德拉馬尼血藥濃度測定方法的建立及應用Δ

丁巧燕，張歡，馬麗華，李思思，張宇，周銘（武漢市肺科醫院藥學部，武漢 430030）

結核病（tuberculosis，TB）是由單一病原體引發的傳染病，是全球患者十大死亡原因之一，嚴重危害人類健康[1]。據世界衛生組織（WHO）統計，2020年全球新發TB患者達990萬例，發病率為127/10萬，其中耐多藥結核病（multidrug resistant tuberculosis，MDR-TB）和耐利福平TB患者共計13.22萬例，但只有1/3的患者接受了適當的治療；我國新發TB患者占全球新發患者總數的8.5%，位居世界第二[2]。

MDR-TB是由至少對異煙肼和利福平這兩種一線用于TB藥物耐藥的結核分枝桿菌引起的[3]。盡管臨床使用各種組合的強效藥物來進行治療，但結核分枝桿菌已經持續表現出抵抗抗結核藥的能力，耐藥TB菌株在全世界范圍內以驚人的速度出現，每年約有50萬例感染患者[4]。由于MDR-TB的治療成功率較低，臨床迫切需要新型的抗結核藥[5]。在此背景下，德拉馬尼（delamanid，DLM）于2014年獲得歐洲藥品管理局（European Medicines Agency，EMA）批準，并于同年被WHO推薦用于MDR-TB成年患者的治療[5]。

治療藥物監測（therapeutic drug monitoring，TDM）是用于指導個體化診療的手段之一，其旨在通過血藥濃度來調整藥物劑量以提高治療效果、降低不良反應發生風險，同時最大限度地減少毒性[6]。DLM是一種雙環硝基咪唑類化合物，為新型抗結核藥，可通過在細胞內生成一氧化氮來發揮抗結核分枝桿菌的作用[7]。研究指出，DLM的療效具有濃度依賴性，血藥濃度過低可能導致療效不佳，血藥濃度過高則可能引發不良反應[8]。因此，本文從臨床實際需求出發，建立了快速、準確的高效液相色譜-串聯質譜（LC-MS/MS）法，并將其用于檢測TB患者體內DLM的血藥濃度，以期為臨床用藥提供指導。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器包括4500MD型LC-MS/MS系統（美國AB Sciex公司），5810R型臺式高速大容量離心機、5424R型微量臺式高速冷凍離心機（德國Eppendorf公司），Milli-Q Reference型超純水系統（美國Millipore公司），XSR105DU型十萬分之一分析天平[梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司]等。

1.2 主要藥品與試劑

DLM片（國藥準字J20180086，規格50 mg）購自日本 Otsuka Pharmaceutical Co.，Ltd.；DLM 對照品（批號C08A11L110842，純度99%）購自上海源葉生物科技有限公司；甲醇、甲酸、二甲基亞砜（DMSO）均為色譜純，其余試劑均為分析純，水為超純水。

1.3 空白血漿

空白血漿采集于武漢市肺科醫院進行體檢的健康者。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

以 Phenomenex SynergiTMFusion-RP（50 mm×32 mm，4 μm）為色譜柱，以甲醇（A）-0.1%甲酸溶液（B）為流動相進行梯度洗脫（0～0.5 min，40%A；0.5～0.6 min，40%A→90%A；0.6～2.9 min，90%A；2.9～3.0 min，90%A→40%A；3.0～4.0 min，40%A）；柱溫為40 ℃；流速為0.3 mL/min；進樣量為1 μL。

2.2 質譜條件

離子源為電噴霧離子源（electrospray ionization，ESI），以多反應監測（multi-reaction monitoring，MRM）模式進行正離子掃描；離子化電壓為5 500 V；霧化氣溫度為600 ℃；氣簾氣壓力為25 psi；碰撞氣壓力為6 psi；噴霧氣壓力為45 psi；輔助加熱氣壓力為55 psi；用于定量分析的DLM離子對為m/z535.0→352.0，碰撞能量為38.1 eV；去簇電壓為124.6 V；用于定性分析的DLM離子對為m/z535.0→356.9，碰撞能量為26.3 eV，去簇電壓為114.0 V。

2.3 對照品溶液和質控樣品的制備

精密稱取DLM對照品10 mg，溶于DMSO中，配制成質量濃度為1 mg/mL的儲備液，置于-20 ℃冰箱中保存。取適量儲備液，用DMSO稀釋，得質量濃度分別為1、5、10、20、40、80、160 μg/mL的系列標準溶液和1、2、20、120 μg/mL的質控溶液。精密量取空白血漿95 μL，分別加入上述系列標準溶液各5 μL，制成質量濃度分別為0.05、0.25、0.5、1、2、4、8 μg/mL的系列標準曲線血漿樣品；同法制備質量濃度分別為0.05、0.1、1、6 μg/mL的質控血漿樣品，備用。

2.4 血漿樣品的處理

精密吸取待測血漿樣品40 μL，置于1.5 mL離心管中，精密加入甲醇360 μL，振蕩混勻1 min后，于4 ℃下以12 000 r/min離心10 min，取上清液進行LC-MS/MS分析。

2.5 方法學考察

按照2020年版《中國藥典》（四部）通則的相關要求進行方法學考察[9]。

2.5.1 專屬性考察 取6份不同來源的空白血漿、空白血漿+DLM對照品（0.5 μg/mL）和服用DLM患者的血漿樣品，分別按“2.4”項下方法處理后，再按“2.1”“2.2”項下色譜與質譜條件進樣分析，記錄色譜圖。結果顯示，在上述條件下，DLM的保留時間約為1.9 min，血漿中的內源性物質不影響DLM的測定，表明該方法專屬性良好，詳見圖1（空白血漿樣品圖略）。

圖1 DLM專屬性考察的色譜圖

2.5.2 線性關系和定量下限的考察 取“2.3”項下系列標準曲線血漿樣品，按照“2.4”項下方法處理后，再按照“2.1”“2.2”項下色譜與質譜條件進樣分析，記錄峰面積。以DLM峰面積為縱坐標（y）、DLM質量濃度為橫坐標（x），用最小加權法（加權系數為1/x2）進行線性回歸，得DLM的回歸方程為y=1.745 45×106x+20 346.322 71（r=0.999 5）。結果表明，DLM檢測質量濃度的線性范圍為0.05～8 μg/mL，定量下限為0.05 μg/mL。

2.5.3 準確度與精密度試驗 取“2.3”項下定量下限質量濃度（0.05 μg/mL）和低、中、高質量濃度（0.1、1、6 μg/mL）的質控血漿樣品，按照“2.4”項下方法處理后，再按照“2.1”“2.2”項下色譜與質譜條件連續進樣5次，考察日內精密度；連續測定3 d，考察日間精密度；以實測質量濃度與理論質量濃度進行比較，考察準確度。結果顯示，該方法日內和日間精密度的RSD均小于10%，準確度為92.7%～104.9%，詳見表1。

表1 精密度與準確度試驗結果

2.5.4 基質效應與萃取回收率試驗 分別用3種方法制備低、中、高質量濃度（0.1、1、6 μg/mL）的待測樣品——第1組：取DLM對照品適量，用50%甲醇稀釋，制成低、中、高質量濃度的DLM溶液，按照“2.1”“2.2”項下色譜與質譜條件進樣分析，得峰面積A；第2組：取空白血漿，加9倍體積的甲醇以沉淀蛋白，離心后取上清液（具體操作同“2.4”項），以此上清液作為基質，制備低、中、高質量濃度的DLM樣品溶液，按照“2.1”“2.2”項下色譜與質譜條件進樣分析，得峰面積B；第3組：取DLM對照品適量，用空白血漿稀釋，制成低、中、高質量濃度的DLM血漿樣品，按照“2.4”項下方法處理后，再按照“2.1”“2.2”項下色譜與質譜條件進樣分析，得峰面積C。按下式分別計算基質效應和萃取回收率：基質效應=B/A×100%，萃取回收率=C/B×100%。各質量濃度樣品平行操作5份。結果顯示，各樣品的平均基質效應為94.3%～107.5%，平均萃取回收率為93.2%～98.1%，詳見表2。

表2 基質效應與萃取回收率試驗結果（±s，n＝5）

表2 基質效應與萃取回收率試驗結果（±s，n＝5）

理論質量濃度/（μg/mL）0.1 1 6基質效應/%107.5±3.0 98.6±1.0 94.3±2.7萃取回收率/%98.1±2.8 93.2±1.6 96.7±1.4

2.5.5 穩定性試驗 按照“2.3”項下方法制備低、中、高質量濃度（0.1、1、6 μg/mL）的質控血漿樣品，分別于室溫下放置2 h、4 ℃放置6 h、-20 ℃下放置7 d、-80 ℃放置15 d、反復凍融（-80 ℃～室溫）2或3次后，按照“2.4”項下方法處理后，再按照“2.1”“2.2”項下色譜與質譜條件進樣分析，考察各樣品在上述條件下的穩定性（各質量濃度樣品平行操作5份，結果以實測質量濃度的RSD表示）。結果顯示，除反復凍融3次外，各樣品在其余條件下放置的穩定性均較好（RSD均小于10%），詳見表3。

表3 血漿樣品的穩定性試驗結果（n＝5，%）

同時，按照“2.3”項下方法配制質量濃度為1 mg/mL的DLM儲備液和質量濃度分別為10、80 μg/mL的DLM標準溶液，考察上述溶液于室溫下放置6 h、4 ℃放置15 d的穩定性（各質量濃度樣品平行操作5份，結果以實測質量濃度的RSD表示）。結果顯示，各樣品在上述條件下放置的穩定性均較好（RSD均小于10%），詳見表4。

表4 儲備液和標準溶液的穩定性試驗結果（n＝5，%）

2.5.6 殘留效應 取“2.3”項下質量濃度為8 μg/mL的標準曲線血漿樣品，按照“2.4”項下方法處理后，再按照“2.1”“2.2”項下色譜與質譜條件進樣分析，隨后同法測定空白血漿樣品以考察殘留效應。結果顯示，在DLM相同的保留時間處，空白血漿樣品對應色譜峰峰面積與定量下限質量濃度血漿樣品色譜峰峰面積的比值小于5%，表明殘留效應對DLM的定量分析無明顯影響。

2.5.7 稀釋可靠性 取“2.3”項下質量濃度為8 μg/mL的標準曲線血漿樣品，用空白血漿稀釋10倍后，按照“2.4”項下方法處理后，再按照“2.1”“2.2”項下色譜與質譜條件進樣分析以考察稀釋可靠性（樣品平行操作5份）。結果顯示，稀釋后樣品的精密度RSD小于10%，準確度為98.9%，表明血漿樣品用空白血漿稀釋10倍對DLM的定量分析無明顯影響。

2.6 方法應用

2.6.1 患者的納入與排除標準 納入標準包括：（1）年齡18～65歲；（2）臨床確診為MDR-TB患者；（3）規律服用DLM片1周以上，中途未中斷或未更改劑量；（4）同意參加試驗并已簽署知情同意書。排除標準包括：（1）不耐受藥物不良反應者；（2）1周內服用對DLM藥物濃度有影響的藥物者，如利福平等強細胞色素P450（cytochrome P450，CYP）3A4誘導劑[8]；（3）妊娠期或哺乳期婦女。本研究方案經武漢市肺科醫院醫學倫理委員會審查批準，批件號為武肺倫理（2021）20號。

2.6.2 用藥情況 本研究共納入我院2021年4-10月收治的MTB-TB患者6例。其中，男性2例、女性4例；平均年齡為（28.8±11.7）歲；所有患者均口服DLM片，每次100 mg，每天2次，連續服用1周以上。

2.6.3 檢測方法及結果 使用乙二胺四乙酸抗凝管采集患者末次服藥后4 h的靜脈血，于4 ℃下以3 000 r/min離心10 min，取上層血漿于離心管中，置于-80 ℃冰箱中保存，備用。取患者血漿樣品，按照“2.4”項下方法處理后，再按照“2.1”“2.2”項下色譜與質譜條件進樣分析，記錄峰面積并使用隨行標準曲線計算DLM的血藥濃度。結果顯示，6例患者體內DLM的血藥濃度為0.61～2.76 μg/mL，平均（1.67±0.74）μg/mL。

3 討論

DLM是一種霉菌酸生物合成抑制劑，對復制和休眠的結核分枝桿菌以及細胞內外的結核桿菌均具有抑制活性[10—11]。有研究指出，DLM聯合其他活性藥物用于難治性耐藥TB，可實現較高的培養陰性率，且具有良好的安全性[12]。然而，在DLM上市后不久，臨床出現了耐DLM結核桿菌感染患者，因此對該藥的耐藥性進行系統監測很有必要[13]。為了最大限度地延緩和減少耐DLM結核桿菌的出現，選擇綜合治療方案并于治療期間進行TDM十分重要，通過監測DLM血藥濃度，可及時調整給藥劑量，有助于實現個體化給藥、降低耐藥率、提高臨床療效。

TDM常用的分析技術主要有光譜法、色譜法和免疫學檢測技術等，從藥物專屬性上推薦采用LC-MS/MS和高效液相色譜（HPLC）技術[14]。由于DLM在患者體內的血藥濃度較低，HPLC技術已不能滿足臨床監測需求，而LC-MS/MS技術專屬性強、靈敏度高，可降低內源性物質和其他藥物的干擾，加之檢測速度較快，故適用于DLM血藥濃度的大樣本監測。基于此，本研究建立了檢測DLM血藥濃度的LC-MS/MS法并將其應用于臨床。

在流動相的選擇中，為了弱化色譜峰拖尾并提高檢測的準確性，本課題組分別考察了流動相中加入甲酸或（和）甲酸銨后的出峰情況，結果顯示，在水相中加入甲酸，所得色譜峰的峰形較好；隨后，本課題組依次以0.1%、0.2%甲酸溶液為水相，考察了兩者的分離效果，最終選擇了0.1%甲酸溶液作為水相，并確定了“2.1”項下色譜條件。

本課題組前期在掃描母離子時發現，DLM易形成[M+H]+峰，且在MRM正離子模式下的靈敏度較高；隨后，本課題組對離子化電壓、霧化氣溫度、氣簾氣壓力、碰撞氣壓力、碰撞能量、去簇電壓等質譜參數進行優化，以進一步提高靈敏度并降低基線信噪比，最終得到了“2.2”項下質譜條件。

研究指出，以甲醇沉淀蛋白所得樣品的基質效應明顯[15]。為此，本課題組首先在滿足DLM血藥濃度定量分析的前提下適當增加甲醇的體積，以減少基質效應的影響，最終確定按血漿-甲醇（1∶9，V/V）進行蛋白沉淀。隨后，本課題組采用梯度洗脫方式，通過調整流速、優化水相和有機相的比例，盡可能地減少內源性物質的干擾。

本課題組前期分別采用內標法（以DLM同位素為內標）和外標法進行DLM的定量分析，結果發現，2種方法并無明顯差別。結合相關文獻[16—17]推薦，為縮短臨床大樣本監測時間并降低檢測成本，本研究最終選擇了外標法，以隨行標準曲線計算MDR-TB患者體內DLM的血藥濃度。

對比Meng等[18]所建的方法，本研究所建方法需要的樣本量較少，僅需40 μL的血漿即可完成檢測；同時，以甲醇沉淀蛋白進行血漿樣品前處理，操作較為簡便；在流動相組成方面，本法使用了成本較低且組成簡單的甲醇-甲酸溶液；此外，DLM的出峰時間為1.9 min，檢測時間不超過4 min，適用于臨床大樣本的快速檢測。

綜上所述，本研究成功建立了檢測人血漿中DLM濃度的LC-MS/MS法，可用于檢測MDR-TB患者體內DLM的血藥濃度。由于目前暫無明確的DLM有效治療濃度范圍，且本研究的樣本量較小，故后期本課題組將擴大樣本量進行檢測，同時收集該藥有效性和安全性的相關數據，完善臨床藥動學研究。