效液相色譜-電噴霧-四極桿-飛行時間-串聯質譜（UPLC-ESI-Q-TOF-MS/MS）技術相較于普通的高效液相色譜技術而言，可快速得到目標分析物的分子離子峰和碎片離子等信息，可以實現脫離標準品而對樣品中多成分同時進行定性分析。目前，該技術被廣泛用于代謝組學和化學成分、入血成分等分析的研究中，且在中藥和中藥制劑研究領域具有顯著優勢[5]。基于此，本研究采用UPLC-ESI-Q-TOF-MS/MS技術對天智顆粒的化學成分及入血成分進行定性分析，以期為闡明天智顆粒的藥效物質基礎提供參考。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器包括LC30AD型UPLC儀（日本Shimadzu公司）、SCIEX Triple TOF 6600型質譜儀（美國Sciex公司）、KQ5200DE型數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）、H2-16K型臺式高速離心機（湖南可成儀器設備有限公司）、AL204型電子天平[梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司]。

1.2 主要藥品與試劑

天智顆粒（批號191003，規格5 g/袋）由仲景宛西制藥股份有限公司提供；甲醇和乙腈均為色譜純，其他試劑均為分析純，水為純化水。

1.3 動物

SD雄性健康大鼠，體質量（210±10）g，由鄭州市惠濟區華興實驗動物養殖場提供，飼養于河南中醫藥大學實驗動物中心，實驗動物生產許可證號為SCXK（豫）2019-0002。所有大鼠飼養于室溫（24±2）℃、相對濕度（55±15）%、12 h黑暗/12 h光照循環的環境中，正常飲食、飲水。大鼠適應性喂養3 d后進行實驗。

2 方法

2.1 色譜條件和質譜條件

色譜條件如下：色譜柱為Agilent Eclipse Plus C18（4.6 mm×100 mm，1.8 μm）；流動相A為0.5%甲酸水溶液，流動相B為乙腈，梯度洗脫（0～5 min，10%B；5～10 min，10%B→90%B；10～25 min，90%B→98%B；25～30 min，98%B→10%B；30～40 min，10%B）；流速為 0.3 mL/min；柱溫為40 ℃；進樣量為10 μL。質譜條件如下：使用電噴霧離子源，在正離子模式下進行全掃描檢測，掃描范圍m/z50～1 000；渦旋噴霧溫度為550 ℃；噴霧電壓為80 eV；信息關聯數據采集模式下，碰撞能量為（30±15）eV；噴霧氣體1的壓力為50 psi；加熱升溫氣體2的壓力為50 psi；窗口氣體的壓力為30 psi；噴霧電壓為5 500 eV；TOF-MS和TOF-MS/MS的累積時間分別為250、80 ms。

2.2 天智顆粒提取液的制備

精密稱定天智顆粒7.5 g，加入50%甲醇50 mL溶解，超聲（功率120 W，頻率40 kHz）處理30 min，以12 000 r/min離心10 min，將上清液經0.22 μm濾過，取10.0 μL濾液進行UPLC-Q-TOF-MS/MS分析，鑒定其化學成分。

2.3 動物實驗

將大鼠隨機分為對照組和給藥組，每組5只。給藥組大鼠灌胃天智顆粒水溶液（1.5 mg/g），對照組大鼠灌胃等體積生理鹽水，每日2次，給藥間隔8 h，連續給藥7 d。末次給藥1 h后，腹腔注射戊巴比妥（0.001 5 mL/g）麻醉大鼠，于腹主動脈采集血樣，以3 000 r/min離心30 min，取上層血清保存在-80 ℃冰箱中。

2.4 血清樣本的處理與分析

為避免個體差異帶來的影響，將對照組和給藥組大鼠的血清分別進行組內等量混合。分別取兩組的等量混合血清各0.3 mL，加入乙腈1.5 mL，渦旋5 min除去蛋白質，于4 ℃下以12 000 r/min離心10 min，取上清液在30 ℃下真空旋轉蒸發干燥。將干燥后的殘留物用75%乙腈100 μL溶解，濾過。將所得溶液儲存于4 ℃冰箱中，用于UPLC-Q-TOF-MS/MS分析，鑒定其入血成分。

2.5 實驗數據處理過程

使用MS-DIAL4.60工作站采集數據，通過查閱與天麻、鉤藤、杜仲等中草藥相關的文獻和SciFinder（https：//scifinder.cas.org）、PubChem（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）、MassBank（https：//mona.fiehnlab.ucdavis.edu/）、TCMSP（https：//old.tcmsp-e.com/tcmsp.php）、TCMID（http//www.megabionet.org/tcmid/）、TCM-ID（http//bidd.nus.edu.sg/group/TCMsite/default.aspx）、TCM Database@Taiwan（http//tcm.cmu.edu.tw/）等數據庫對化合物的名稱、分子量、物質數字識別號碼（CAS號）、結構類型等信息進行整理。將收集所得化合物的精確分子量與理論分子量進行對比，并將分子質量誤差在±10×10-6以內的化合物作為推測的可能化合物。分析可能化合物的質譜信息，并進行歸類；推測其裂解過程，并對主要的離子碎片進行歸屬。通過對比空白血清（取自對照組大鼠）、給藥血清（取自給藥組大鼠）和天智顆粒提取液的總離子流圖以及主要離子碎片等相關信息對入血成分進行分析。

3 結果

3.1 化學成分分析

天智顆粒提取液在正離子模式下的總離子流圖見圖1，主要選擇的正離子模式的離子為[M+H-H2O]+、[M+H]+、[M+Na]+、[M+NH4]+、[M+K]+。共鑒定出100個化合物，包括46個黃酮類、8個有機酸類、8個生物堿類、6個萜類、6個香豆素類、2個醌類、1個甾體類、7個糖苷類和16個其他類。除28個常見化合物（比如蔗糖、松三糖等常見糖苷類化合物，腺嘌呤、環磷酸鳥苷、維生素B2等中藥材中常見化合物）以外，其余72個化合物的質譜信息及來源見表1。

圖1 天智顆粒提取液在正離子模式下的總離子流圖

表1 天智顆粒的化合物質譜信息及來源

續表1

3.1.1 黃酮類化合物 本研究共鑒定出46個黃酮類化合物，該類化合物主要以[M+H]+準分子離子峰形式存在，常丟失中性CO、H2O、CH3等碎片，有時也發生逆狄爾斯-阿德爾反應裂解形成碎片離子，黃酮苷則常丟失糖基形成[M+H-Glc]+的特征性碎片離子。以13號化合物為例，其準分子離子峰為m/z625.179 6 [M+H]+，推測其分子式為C28H32O16。其脫去1分子Rha和1分子Glc，得到m/z317.107 8 [M+H-Rha-Glc]+的碎片離子，再脫去CH3生成m/z302.083 3 [M+H-Rha-Glc-CH3]+的碎片離子，或失去1個CH2得到m/z303.057 2 [M+HRha-Glc-CH2]+的碎片離子。與相關文獻[11]比對，推測其為水仙苷。其裂解過程見圖2。

圖2 水仙苷在正離子模式下可能的裂解過程

3.1.2 有機酸類化合物 本研究共鑒定出8個有機酸類化合物，該類化合物主要以[M+H]+準分子離子峰形式存在。以62號化合物為例，其準分子離子峰為m/z355.101 7[M+H]+，推測其分子式為C16H18O9。其失去1個奎寧酰基形成m/z163.062 6[M+H-C7H12O6]+的碎片離子，然后再丟失1分子H2O形成m/z145.046 8 [M+HC7H12O6-H2O]+的碎片離子；另外，該碎片離子還能丟失1分子CO形成m/z135.061 8[M+H-C7H12O6-CO]+的碎片離子，然后再失去1分子H2O形成m/z117.047 9[M+H-C7H12O6-CO-H2O]+的碎片離子。與相關文獻[14]對比，推斷其為綠原酸（裂解圖略）。

3.1.3 生物堿類化合物 本研究共鑒定出8個生物堿類化合物。以43號化合物為例，其準分子離子峰為m/z369.180 8[M+H]+，推測其分子式C21H24N2O4。其主要質譜碎片離子為m/z351.221 9、267.185 5、160.098 5，分別對應[M+H-H2O]+、[M+H-H2O-C4H4O2]+、[M+HH2O-C4H4O2-C7H9N]+碎片離子。與相關文獻[22]對比，推測其為帽柱葉堿。其裂解過程見圖3。

圖3 帽柱葉堿在正離子模式下可能的裂解過程

3.1.4 萜類化合物 本研究共鑒定出6個萜類化合物。以51號化合物為例，其準分子離子峰為m/z397.113 8[M+Na]+，通過MS-DIAL4.60工作站進行分析推測其分子式為C16H22O10。其主要質譜碎片離子為m/z235.094 4、217.082 4、189.082 9、104.084 7，分別對應[M+Na-C6H10O5]+、[M+Na-C6H10O5-H2O]+、[M+Na-C6H10O5-H2O-CO]+、[M+Na-C6H10O5-H2O-CO-C3HO3]+碎片離子。與相關文獻[7]和數據庫對比，推測其為京尼平苷酸（裂解圖略）。

3.1.5 香豆素類化合物 本研究共鑒定出6個香豆素類化合物，該類化合物裂解過程主要丟失-CH3、H2O、CO等中性基團而產生碎片離子。以57號化合物為例，其準分子離子峰為m/z163.038 9 [M+H]+，失去1分子H2O得到m/z145.048 5[M+H-H2O]+的碎片離子，或丟失1分子CO而形成m/z135.063 4[M+H-CO]+的碎片離子，再失去1分子H2O得到m/z117.051 0[M+H-CO-H2O]+的碎片離子。與相關文獻[8]和數據庫對比，推斷其為7-羥基香豆素（裂解圖略）。

3.1.6 其他類化合物 在上述化合物的基礎上，本研究還鑒定出2個醌類、1個甾體類、8個有機酸類、7個糖苷類、16個其他類化合物。分析鑒定方法同上述黃酮類、生物堿類等5類化合物的鑒定過程，不再一一列舉。

3.2 入血成分分析

本研究共鑒定出10個原型入血成分，分別為1-茚醇、2-羥基喹啉、7-羥基香豆素、金雀異黃酮、千層紙素A、異柯楠堿、白楊素-7-O-β葡萄糖醛酸苷、芹菜素-7-O-葡萄糖醛酸苷、漢黃芩苷、6-O-甲基黃芩苷。以19號和44號化合物為例，19號化合物的準分子離子峰為m/z461.109 1[M+H]+，推測其分子式為C22H20O11，其相繼脫去1分子糖苷和1分子CH3形成m/z285.118 3[M+HC6H8O6]+和m/z270.092 0[M+H-C6H8O6-CH3]+的碎片離子，與相關文獻[16]對比，推測其為漢黃芩苷；44號化合物的準分子離子峰為m/z355.202 6[M+H]+，其相繼脫去1 分子 CHO、C9H6、C4H6N，分別對應m/z326.218 0、212.159 7、144.099 1，分別對應[M+H-CHO]+、[M+HCHO-C9H6]+、[M+H-CHO-C9H6-C4H6N]+的碎片離子，與數據庫信息對比，推測其為異柯楠堿。

4 討論

目前，中藥化學成分分析是研究中藥藥效物質基礎的重點和難點。本研究采用UPLC-Q-TOF-MS/MS技術對天智顆粒化學成分和入血成分進行定性分析。結果顯示，共鑒定出化學成分100個。基于此，在大鼠血清中共鑒定出10個原型入血成分，其中金雀異黃酮、千層紙素A、白楊素-7-O-β葡萄糖醛酸苷、芹菜素-7-O-葡萄糖醛酸苷、漢黃芩苷、6-O-甲基黃芩苷為黃酮類，2-羥基喹啉和異柯楠堿為生物堿類，7-羥基香豆素為香豆素類，1-茚醇為其他類。已有研究表明，黃酮類成分具有抗炎、鎮痛、鎮靜以及保肝等藥理活性，且能夠通過顯著上調腦源性神經營養因子的表達來發揮抗抑郁活性[30]；生物堿類成分具有清熱平肝、息風定驚之功效，對中樞神經系統具有鎮靜、催眠等作用[31]；香豆素類成分具有抗病毒、抗炎、抗腫瘤等藥理活性[27]。基于此，推測2-羥基喹啉、7-羥基香豆素、金雀異黃酮、千層紙素A、異柯楠堿、白楊素-7-O-β葡萄糖醛酸苷、芹菜素-7-O-葡萄糖醛酸苷、漢黃芩苷、6-O-甲基黃芩苷可能是天智顆粒的藥效物質。另外，受藥物在大鼠體內吸收和代謝的影響，本研究在大鼠血清中檢測到的原型入血成分較少，推測可能是由于藥物在進入血液后快速代謝而生成其他物質所致。因此，關于天智顆粒的藥效物質還需要進一步挖掘相關數據。