基于腸腦軸探討地黃飲子對APP/PS1轉基因陽性小鼠神經功能的改善作用及機制Δ

陳靖，梁喜才，王健，王生化，寧天一（1.遼寧中醫藥大學教學實驗中心，沈陽 110847；.遼寧中醫藥大學實驗動物中心，沈陽 110847）

阿爾茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）是一種神經系統退行性疾病，患者發病多隱匿，且其癥狀可隨年齡增長而不斷加重，臨床上以記憶認知障礙、情緒多疑、性格古怪、行為異常、智力下降等表現為主要特征，但具體病因未知[1]。據世界衛生組織估計，到2050年全球老年癡呆癥患者數將突破1.5億，其中AD患者約占2/3[2]。隨著社會節奏的加快和人口老齡化的不斷加劇，AD患者比例不斷增高，給患者家庭和社會帶來了沉重負擔[3]。

本課題組前期研究發現，抑郁癥可能是重要的AD致病危險因素，并且抑郁癥狀在AD臨床診斷之前就已出現[4]。中醫理論認為，在補腎填精的基礎上，調暢氣機有助于AD的防治[5]。地黃飲子出自金元四大家之一劉完素的《宣明論方》，以溫補下元為主，攝納浮陽并佐以開竅化痰[6]。該方用熟地黃、山萸肉滋補腎陰，肉蓯蓉、巴戟天溫補腎陽；配合附子和肉桂的辛熱，助滋養下元、吸收浮陽、引火歸原；石斛、麥冬和五味子潤肺補腎，金水相生，滋水以降火；石菖蒲與遠志、茯苓開竅化痰；再以姜棗調和諸藥，共奏填精補髓、化濁開竅之功效[7]。地黃飲子是近年來臨床中醫輔助治療AD的經典方，可顯著改善AD患者的認知、學習和記憶能力，具有良好的臨床療效[7]。有研究證實，腸道菌群可通過腸腦軸這一途徑調節大腦功能，調控神經遞質或代謝產物生成，促進大腦神經細胞凋亡，從而發揮神經保護作用，與AD的發生發展密切相關[8]。基于此，本研究擬基于腸腦軸，從腸道菌群、細胞凋亡、神經保護的角度開展相關實驗，旨在為進一步闡釋該方治療AD的潛在機制提供實驗依據。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器包括WMT-100S型Morris水迷宮視頻分析系統（成都泰盟軟件有限公司），BX-50型光學顯微鏡（日本Olympus公司），801型形態學圖像分析系統（南京捷達實驗設備有限公司），164-5050型電泳儀、Trans-Blot Turbo型全能型蛋白快速轉膜儀（美國Bio-Rad公司），Tanon 5200型全自動化學發光圖像分析系統（上海天能科技有限公司），Miseq PE300型高通量測序平臺（美國Illumina公司）等。

1.2 主要藥品與試劑

地黃飲子組方為熟地黃30 g，姜棗3 g，巴戟天、山萸肉、石斛、肉蓯蓉、炮附子、茯苓、石菖蒲、遠志、肉桂、麥冬、五味子各10 g。上述各中藥飲片（產地為安徽）均購自國藥控股國大藥房有限公司，由遼寧中醫藥大學藥學院張建逵教授鑒定均為真品。

鹽酸多奈哌齊片（批號139210401，規格5 mg）購自衛材（中國）藥業有限公司；兔源Bcl-2抗體（批號BA0412）、鼠源Bax抗體（批號A00183）、兔源腦源性神經營養因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）抗體（批號PB9075）均購自武漢博士德生物工程有限公司；辣根過氧化物酶（HRP）標記的山羊抗兔IgG二抗（批號7074P2）購自美國CST公司；BCA法蛋白測定試劑盒（批號K20316）購自北京全式金生物技術股份有限公司；腸道菌群測定所用Agencourt AMPure XP核酸純化試劑盒（批號A63880）購自美國Beckman Coulter公司；其余試劑均為分析純，水為純凈水。

1.3 實驗動物

SPF級APP/PS1轉基因陽性（簡稱“APP轉基因”）及APP/PS1轉基因陰性（簡稱“APP野生型”）雄性小鼠，5月齡，體質量為20～25 g，購自斯貝福（北京）生物技術有限公司，實驗動物生產許可證號為SCXK（京）2019-0010。所有小鼠均飼養于溫濕度適中的隔離系統內，予清潔SPF級飼料喂養，自由攝食、飲水。本研究方案通過遼寧中醫藥大學實驗動物倫理委員會審核，批準號為21000042021116。

2 方法

2.1 藥液的制備

按“1.2”項下處方量稱取地黃飲子各飲片，加適量水煎煮，以大火煮沸后，再以文火煎煮約20 min，濾過；藥渣再次同法煎煮，濾過；合并兩次濾液，于室溫下濃縮成質量濃度為1 g/mL（以生藥量計，下同）的中劑量灌胃藥液；用水稀釋制成質量濃度為0.5 g/mL的低劑量灌胃藥液，或進一步濃縮成2 g/mL的高劑量灌胃藥液，備用。

取鹽酸多奈哌齊片，粉碎，以水為溶劑，先制成質量濃度為1 mg/mL的藥液（以主藥計，下同），再用水稀釋，得質量濃度為0.03 mg/mL的灌胃藥液，備用。

2.2 分組、造模與給藥

取APP轉基因小鼠30只，隨機分成APP/PS1陽性模型組、地黃飲子高劑量組、地黃飲子中劑量組、地黃飲子低劑量組、西藥組，每組6只；另取APP野生型小鼠6只，設為APP/PS1陰性正常組。適應性喂養1周后，地黃飲子高、中、低劑量組小鼠分別灌胃地黃飲子48、24、12 g/kg（取“2.1”項下0.5、1、2 g/mL地黃飲子藥液，灌胃體積約為0.72 mL），西藥組小鼠灌胃鹽酸多奈哌齊0.8 mg/kg（取“2.1”項下鹽酸多奈哌齊藥液，灌胃體積約為0.72 mL），APP/PS1陽性模型組和APP/PS1陰性正常組小鼠灌胃同體積生理鹽水，每天1次，連續28 d。各藥物組劑量設置依據如下：地黃飲子按70 kg成人單日臨床劑量143 g（以生藥量計），參照《動物實驗方法學》以人與小鼠體表面積比換算得小鼠等效劑量為24 g/kg，以此作為中劑量，其2倍作為高劑量，其1/2作為低劑量；鹽酸多奈哌齊按70 kg成人單日臨床劑量5 mg，參照《動物實驗方法學》以人與小鼠體表面積比換算得小鼠等效劑量為0.8 mg/kg，以此作為給藥劑量。

2.3 Morris水迷宮實驗

末次給藥后，所有小鼠進行Morris水迷宮實驗。前4天為定位航行實驗：在第3象限中心放置逃生平臺（液面高出平臺2 cm），將小鼠面對池壁，分別從4個不同的起始點（不同象限）放入水中，引導其在90 s內找到平臺并停留10 s，記錄其找到平臺所用時間，作為逃避潛伏期；若小鼠在90 s內未能找到平臺，則將其逃逸潛伏期記為90 s。最后1天進行空間探索實驗：移去平臺，將小鼠從第3象限對面的入水點放入水中，記錄其穿過原平臺所在位置的次數。

2.4 腸道菌群測定

檢測APP/PS1陽性模型組、APP/PS1陰性正常組、地黃飲子中劑量組和西藥組小鼠的腸道菌群。給藥結束后，上述組所有小鼠禁食12 h，采用強制法（即輕輕擠壓尾根和直腸末端），將要排出的糞便收集在無菌EP管中，于-80 ℃冷凍。用基因組提取試劑盒從小鼠糞便中提取DNA，并擴增細菌16Sr RNA的V3+V4區[引物338F（5＇-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3＇）和 806R（5＇-GGACTACNNGGGTATCTAAT-3＇）]。取所得 PCR擴增產物，構建微生物多樣性測序文庫，采用高通量測序平臺進行可變區檢測，根據標簽進行物種分類、操作分類單位（operational taxonomic units，OTU）分析、多樣性分析、樣品群落組成分析（維恩圖）、細菌屬分類水平和組間群落差異（LDA effect size，LEfSe）分析。上述實驗委托北京奧維森基因科技有限公司完成。

2.5 海馬組織CA1區神經細胞病理改變的觀察

上述實驗結束后，以頸椎脫臼法處死小鼠，取海馬組織，置于4%多聚甲醛溶液中固定24 h，經常規包埋、切片、脫蠟后，行蘇木精-伊紅（HE）染色，再經梯度脫水、二甲苯透明，用中性樹膠封片，置于光學顯微鏡下觀察其海馬組織CA1區神經細胞的病理改變，并使用形態學圖像分析系統采集圖像。

2.6 海馬組織中Bcl-2、Bax蛋白表達檢測

采用免疫組化法進行檢測。取“2.5”項下石蠟切片，脫蠟后用水浸洗，消除內源性過氧化物酶活性并抗原修復后，滴加Bcl-2、Bax一抗（稀釋比例均為1∶100）和HRP標記的IgG二抗（稀釋比例為1∶300）。經DAB顯色劑顯色、蘇木精復染、脫水透明后，用中性樹脂封片，置于光學顯微鏡下觀察（細胞質為棕色或深棕色的為相應蛋白表達陽性細胞）。于高倍鏡下隨機選取5個視野，采用Image Pro Plus 6.0軟件對Bax、Bcl-2蛋白的表達進行定量分析，以平均光密度值作為結果。

2.7 海馬組織中BDNF蛋白表達的檢測

采用Western blot法進行檢測。取各組小鼠海馬組織適量，剪碎后加入裂解液，放入勻漿器充分裂解，于4 ℃下以12 000 r/min離心10 min，取上清液，采用BCA法測定蛋白濃度后加入上樣緩沖液，取總蛋白50 μg，金屬浴中加熱8 min，使蛋白充分變性。取變性蛋白，經12%SDS-PAGE分離后轉至硝酸纖維素膜上。以5%脫脂牛奶在室溫下封閉1 h，加入BDNF、β-actin一抗（稀釋比例分別為1∶500、1∶1 000），4 ℃孵育過夜；用TBST緩沖液洗膜洗滌5 min×3次，加入相應二抗（稀釋比例為1∶1 000），室溫孵育1 h；同法洗膜后，使用形態學圖像分析系統進行掃描顯影，采用Image J 5.0軟件計算條帶灰度值，并以目標蛋白與內參蛋白（β-actin）的灰度值比值作為目標蛋白的表達水平。

2.8 統計學方法

采用SPSS 23.0軟件對數據進行統計分析。數據以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t法檢驗。檢驗水準α=0.05。

3 結果

3.1 小鼠Morris水迷宮實驗結果

定位航行實驗結果顯示，早期各組小鼠的逃逸潛伏期比較，差異均無統計學意義（P＞0.05），但總體呈逐漸下降趨勢（結果略）。第4天（表1），APP/PS1陽性模型組小鼠的逃避潛伏期顯著長于APP/PS1陰性正常組（P＜0.05），提示APP轉基因小鼠存在空間學習障礙；與APP/PS1陽性模型組比較，地黃飲子中、高劑量組和西藥組小鼠的逃避潛伏期均顯著縮短（P＜0.05）。

表1 各組小鼠水迷宮實驗結果（±s，n＝6）

表1 各組小鼠水迷宮實驗結果（±s，n＝6）

a：與APP/PS1陰性正常組比較，P＜0.05；b：與APP/PS1陽性模型組比較，P＜0.05

穿過原平臺次數組別 逃避潛伏期/s 5.34±2.32 1.45±1.31a 2.46±1.73 4.12±5.01b 4.29±2.86b 4.07±1.51b APP/PS1陰性正常組APP/PS1陽性模型組地黃飲子低劑量組地黃飲子中劑量組地黃飲子高劑量組西藥組25.26±7.02 50.31±9.05a 42.49±7.86 39.48±3.25b 38.13±3.11b 39.24±9.56b

空間探索實驗結果（表1）顯示，APP/PS1陽性模型組小鼠穿過原平臺次數顯著少于APP/PS1陰性正常組（P＜0.05），表明APP轉基因小鼠的記憶能力明顯下降；與APP/PS1陽性模型組比較，各藥物組小鼠穿過原平臺次數均有不同程度的提高，其中地黃飲子中、高劑量組和西藥組小鼠該指標顯著高于與APP/PS1陽性模型組（P＜0.05）。

3.2 小鼠腸道菌群檢測結果

3.2.1 腸道菌群α多樣性分析 微生物群落的豐富度和多樣性可通過多樣性分析（α多樣性）來反映，其中Chao1是用于估計群落中OTU數量的物種豐富度指數，Shannon則可用來評估樣品中微生物的多樣性[9]。由Chaos1指數檢測結果（圖1A）可知，APP/PS1陽性模型組的OTU數量顯著高于其余組，地黃飲子中劑量組的OTU數量顯著低于其余組（P＜0.05）。由Shannon指數檢測結果（圖1B）可知，地黃飲子中劑量組的多樣性顯著高于APP/PS1陽性模型組和西藥組（P＜0.05），可推測中劑量的地黃飲子可降低APP轉基因小鼠的某些優勢菌種的數量，但可提高菌種的多樣性。

圖1 各組小鼠腸道菌群的α多樣性分析結果

3.2.2 樣品群落組成分析 韋恩圖中各組的交叉橢圓環可反映各樣本之間共同存在和單獨存在的OTU數量。由圖2可知，4組之間共有的OTU為686個，占絕大多數。APP/PS1陽性模型組的OTU為892個，APP/PS1陰性正常組為854個，地黃飲子中劑量組為898個，西藥組為877個。APP/PS1陰性正常組獨有的OTU最多，為16個；APP/PS1陽性模型組獨有13個，地黃飲子中劑量組和西藥組分別獨有9個和5個；僅地黃飲子中劑量組與APP/PS1陰性正常組共有的OTU數量為11個，多于僅西藥組與APP/PS1陰性正常組共有的OTU（9個）。這說明中劑量的地黃飲子和鹽酸多奈哌齊均能降低APP轉基因小鼠的微生物菌群OTU豐度，但這兩組的OTU豐度仍高于APP/PS1陰性正常組。

圖2 各組小鼠腸道微生物OTU豐度的維恩圖

3.2.3 細菌屬分類水平的比較 在屬水平（圖3）上，APP/PS1陰性正常組小鼠糞便菌群的主要菌屬是厚壁菌門中的g_Lachnospiraceae_NK4A136_group（13.8%）和杜氏桿菌屬g_Dubosiella（2.6%）；相較于APP/PS1陽性模型組的g_Lachnospiraceae_NK4A136_group（7.1%）和西藥組g_Dubosiella（1.4%），地黃飲子中劑量組這兩種菌屬的豐度顯著提高，分別為11.8%和3.4%。相對于地黃飲子中劑量組（0.1%），西藥組疣微菌門阿克曼氏菌屬g_Akkermansia菌屬的豐度明顯提高（2.7%）。相較于APP/PS1陽性模型組（11.1%），地黃飲子中劑量組和西藥組普雷沃氏菌屬g_Prevotellaceae_UCG-001的豐度（分別為4.7%和5.9%）均降低。

圖3 各組小鼠細菌屬分類水平的菌種豐度熱圖

3.2.4 腸道菌群LEfSe分析 LEfSe分析可實現多個組別的比較，還能進行亞組分析，從而找到在組間豐度上存在顯著差異的物種[8]。由各組LEfSe分析結果（圖4）可知，APP/PS1陰性正常組的優勢菌種是f_Clos-tridium_methylpentosum_group，地黃飲子中劑量組的優勢菌種是梭菌綱o_Clostridia_vadinBB60_group、疣微菌g_UCG_005，西藥組的s_Bacteroides_acidifaciens_JCM_10556則是豐度差異高的菌種。

圖4 各組小鼠腸道菌群LEfSe分析圖

3.3 小鼠海馬組織中神經細胞HE染色結果

HE染色結果（圖5）顯示，APP/PS1陰性正常組小鼠海馬組織CA1區神經細胞排列整齊，核染較為均勻，邊界層次分明，結構清晰，神經細胞排列緊密。APP/PS1陽性模型組小鼠海馬組織CA1區神經細胞數量減少、分布不均勻，排列稀疏，細胞質不豐富；地黃飲子中、高劑量組和西藥組小鼠海馬組織CA1區神經細胞核排列較緊密，細胞形態有不同程度的改善，神經細胞數量較多且結構較為完整。

圖5 各組小鼠海馬HE染色觀察顯微圖

3.4 小鼠海馬組織中Bcl-2和Bax蛋白的表達水平

與APP/PS1陰性正常組比較，APP/PS1陽性模型組小鼠海馬組織中Bcl-2蛋白顯著下調，Bax蛋白顯著上調（P＜0.05）；與APP/PS1陽性模型組比較，地黃飲子中、高劑量組和西藥組小鼠海馬組織中Bcl-2蛋白顯著上調，Bax蛋白顯著下調（P＜0.05），而地黃飲子低劑量組上述蛋白表達水平差異均無統計學意義（P＞0.05），詳見表2。免疫組化染色結果顯示，Bcl-2和Bax蛋白陽性表達均呈棕黃色，主要位于胞漿與胞膜，詳見圖6、圖7。

表2 各組小鼠Bcl-2和Bax平均光密度值比較（±s，n＝6）

表2 各組小鼠Bcl-2和Bax平均光密度值比較（±s，n＝6）

a：與APP/PS1陰性正常組比較，P＜0.05；b：與APP/PS1陽性模型組比較：P＜0.05

Bax 0.221 6±0.030 9 0.283 2±0.053 4a 0.271 4±0.097 9 0.183 5±0.035 7b 0.169 9±0.040 4b 0.208 6±0.025 9b組別APP/PS1陰性正常組APP/PS1陽性模型組地黃飲子低劑量組地黃飲子中劑量組地黃飲子高劑量組西藥組Bcl-2 0.133 7±0.053 5 0.111 7±0.049 1a 0.128 5±0.040 6 0.235 4±0.075 8b 0.260 2±0.057 9b 0.224 2±0.053 6b

圖6 各組小鼠海馬區Bcl-2蛋白表達

圖7 各組小鼠海馬區Bax蛋白表達

3.5 小鼠海馬組織中BDNF的表達水平

與APP/PS1陰性正常組比較，APP/PS1陽性模型組小鼠海馬組織BDNF的表達水平顯著降低（P＜0.05）；與APP/PS1陽性模型組比較，地黃飲子中、高劑量組和西藥組小鼠BDNF的表達水平均顯著升高（P＜0.05），地黃飲子低劑量組該蛋白表達水平差異無統計學意義（P＞0.05），詳見圖8。

圖8 各組小鼠海馬區BDNF表達水平比較

4 討論

AD的發病機制尚不十分清楚，主要涉及以下理論：膽堿能理論、tau蛋白假說、神經血管理論、氧化應激理論和β淀粉樣蛋白瀑布理論等[10]。目前，臨床尚無有效治療AD的方法，其中西醫所用藥物（如多奈哌齊和尼莫地平）通常與神經遞質和腦血管擴張有關，上述藥物的臨床療效有限，且有引發心血管反應（心動過緩、暈厥）、頭痛、頭暈、失眠和消化道反應等不良反應的可能[11]。

近年有報道指出，AD的發生與腸道菌群的改變有關，腸道微生物與中樞神經系統相互作用的假說也成為AD的可能發病機制之一[8]。腸腦軸（腸道微生物群-腦軸）是連接消化道和中樞神經系統的重要生化信號，可影響從大腦發育到神經系統疾病進展的所有相關事件[8]。腸腦軸在AD的發病機制中起關鍵作用，腸道微生物群可通過神經、內分泌和免疫途徑與中樞神經系統溝通，從而影響大腦的功能和行為[12]；同時，腸道菌群失調可能導致腦內神經因子的異常表達，從而加重腦內神經細胞的損傷（如導致海馬神經細胞凋亡）[13]。

本研究首先通過Morris水迷宮采集小鼠行為學數據，并用以評估小鼠的空間學習、記憶認知水平。結果顯示，APP/PS1陽性模型組小鼠的逃避潛伏期顯著延長，穿過原平臺次數顯著減少，表明APP/PS1陽性模型小鼠的學習記憶能力下降；經地黃飲子干預后，小鼠的逃避潛伏期顯著縮短，穿過原平臺次數顯著增加，以中、高劑量組效果為優，提示地黃飲子可改善APP/PS1陽性模型小鼠的學習記憶能力。

本研究的腸道菌群檢測結果顯示，地黃飲子更傾向于提升菌群的多樣性，尤其是厚壁菌門的菌種；其優勢菌種的比例更接近于APP/PS1陰性正常組；LEfSe分析結果顯示，地黃飲子中劑量組的優勢菌種是梭菌綱o_Clostridia_vadinBB60_group，疣微菌g_UCG_005，也進一步證實了地黃飲子有助于提高厚壁菌門、芽孢桿菌屬、乳桿菌屬、毛螺旋菌屬等菌種的多樣性。有研究指出，上述微生物可有助于改善AD患者的認知癥狀[14]。例如，上述微生物可發酵膳食纖維，代謝生成以乙酸鹽、丙酸鹽、丁酸鹽為主的短鏈脂肪酸（short-chain fatty acid，SCFA）。丁酸鹽具有神經保護作用和血腦屏障恢復功能，可顯著改善學習和記憶能力，具有明顯的改善認知和緩解抑郁的作用[15]；同時，丁酸鹽可防治腸毒素進入大腦，具有一定的抗炎作用[16]。該SCFA已被證實與疣微菌g_UCG_005有關，而疣微菌門微生物可通過參與調節免疫反應和維持體內代謝平衡來影響宿主的健康[9]。此外，丙酸鹽可通過產生多巴胺和5-羥色胺來調節情緒，在減輕精神壓力和改善抑郁方面具有重要作用[15]。有研究發現，一些乳酸桿菌和雙歧桿菌可抑制β淀粉樣蛋白，可通過增加海馬和大腦皮層中BDNF等神經營養因子的表達來提高小鼠的學習和記憶能力[17]。乙酰膽堿是中樞神經系統中一種重要的神經遞質，通常在AD患者的大腦中減少，而芽孢桿菌可產生乙酰膽堿，并通過迷走神經來協助膽堿信號的傳遞[18]。

海馬組織CA1區神經細胞HE染色結果顯示，中、高劑量地黃飲子能有效改善海馬神經細胞的病理改變，恢復細胞排列的緊密度，避免負責學習記憶功能的海馬組織受到損傷。Bcl-2家族中2個重要成員Bcl-2和Bax是細胞凋亡調控系統的重要組成，Bcl-2蛋白可通過穩定細胞線粒體膜來抑制細胞凋亡[19]；Bax蛋白則可進入細胞線粒體膜，誘導細胞凋亡[20]。當Bcl-2表達增加時，其可與Bax形成異源二聚體，從而減弱Bax的促凋亡作用，減少細胞凋亡[21]。本研究結果顯示，中、高劑量的地黃飲子能顯著上調小鼠海馬組織中Bcl-2的表達，下調Bax的表達，提示地黃飲子可通過抑制中樞神經元凋亡來發揮對大腦神經元的保護作用。

BDNF作為腦源性神經營養因子，對神經元發育、分化和突觸可塑性等具有維持、促進的作用，其編碼基因在海馬組織中的表達受神經元與神經遞質相互作用的影響[22]。有研究證實，AD患者腦組織和血清中BDNF水平明顯降低，腸道菌群可通過調節BDNF的水平來影響宿主的認知功能，從而誘發AD[23]；此外，BDNF的分泌減少也常伴有海馬組織中大量神經細胞的凋亡[24]。本研究結果證實，中、高劑量的地黃飲子可有效提高APP/PS1陽性模型小鼠海馬組織中BDNF水平。

綜上所述，地黃飲子可增加腸道菌群的多樣性，改變優勢菌種，并能抑制大腦海馬神經細胞凋亡，提高BDNF水平；其作用機制可能是借助腸腦軸來保護神經細胞，從而提高APP/PS1陽性模型小鼠的學習和認知能力。