厚樸排氣合劑主要藥效成分在不同種屬動物血漿中蛋白結合率的比較Δ

郭明鑫，范文韜吳霞，沈穎胡志強（.江蘇大學附屬宜興醫院藥學部，江蘇 宜興 400；.廣東藥科大學新藥研發中心，廣州 50006）

厚樸排氣合劑由厚樸、枳實、木香、大黃組成，具有和中理氣、行氣消脹的功效，主要用于腹部非胃腸吻合術后早期腸麻痹的輔助治療[1]。目前，該合劑可用于恢復患者術后胃腸道功能和治療功能性便秘、腸麻痹等癥[2]。有研究指出，厚樸排氣合劑中厚樸酚含量最高，約占總成分含量的90%，和厚樸酚次之，同時還有少量的大黃素和大黃酚；其中，厚樸酚、和厚樸酚能促進腸道蠕動，是厚樸排氣合劑的主要藥效成分[3-4]。

血漿蛋白結合率會直接影響體內游離藥物的濃度，從而影響藥物的吸收、分布、代謝和消除，最終影響其藥效學特征[5-6]。考慮到厚樸排氣合劑單次給藥劑量較大、相關不良反應較多[7]，故有必要對其主要藥效成分的血漿蛋白結合率進行測定，以有助于研究該合劑的體內代謝過程，促進臨床合理用藥。基于此，本研究擬采用超高效液相色譜-串聯三重四極桿質譜（UPLC-MS/MS）技術結合平衡透析法測定厚樸排氣合劑主要藥效成分厚樸酚、和厚樸酚在牛、兔、大鼠血漿中的蛋白結合率并進行比較，旨在為闡明該合劑有效成分的血漿蛋白結合特性提供參考。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器包括API 5500型UPLC-MS/MS系統（美國AB Sciex公司）、BP210D型萬分之一電子天平（德國Sartorius公司）、20HR型高速冷凍離心機（科大創新股份有限公司）、ZH-2型渦旋振蕩儀（上海精勝科學儀器有限公司）、MG-2200型氮吹儀（上海愛郎儀器有限公司）等。

1.2 主要藥品與試劑

厚樸排氣合劑（批號20080601，每1 mL相當于飲片0.8 g）購自瑞陽制藥股份有限公司；厚樸酚對照品（批號110729-201910，純度99.0%）、和厚樸酚對照品（批號110730-201910，純度99.8%）均購自中國食品藥品檢定研究院；牛血漿（批號J28S10S99034）、兔血漿（批號J10O10S99437）、磷酸鹽 緩沖液（pH7.2～7.4，批號8121556）均購自上海源葉生物科技有限公司；大鼠血漿采自SPF級SD大鼠（雌雄各半）；透析袋（截留分子量1 kDa）購自廣州瑞舒生物科技有限公司；甲醇、乙腈、甲酸為質譜純，其余試劑均為分析純，水為純凈水。

2 方法與結果

2.1 溶液的制備

2.1.1 空白透析液 取磷酸鹽緩沖液，加水稀釋并定容至500 mL，作為空白透析液，于4 ℃下保存，備用。

2.1.2 含藥透析液 分別取厚樸排氣合劑適量，加至“2.1.1”項下空白透析液中，混勻，得質量濃度分別為4.5、9.0、13.5 μg/mL（按飲片質量計）的含藥透析液。

2.1.3 混合工作液和質控樣品 精密稱定厚樸酚、和厚樸酚對照品適量，置于10 mL容量瓶中，用甲醇定容，配制成混合對照品儲備液；精密量取上述混合對照品儲備液1.00、0.80、0.64、0.36、0.28、0.10、0.03 mL，分別置于10 mL容量瓶中，用甲醇定容，混勻，配制成厚樸酚質量 濃 度 分 別 為 11.38、22.76、45.52、91.04、136.56、182.08、227.60 μg/mL，和厚樸酚質量濃度分別為3.90、7.80、15.60、31.20、46.80、62.40、78.00 μg/mL的系列混合工作液。精密量取混合對照品儲備液適量，加入空白血漿，配制成厚樸酚質量濃度分別為1.14、2.28、9.10、18.21 μg/mL，和厚樸酚質量濃度分別為0.39、0.78、3.12、6.24 μg/mL的質控樣品。上述溶液均于4 ℃下保存，備用。

2.2 樣品預處理方法

2.2.1 透析內液 吸取平衡透析實驗中的透析內液200 μL，置于1.5 mL EP管中，加入乙腈600 μL沉淀蛋白，渦旋振蕩3 min后以12 000 r/min離心10 min。取上清液，以氮氣流吹干，殘渣用甲醇200 μL復溶，渦旋振蕩3 min后以12 000 r/min離心10 min，取上清液進樣測定。

2.2.2 透析外液 吸取平衡透析實驗中的透析外液200 μL，置于1.5 mL EP管中，以12 000 r/min離心10 min，取上清液進樣測定。

2.3 色譜與質譜條件

以ACQUITY UPLC BEH-C18（2.1 mm×50 mm，1.7 μm）為色譜柱，以乙腈（A）-0.1%甲酸溶液（B）為流動相進行梯度洗脫（0～3 min，65%A→75%A）；流速為0.3 mL/min；柱溫為40 ℃；進樣量為2 μL。

采用電噴霧離子源（electrospray ionization，ESI），以選擇反應監測（selective reaction monitoring，SRM）模式進行負離子掃描；離子傳輸管溫度為325 ℃；氣化室溫度為350 ℃；電噴霧電壓為3 kV；鞘氣流速為50 Arb；輔助氣流速為10 Arb；離子掃描范圍為m/z50→1 500。用于定量分析的離子對分別為m/z264.4→247.1、244.9（厚樸酚，去簇電壓分別為-116、-110 V，碰撞電壓分別為-31、-34 V）和m/z264.4→246.9、223.1（和厚樸酚，去簇電壓分別為-110、-100 V，碰撞電壓分別為-28、-40 V）。

2.4 方法學考察

依照2020年版《中國藥典》（四部）（以下簡稱“藥典”）通則“生物樣品定量分析方法驗證指導原則”的相關要求進行方法學考察[8]。

2.4.1 專屬性試驗 分別取空白血漿、空白血漿+混合對照品溶液（厚樸酚、和厚樸酚的最終質量濃度分別為2.28、0.78 μg/mL）、平衡透析實驗的透析內液樣品（9.0 μg/mL含藥透析液平衡透析24 h后所得），按照“2.2.1”項下方法處理后，再按照“2.3”項下條件進樣測定，記錄色譜圖。結果顯示，在上述條件下，厚樸酚、和厚樸酚色譜峰峰形良好，其保留時間分別約為1.3、1.0 min；血漿中內源性雜質不會對上述成分的定量測定產生干擾。結果見圖1（因不同種屬血漿樣品的色譜圖基本一致，故以空白牛血漿+混合對照品、牛血漿透析內液樣品的色譜圖作為代表）。

圖1 厚樸酚、和厚樸酚專屬性試驗的典型SRM圖

2.4.2 樣本殘留考察 本研究通過測定較高質量濃度質控樣品（厚樸酚、和厚樸酚的質量濃度分別為18.21、6.24 μg/mL）來驗證是否有殘留。結果顯示，測定高質量濃度質控樣品后，空白血漿樣品中的殘留不超過定量下限的20%，符合藥典相關要求[8]。

2.4.3 線性關系和定量下限考察 分別精密量取系列混合工作液10.00 μL，加至空白牛、兔、大鼠血漿90 μL中，得厚樸酚質量濃度分別為 1.14、2.28、4.56、9.12、13.65、18.24、22.76 μg/mL，和厚樸酚質量濃度分別為0.39、0.78、1.56、3.12、4.68、6.24、7.80 μg/mL的系列標準曲線樣品，按照“2.2.1”項下方法處理后，再按照“2.3”項下條件進樣測定，記錄峰面積。以待測成分峰面積為縱坐標（y）、其質量濃度為橫坐標（x）進行線性回歸（權重系數為1/x2），分別擬合得厚樸酚、和厚樸酚的回歸方程，并以線性范圍下限作為定量下限。結果見表1。

表1 不同基質中厚樸酚、和厚樸酚定量分析的回歸方程與線性范圍

2.4.4 精密度與準確度試驗 按照“2.1.3”項下方法配制低、中、高質量濃度（厚樸酚2.28、9.10、18.21 μg/mL，和厚樸酚0.78、3.12、6.24 μg/mL，下同）和定量下限質量濃度（厚樸酚1.14 μg/mL、和厚樸酚0.39 μg/mL，下同）的質控樣品，按照“2.2.1”項下方法處理后，再按照“2.3”項下條件連續進樣測定6次，記錄峰面積，考察日內精密度；連續測定3 d，考察日間精密度。以實測質量濃度與理論質量濃度的相對誤差（relative error，RE）來表示準確度。結果（表2）顯示，定量下限及低、中、高質量濃度質控樣品的日內、日間RSD和RE的絕對值均在5%以內，符合藥典相關要求[8]。

表2 不同血漿中厚樸酚、和厚樸酚定量分析的精密度與準確度試驗結果

2.4.5 提取回收率與基質效應試驗 按照“2.1.3”項下方法配制低、中、高質量濃度的質控樣品，每質量濃度平行6份。按照“2.2.1”項下方法處理后，再按照“2.3”項下條件進樣測定，記錄待測成分的峰面積（As）。分別取適量空白血漿，按照“2.2.1”項下方法處理后，加入適量某質量濃度混合工作液，配制成相應質量濃度（與低、中、高質量濃度相同）的待測樣品，每質量濃度平行6份，按照“2.3”項下條件進樣測定，記錄待測成分的峰面積（As’）。按照“2.1.3”項下方法操作，以甲醇代替空白血漿，平行配制6份低、中、高質量濃度的待測樣品，按照“2.2.1”項下方法操作后，再按照“2.3”項下條件進樣測定，記錄待測成分的峰面積（Bs）。提取回收率=As/As’×100%；基質效應=As’/Bs×100%。結果見表3。

表3 不同血漿中厚樸酚、和厚樸酚定量分析的提取回收率和基質效應結果（±s，n＝6，%）

表3 不同血漿中厚樸酚、和厚樸酚定量分析的提取回收率和基質效應結果（±s，n＝6，%）

待測成分厚樸酚理論質量濃度/（μg/mL）2.28 9.10 18.21 0.78 3.12 6.24提取回收率基質效應牛血漿98.65±0.44 97.98±0.47 98.57±0.33 98.37±0.62 98.05±0.53 98.20±1.04兔血漿96.17±0.32 96.81±0.47 95.74±2.28 97.02±1.03 96.87±0.52 97.19±0.61和厚樸酚大鼠血漿97.77±0.33 98.46±0.48 97.69±0.44 98.67±1.04 98.52±0.53 98.84±0.62牛血漿97.02±3.42 93.18±3.94 97.33±3.63 94.83±2.18 94.03±3.18 95.86±2.57兔血漿97.20±2.97 95.08±2.34 96.51±1.84 95.32±2.45 93.04±2.84 100.28±3.85大鼠血漿98.65±1.46 97.08±1.76 98.05±2.28 95.46±1.48 95.79±1.67 96.97±2.28

2.4.6 稀釋可靠性考察 在實際測定時，往往會遇到個別樣品質量濃度超過線性范圍上限的情況，為了不影響實驗的精密度和準確度，本研究向空白血漿中加入適量的混合對照品儲備液，配制成厚樸酚、和厚樸酚質量濃度分別為227.60、78.00 μg/mL的樣品溶液，用空白血漿稀釋10倍后，按照“2.2.1”項下方法處理，再按照“2.3”項下條件進樣測定，記錄峰面積并計算待測成分的變異系數。結果顯示，厚樸酚、和厚樸酚的變異系數分別為1.13%、0.88%，符合藥典相關要求[8]。

2.4.7 樣品穩定性考察 按照“2.1.3”項下方法配制低、高質量濃度的質控樣品，每質量濃度平行6份。考察樣品室溫放置6 h、反復凍融（-80 ℃～室溫）3次、-80 ℃放置6個月、按照“2.2.1”項下方法處理后在自動進樣器中放置24 h、按照“2.2.1”項下方法處理后室溫放置6 h的穩定性。結果顯示，上述樣品中各待測成分色譜峰峰面積的RSD均小于1%（n=6），符合藥典相關要求[8]。

2.5 平衡透析試驗

將透析袋剪成長約8 cm的小段，以0.01 mol/L碳酸氫鈉溶液活化后，用水洗凈，置于空白透析液中，于4 ℃下保存，備用。取活化后的透析袋，用棉線結扎一端使不漏液，精密量取牛、兔、大鼠血漿1 mL（即透析內液），分別置于透析袋中，將袋口扎緊。將透析袋分別浸沒于裝有質量濃度為4.5、9.0、13.5 μg/mL含藥透析液8 mL的離心管中，調節透析袋內外液面，使兩者保持在同一水平并盡量避免透析袋接觸到離心管壁，放入37 ℃恒溫箱中平衡透析24 h。待平衡透析結束后，取少量透析外液加至10%高氯酸溶液0.5 mL中以檢查是否有血漿滲漏（產生白色沉淀者作廢）。取透析內液和透析外液，分別按照“2.2.1”“2.2.2”項下方法處理后，再按照“2.3”項下條件進樣測定，記錄峰面積并按隨行標準曲線計算待測成分的質量濃度，并按下式計算血漿蛋白結合率：血漿蛋白結合率（%）=（c內-c外）/c內×100%（式中，c內、c外分別表示透析內、外液中待測成分的質量濃度）。每質量濃度平行3次。使用SPSS 18.0軟件對數據進行統計分析，數據以±s表示，多組間比較采用方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，檢驗水準α=0.05。結果見表4。

表4 不同血漿中厚樸酚、和厚樸酚的蛋白結合率測定結果（n＝3，%%）

由表4可見，在相同種屬的血漿樣品中，厚樸酚、和厚樸酚的蛋白結合率均隨含藥透析液質量濃度的增加而升高，有一定的濃度依賴趨勢（P＜0.05或P＜0.01）。在相同質量濃度的含藥透析液中，大鼠、兔血漿樣品中厚樸酚、和厚樸酚的蛋白結合率與牛血漿樣品比較，差異大多具有統計學意義（P＜0.05或P＜0.01），且在9.0、13.5 μg/mL的含藥透析液中，兔血漿樣品中和厚樸酚的蛋白結合率均顯著高于牛血漿樣品（P＜0.01）。

3 討論

3.1 色譜與質譜條件、樣品前處理方法優化

本研究應用了UPLC-MS/MS技術，該技術分離效果佳、靈敏度高、穩定性好，具有較高的選擇性和特異性，可實現高通量檢測[9]。本課題組前期發現，與甲醇-水流動相體系相比，乙腈-水流動相體系的系統壓力更低；在水相中加入適量的甲酸，可保證色譜峰峰形較好。本課題組前期比較了待測成分在不同粒徑、不同長度及內徑的色譜柱上的分離效果，最終選擇ACQUITY UPLC BEH C18（2.1 mm×50 mm，1.7 μm）作為色譜柱進行分析。本研究采用了ESI，可用于準確測定待測成分的分子離子峰；此外，本研究進一步對離子傳輸管溫度、氣化室溫度、去簇電壓、碰撞電壓等質譜參數進行了優化，最終確定了“2.3”項下色譜與質譜條件。本研究樣品前處理采用了蛋白沉淀法，該方法操作簡單且重現性好；同時，血漿樣品經蛋白沉淀、離心后的上清液以氮氣流濃縮富集，可避免待測樣品被沉淀劑（乙腈）稀釋。

3.2 血漿蛋白結合率檢測方法選擇及結果分析

藥物血漿蛋白結合率的常用研究方法包括平衡透析法、超濾法、超速離心法、高效親和色譜法、高效毛細管電泳前沿分析法等[10-11]。本研究采用了經典的平衡透析法，該法經濟，受外界環境影響小，結果穩定、可靠[11]。本課題組前期研究發現，透析袋吸附率的變異系數均小于1.00%，不影響蛋白結合率的測定；隨著透析時間的延長，各待測成分的血漿蛋白結合率亦不斷增大，其在相鄰時間點（平衡透析24、48 h）的血漿蛋白結合率并無明顯差異，故將平衡透析時間設為24 h。同時，參考人體溫度，將平衡透析溫度設為37 ℃。

含藥透析液質量濃度是根據有效劑量下所測血藥濃度而定，需覆蓋常規劑量下的血藥濃度范圍[12]，故本研究將含藥透析液質量濃度設為4.5、9.0、13.5 μg/mL。結果表明，在相同種屬血漿中，厚樸酚、和厚樸酚的蛋白結合率均隨含藥透析液質量濃度的增加而升高；在相同質量濃度的含藥透析液中，大鼠、兔血漿樣品中厚樸酚、和厚樸酚的蛋白結合率與牛血漿樣品有所不同，且兔血漿樣品中和厚樸酚的蛋白結合率（9.0、13.5 μg/mL的含藥透析液）顯著高于牛血漿樣品。筆者認為，透析內液和外液間的透析擴散動力來源于透析袋兩側待測成分的濃度差，中、低質量濃度含藥透析液中各待測成分與血漿蛋白的結合程度較低且尚未達到飽和，而高質量濃度含藥透析液中各待測成分具有較高的擴散動力，故其血漿蛋白結合率較高[13]。同時，厚樸酚與和厚樸酚均為弱酸性成分，多與血漿白蛋白共價結合，在每100毫升牛、兔、大鼠血漿中，分別含白蛋白4.1、3.8、1.68 g[14]，提示牛和兔血漿中可能含有更多的結合型成分，這可能是造成2種待測成分蛋白結合率存在種屬差異的主要原因。研究指出，人體正常血漿白蛋白一般為35～50 g/L[14]，可推測厚樸排氣合劑主要藥效成分在人血漿中的蛋白結合率較高，臨床應用時應避免與其他高血漿蛋白率藥物聯用，以防止不良反應的發生，但仍需相關研究予以證實。

綜上所述，本研究成功建立了測定厚樸排氣合劑主要藥效成分在牛、兔、大鼠血漿中蛋白結合率的方法，并比較了不同種屬血漿蛋白結合率的差異。結果顯示，厚樸酚、和厚樸酚在牛、兔、大鼠血漿中的蛋白結合率有明顯的種屬差異，且有一定的濃度依賴趨勢。