不同干燥加工方式的白芷飲片質(zhì)量評價Δ

朱興龍，陳曉妍，晏宇杭，吳清華，盧麗潔，黃旭龍，張佳旭，鄭全林，裴瑾（1.成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，成都 61117；.西南特色中藥資源國家重點實驗室，成都 61117；.遂寧天地網(wǎng)川白芷產(chǎn)業(yè)有限公司，四川 遂寧 69000）

白芷為傘形科植物白芷Angelica dahurica（Fisch.ex Hoffm.）Benth. et Hook. f.或 杭 白 芷A. dahurica（Fisch. ex Hoffm.）Benth. et Hook. f.var.formosana（Boiss.）Shan et Yuan的干燥根，具有解表散寒、祛風(fēng)止痛、宣通鼻竅等功效[1]。白芷主要含有香豆素、揮發(fā)油等成分，具有抗炎鎮(zhèn)痛、抗氧化及舒張血管等藥理作用[2-3]。現(xiàn)代白芷藥材加工方法以烘干蒸切法和鮮切干燥法為主[4-5]，其中鮮切干燥法是一種集干燥與切片于一體的加工方法，具有能耗低、效率快等優(yōu)點。干燥加工過程對藥材飲片性狀及成分影響顯著，但目前有關(guān)白芷飲片質(zhì)量的研究多為不同產(chǎn)地飲片質(zhì)量評價[6-7]，而關(guān)于干燥加工對白芷飲片質(zhì)量影響的研究較少。藥材性狀和成分之間存在顯著相關(guān)性，藥材性狀可在一定程度上反映其質(zhì)量[8-9]。因此，本研究參考相關(guān)文獻(xiàn)[10-12]，以傘形花內(nèi)酯等9種香豆素類成分含量為指標(biāo)，結(jié)合飲片粉末顏色，采用化學(xué)識別模式和灰度關(guān)聯(lián)分析評價白芷飲片的質(zhì)量，探討不同干燥加工方式的白芷飲片顏色與香豆素類成分含量的關(guān)聯(lián)性，旨在為白芷飲片質(zhì)量評價提供依據(jù)，也為白芷干燥加工機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器有Ulti Mate 3000型高效液相色譜儀（美國Thermo Fisher Scientific公司），KQ-600DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司），BP210S型十萬分之一分析天平、SQP型萬分之一電子天平[賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司]，YLS16A（pro）型烘干法水分測定儀（上海天美天平儀器有限公司），UPT-Ⅱ-20T型優(yōu)普系列超純水器（成都超純科技有限公司），D7500型單反相機(jī)[尼康映像儀器銷售（中國）有限公司]。

1.2 主要藥品與試劑

對照品傘形花內(nèi)酯（批號CHB201122）、白當(dāng)歸素（批號CHB210104）、補(bǔ)骨脂素（批號CHB201119）、花椒毒素（批號CHB201203）、佛手柑內(nèi)酯（批號CHB201127）、氧化前胡素（批號CHB210113）、歐前胡素（批號CHB210108）、珊瑚菜素（批號CHB210106）、異歐前胡素（批號CHB210110）均購自成都克洛瑪生物科技有限公司，純度均不低于98%；甲醇、乙腈、甲酸均為色譜純，其他試劑均為分析純，水為超純水。

32批白芷飲片（編號BZ-1～BZ-32）經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院裴瑾教授鑒定，BZ-5～BZ-6、BZ-12～BZ-32為杭白芷A.dahurica（Fisch. ex Hoffm.）Benth. et Hook. f.var.formosana（Boiss.）Shan et Yuan的干燥根，其余批次為白芷A. dahurica（Fisch. ex Hoffm.）Benth.et Hook. f.的干燥根。飲片具體來源信息見表1（半鮮切干燥為將新鮮藥材干燥至含水量為40%～50%時切制成片后，繼續(xù)干燥至含水量低于14%）。

表1 32批白芷飲片的來源信息

2 方法與結(jié)果

2.1 白芷飲片粉末顏色測定

隨機(jī)取白芷飲片，粉碎后過四號篩，裝入無色透明的圓形廣口玻璃容器中，在角度、背景（攝影白色卡紙作為背景）、光線（LED長條燈板作為光源）一致的情況下采集圖像，將圖像導(dǎo)入Adobe Photoshop 2020軟件，利用顏色取樣器對粉末色度值進(jìn)行提取[13]，每批樣品提取10次，計算平均值（表2）。結(jié)果顯示，32批白芷飲片的紅綠度（a）值為0～2.4，黃藍(lán)度（b）值為6.0～20.3，明度（L）值為35.6～51.1。半鮮切干燥飲片L值較高，b值較低，表明半鮮切干燥白芷飲片顏色較其他加工方式的白芷飲片更白、更亮；除BZ-8、BZ-16、BZ-17、BZ-22白芷飲片粉末L值偏低、b值偏高（肉眼觀察顏色呈暗黃色）外，其余烘干蒸切飲片和鮮切干燥飲片整體顏色差異不明顯。

表2 白芷飲片粉末的顏色色度值測定結(jié)果

2.2 9種香豆素類成分含量測定

2.2.1 對照品溶液制備 精密稱取傘形花內(nèi)酯、白當(dāng)歸素、補(bǔ)骨脂素、花椒毒素、佛手柑內(nèi)酯、氧化前胡素、歐前胡素、珊瑚菜素、異歐前胡素對照品適量，加50%乙醇溶解，制成上述各成分質(zhì)量濃度均為0.4 mg/mL的單一對照品儲備液。取各單一對照品儲備液適量，置于同一容量瓶中，加50%乙醇稀釋，制成上述各成分質(zhì)量濃度均為40 μg/mL的混合對照品溶液，于4 ℃儲藏，進(jìn)樣前經(jīng)0.22 μm微孔濾膜濾過。

2.2.2 供試品溶液制備 取本品干燥（含水量＜14%）粉末（過四號篩）0.5 g，精密稱定，置于50 mL具塞錐形瓶中，加50%乙醇25 mL，稱定質(zhì)量，超聲（功率500 W，頻率40 kHz）處理60 min；取出，冷卻至室溫，用50%乙醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，取上清液，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，作為供試品溶液。

2.2.3 色譜條件 以Agilent C18（4.6 mm×100 mm，1.8 μm）為色譜柱，以0.1%甲酸溶液（A）-乙腈（B）為流動相進(jìn)行梯度洗脫（0～10 min，10%B→25%B；10～30 min，25%B→50%B；30～50 min，50%B→65%B；50～55 min，65%B→10%B）；柱溫為30 ℃；流速為1.0 mL/min；檢測波長為245 nm；進(jìn)樣量為10 μL。

2.2.4 系統(tǒng)適用性試驗 取上述混合對照品溶液、供試品溶液（編號BZ-1）、空白溶液（50%乙醇），按“2.2.3”項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜圖（圖1，空白圖略）。結(jié)果顯示，理論板數(shù)按傘形花內(nèi)酯計均不低于5 000，各色譜峰與相鄰色譜峰的分離度均大于1.5，空白溶液對測定無干擾。

圖1 傘形花內(nèi)酯等成分混合對照品、供試品溶液的HPLC圖

2.2.5 線性關(guān)系考察 取“2.2.1”項下混合對照品溶液0.1、0.5、1、2、5、10 mL，分別置于10 mL容量瓶中，加50%乙醇定容，制成上述9個成分質(zhì)量濃度均為0.4、2、4、8、20、40 μg/mL的系列線性溶液，按“2.2.3”項下色譜條件進(jìn)樣，記錄峰面積。以各待測成分質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（x）、峰面積為縱坐標(biāo)（y）進(jìn)行線性回歸。結(jié)果見表3。

表3 傘形花內(nèi)酯等9種成分的回歸方程與線性范圍

2.2.6 精密度試驗 取“2.2.2”項下供試品溶液（編號BZ-1），按“2.2.3”項下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積。結(jié)果顯示，傘形花內(nèi)酯等9種成分峰面積的RSD均小于1%（n=6），表明方法精密度良好。

2.2.7 重復(fù)性試驗 精密稱取樣品（編號BZ-1）粉末，共6份，每份0.5 g，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.2.3”項下色譜條件進(jìn)樣，記錄峰面積并按標(biāo)準(zhǔn)曲線法計算樣品含量。結(jié)果顯示，傘形花內(nèi)酯等9種成分含量的RSD均小于1%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

2.2.8 穩(wěn)定性試驗 取“2.2.2”項下供試品溶液（編號BZ-1），分別于室溫（25 ℃）下放置0、3、6、9、12、24 h時，按“2.2.3”項下色譜條件進(jìn)樣，記錄峰面積。結(jié)果顯示，傘形花內(nèi)酯等9種成分峰面積的RSD均小于1%（n=6），表明供試品溶液在室溫下放置24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.9 加樣回收率試驗 精密稱取樣品（編號BZ-1）0.5 g，共6份，精密加入9種成分質(zhì)量濃度均為400 μg/mL的混合對照品溶液（按“2.2.1”項下方法操作）5 mL，再精密加入50%乙醇20 mL，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.2.3”項下色譜條件進(jìn)樣，記錄峰面積并計算加樣回收率。結(jié)果顯示，傘形花內(nèi)酯、白當(dāng)歸素、補(bǔ)骨脂素、花椒毒素、佛手柑內(nèi)酯、氧化前胡素、歐前胡素、珊瑚菜素、異歐前胡素的加樣回收率分別為100.8%、99.73%、99.55%、101.52%、102.85%、100.27%、101.40%、102.33%、100.75%（RSD均小于2%，n=6）。

2.2.10 樣品含量測定 取32批白芷飲片，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.2.3”項下色譜條件進(jìn)樣，記錄峰面積并按標(biāo)準(zhǔn)曲線法計算樣品含量，每批樣品測定3次。結(jié)果見表4。

表4 傘形花內(nèi)酯等9種成分的含量測定結(jié)果（n＝3，mg/g）

2.3 香豆素類成分的主成分分析

以傘形花內(nèi)酯等9種成分含量為指標(biāo)，采用SPSS 26.0軟件進(jìn)行主成分分析。結(jié)果顯示，前3個主成分的累計方差貢獻(xiàn)率為72.366%，表明前3個主成分可以客觀反映白芷飲片的質(zhì)量，故選擇前3個主成分對白芷飲片進(jìn)行評價。結(jié)果見表5、表6。

表5 主成分特征值及方差貢獻(xiàn)率

表6 9種香豆素成分在主成分中的貢獻(xiàn)值

以各主成分因子得分乘以主成分貢獻(xiàn)率來計算不同批次白芷飲片的綜合得分（F），F(xiàn)=0.357×f1+0.189×f2+0.145×f3，綜合得分越高，表示白芷飲片的質(zhì)量越好[14]。結(jié)果顯示，以BZ-9批飲片的得分最高，其次為BZ-8、BZ-32，半鮮切干燥（BZ-27～BZ-30）飲片的綜合得分排序靠前。結(jié)果見表7。

表7 32批白芷飲片的綜合得分及排序結(jié)果

2.4 香豆素類成分的偏最小二乘法-判別分析

以傘形花內(nèi)酯等9種成分含量為變量，采用SIMCA14.0軟件進(jìn)行偏最小二乘法-判別分析。結(jié)果顯示，模型的累積解釋能力參數(shù)（R2X、R2Y）分別為0.720、0.692，預(yù)測能力參數(shù)（Q2）為0.560，均大于0.5，表明模型具有較高的穩(wěn)定性和預(yù)測率；半鮮切干燥飲片聚為一類，烘干蒸切飲片與鮮切干燥飲片分離度較差。結(jié)果見圖2。

圖2 32批飲片的偏最小二乘法-判別分析模型得分圖

2.5 飲片顏色與香豆素類成分含量的灰色關(guān)聯(lián)度分析

將飲片色度值、傘形花內(nèi)酯等9種成分含量數(shù)據(jù)均一化處理后，分別設(shè)L、a、b值為母序列，計算其和傘形花內(nèi)酯等9種成分含量的關(guān)聯(lián)系數(shù)，關(guān)聯(lián)系數(shù)越接近于1，表示關(guān)聯(lián)度越強(qiáng)[15]。結(jié)果顯示，L、b值與佛手柑內(nèi)酯、氧化前胡素、歐前胡素、珊瑚菜素、異歐前胡素及b值與補(bǔ)骨脂素的關(guān)聯(lián)系數(shù)均大于0.8，而a值與傘形花內(nèi)酯等9種成分的關(guān)聯(lián)度較低。結(jié)果見表8。

表8 白芷飲片色度值與傘形花內(nèi)酯等9種成分的關(guān)聯(lián)系數(shù)分析結(jié)果

3 討論

3.1 香豆素類成分含量測定結(jié)果分析

本研究結(jié)果顯示，佛手柑內(nèi)酯、氧化前胡素、歐前胡素、珊瑚菜素、異歐前胡素含量較高，分別為0.256～1.115、1.434～6.014、1.866～4.039、0.742～1.455、0.789～2.642 mg/g，其中氧化前胡素是白芷飲片中含量較高的香豆素類成分，其含量波動范圍最大，在BZ-28批飲片中含量最高，為BZ-2批飲片的4.2倍，其中半鮮切干燥飲片的含量均較高；佛手柑內(nèi)酯的含量波動范圍亦較大，BZ-9批飲片含量為BZ-22批飲片的4.4倍；歐前胡素、異歐前胡素在白芷飲片中的含量僅次于氧化前胡素，兩者的含量波動范圍均較氧化前胡素小；珊瑚菜素含量波動范圍亦較氧化前胡素小，表明32批白芷飲片中香豆素類成分含量存在差異。

3.2 白芷飲片顏色與香豆素類成分含量的相關(guān)性結(jié)果分析

本研究結(jié)果顯示，白芷飲片成分含量和顏色之間關(guān)聯(lián)程度較高，L、b值與佛手柑內(nèi)酯、氧化前胡素、歐前胡素、珊瑚菜素、異歐前胡素及b值與補(bǔ)骨脂素的關(guān)聯(lián)系數(shù)均大于0.8。現(xiàn)代研究結(jié)果顯示，中藥材組織細(xì)胞在干燥加工過程中并未失去活性，干燥加工可以調(diào)節(jié)酶與微生物的活性，直接或間接催化某種化學(xué)轉(zhuǎn)化過程，改變藥材內(nèi)部顯色物質(zhì)、揮發(fā)油等成分的含量，從而影響藥材色澤、氣味等性狀，故干燥過程中加工方法及干燥溫度會影響飲片外觀及成分含量[16]。干燥溫度過高可使白芷飲片斷面顏色變暗，有效成分含量降低[17-18]，這也是本研究中同種加工方式所產(chǎn)飲片顏色及質(zhì)量差異顯著的主要原因，即干燥過程的操作不當(dāng)會影響白芷飲片質(zhì)量。

3.3 白芷飲片質(zhì)量評價及干燥加工建議

綜合評價結(jié)果顯示，32批白芷飲片中以BZ-8、BZ-9、BZ-32批飲片的綜合得分較高，半鮮切干燥飲片（BZ-27～BZ-30）的綜合得分排名均靠前。偏最小二乘法-判別分析結(jié)果顯示，半鮮切干燥飲片聚為一類，烘干蒸切飲片和鮮切干燥飲片分離度較差，結(jié)合飲片的色度值結(jié)果，提示半鮮切干燥飲片的綜合質(zhì)量高于其他兩種飲片，其顏色參數(shù)、成分含量波動范圍較小，質(zhì)量可控，且半鮮切干燥耗時較短，便于操作。此外，筆者建議在白芷飲片的實際生產(chǎn)過程中，在選擇適宜干燥方式后，應(yīng)注意干燥加工的溫度和時長，避免過度加工導(dǎo)致飲片品質(zhì)降低。

綜上所述，白芷飲片的外觀性狀與香豆素類成分含量具有較強(qiáng)關(guān)聯(lián)性，可通過顏色大致判斷飲片質(zhì)量，即顏色較白的飲片質(zhì)量較好；半鮮切干燥飲片質(zhì)量優(yōu)于烘干蒸切飲片和鮮切干燥飲片。