TTLL12 在鼻咽癌中的表達及臨床意義

吳春成 連雅晨 鄧世山 楊洪斌

1.川北醫學院附屬醫院耳鼻咽喉頭頸外科，四川南充 637000；2.川北醫學院解剖教研室，四川南充 637000

鼻咽癌是臨床常見惡性腫瘤，具有明顯的地域性。據統計，約70%的鼻咽癌病例發生在東亞及東南亞[1]。在現有診療模式下，鼻咽癌患者的5 年生存率大大提高，但鼻咽癌的遠處轉移及復發仍是制約鼻咽癌患者總體生存率的一個重要因素[2]。因此，尋找新的鼻咽癌分子標志及治療靶點是當前研究熱點。微管蛋白是腫瘤治療的重要靶點，微管蛋白聚合并經修飾后形成微管，構成細胞骨架[3]。研究表明微管蛋白酪氨酸連接酶類似物12（tubulin tyrosine ligase like 12，TTLL12）可通過干擾硝基化酪氨酸與微管的連接，減少硝基化酪氨酸微管蛋白（N-tubulin）形成，干擾人體清除異常細胞，從而促進腫瘤細胞生長[4]。有學者發現TTLL12 在肺癌、結直腸癌、前列腺癌和卵巢癌中表達明顯升高，并與患者的不良預后密切相關[5-8]。本研究利用免疫組織化學法及鼻咽癌基因芯片數據分析，探討TTLL12 在鼻咽癌組織中的臨床意義及可能的作用機制。

1 資料與方法

1.1 研究對象

收集川北醫學院附屬醫院病理科2016 年1 月至2019 年12 月初治鼻咽癌患者的組織石蠟標本84 例和慢性鼻咽炎患者的組織石蠟標本28 例。所有患者均于我院喉鏡下取活檢，有完整的石蠟標本；鼻咽癌患者在取組織標本前均未接受任何有關鼻咽癌的治療，并住院完成全部常規標準治療，且臨床病歷資料完整。所有患者均已簽署知情同意書。

1.2 研究方法及結果判定

將石蠟標本按照免疫組織化學Super Vision二步法檢測組織中TTLL12 的表達。采用染色強度與陽性細胞百分比的乘積進行半定量分析染色結果。染色強度計分：無著色計0 分，著淺棕色計1 分，著棕色計2 分，著深棕色計3 分；陽性細胞百分比計分：≤5%計0 分，6%～25%計1 分，26%～50%計2 分，51%～75%計3 分，＞75%計4 分；總分為染色強度與陽性細胞百分比的乘積：0～1 分為陰性，2～4 分為+，5～8 分為++，9～12 分為+++，并定義≤4 分為低表達，＞4 分為高表達。

1.3 基因芯片數據分析

從GEO（Gene Expression Omnibus）數據庫（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）中篩選合適的基因芯片數據集GSE102349。GSE102349 中包含113例未分化鼻咽癌樣本。使用R 4.1.1 軟件繪制箱式圖，分析不同臨床分期中TTLL12 基因在轉錄水平上的表達差異。Kaplan-Meier 法繪制生存曲線，分析TTLL12 與鼻咽癌患者無進展生存的相關性。

1.4 基因富集分析

對GSE102349 芯片行京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）富集分析，使用R 4.1.1 軟件篩選差異基因。

1.5 統計學方法

應用SPSS 22.0 軟件對實驗數據進行統計學分析，計數資料采用例數（百分率）[n（%）]表示，組間比較采用χ2檢驗，生存分析采用Kaplan-Meier法，多因素分析用Cox 回歸模型分析。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 TTLL12 在鼻咽癌組織中的表達

TTLL12 主要定位于細胞質，細胞質含棕色或深棕色顆粒定義為高表達，見圖1、圖2。鼻咽癌組織TTLL12 高表達57 例，低表達27 例；鼻咽慢性炎癥組織TTLL12 高表達3 例，低表達25 例。與鼻咽慢性炎癥組織相比，TTLL12 蛋白在鼻咽癌組織中的表達顯著上調（P＜0.001）。

圖1 TTLL12 在鼻咽慢性炎癥組織中低表達，細胞排列規則有序，細胞質無著色或著淺黃色（SP×400）

圖2 TTLL12 在鼻咽癌組織中高表達，細胞排列紊亂、異形、大小不一，細胞質呈棕色或深棕色（SP×400）

2.2 鼻咽癌患者不同臨床病理特征與TTLL12表達的關系

TTLL12 高表達鼻咽癌患者的T3～T4、N2～N3、Ⅲ～Ⅳ期的占比顯著高于 TTLL12 低表達患者（P＜0.05），但TTLL12 表達在不同年齡、性別、M分期的鼻咽癌患者中比較差異均無統計學意義（P＞0.05），見表1。

表1 鼻咽癌患者不同臨床病理特征與TTLL12 表達的關系（例）

2.3 TTLL12 表達與鼻咽癌患者預后的關系

截至隨訪終點，鼻咽癌患者死亡18 例，其中高表達組16 例，低表達組2 例，高表達組患者的總生存顯著低于低表達組（P=0.027），見圖3。進一步行Cox 回歸模型分析發現，TTLL12 高表達和N 分期均是影響鼻咽癌患者預后的獨立危險因素（P＜0.05），見表2。

表2 Cox 回歸模型分析影響鼻咽癌患者的預后因素

圖3 鼻咽癌患者Kaplan-Meier 生存曲線

2.4 TTLL12 在基因芯片數據集中的表達情況

在基因芯片數據集 GSE102349 中，TTLL12 mRNA 的表達水平與臨床分期呈正相關，分期越晚，TTLL12 mRNA 的表達越高（P=0.033），見圖4；TTLL12 高表達的鼻咽癌患者無進展生存率顯著低于TTLL12 低表達患者（P=0.041），見圖5。

圖4 不同臨床分期的鼻咽癌患者的TTLL12 mRNA 表達差異散點圖

圖5 不同TTLL12表達水平鼻咽癌患者的無進展生存曲線

2.5 功能基因富集分析

KEGG 富集分析結果提示，TTLL12 高表達基因樣本主要富集在趨化因子信號通路，與人類T 細胞白血病病毒1 型感染及EB 病毒感染密切相關，見圖6。

圖6 KEGG 富集分析

3 討論

微管活動異常可能引起染色體功能和結構的錯誤，從而導致染色體不穩定[9]。研究表明，染色體不穩定可導致細胞內變異，促進細胞表型向惡性特征轉變[10]。TTLL 家族為微管蛋白相關蛋白，可調節微管蛋白或微管活性[11]。研究發現TTLL 家族與腫瘤異常表達和癌癥進展密切相關[12]。

本研究中，利用免疫組織化學分析TTLL12 的表達情況，證實TTLL12 在鼻咽癌組織中表達上調，提示TTLL12 可通過某種細胞代謝途徑參與促進鼻咽癌發病過程。研究發現TTLL12 表達越高的患者T、N 及臨床分期越晚，且Cox 回歸模型顯示TTLL12 高表達和N分期均是影響鼻咽癌患者總生存的獨立危險因素。提示TTLL12 作為潛在的原癌基因，參與鼻咽癌的發生發展，表明 TTLL12可作為一個潛在的基因靶點用于鼻咽癌患者預后預測及治療。

本研究利用GEO 數據庫中的數據集，分析TTLL12 在不同鼻咽癌患者中的mRNA 水平表達差異，結果顯示TTLL12 在臨床分期越晚的鼻咽癌患者中表達越高，與本研究結果相符。TTLL12 表達水平與鼻咽癌患者無進展生存明顯相關。KEGG 富集分析結果顯示TTLL12 基因主要富集在趨化因子信號通路，與人類T 細胞白血病病毒1 型感染及EB病毒感染密切相關。趨化因子信號可導致靶基因轉錄，參與細胞的侵襲、運動、與細胞外基質的相互作用。人類癌癥有一個復雜的趨化因子網絡，影響腫瘤浸潤的程度和表型及腫瘤的生長、生存、侵襲和腫瘤內血管生成[13]。由此猜測，TTLL12 基因在鼻咽癌患者中可能通過促進趨化因子的表達，從而促進鼻咽癌生長及轉移。腫瘤可在病毒感染后發生發展，病毒感染除引起慢性炎癥外，還可通過炎癥相關機制抑制抑癌基因，避免感染細胞凋亡，從而有利于病毒的潛伏、宿主細胞的增殖和持續感染[14]。越來越多的證據表明人類T 細胞白血病病毒1 型和EB 病毒的持續感染與成人T 細胞白血病和鼻咽癌的發生發展密切相關[15]。TTLL12 可能是這些病毒激活的一種促癌產物，參與腫瘤的發生發展。

綜上，TTLL12 在鼻咽癌中是一個重要的原癌基因，其蛋白表達上調在鼻咽癌發生發展中發揮重要作用，且是影響鼻咽癌患者預后的獨立危險因素。