大黃?蟲丸中基于血小板P2Y1及P2Y12受體作用的抗血小板聚集活性成分篩選＊

陳 莉，周 堅，季文君，潘爾卓，顧曉紅

（蘇州市藥品檢驗檢測研究中心 蘇州 215104）

血小板聚集是血栓形成過程中的重要步驟，一方面血小板的聚集會釋放大量的促凝物質，如血栓烷A2、血管內皮細胞表達組織因子等，級聯放大凝血過程，引起血流的改變，產生血流淤滯，損傷血管內皮，形成早期血栓；另一方面血小板聚集還會刺激單核細胞、血管內皮細胞表達組織因子等，啟動其他凝血反應，促進血栓的進一步形成[1-2]。

P2Y1和P2Y12是血小板膜上的G蛋白偶聯受體，當人體的凝血系統受到內外源因素刺激被激活后，就會釋放ADP，ADP隨后與P2Y1受體結合，引發鈣離子水平升高，促進血小板凝聚，繼而ADP又與P2Y12受體結合，使其阻止腺苷酸環化酶的作用，降低細胞內環磷腺苷的水平，加速血小板繼續聚集。因此，P2Y1和P2Y12已成為抗血小板聚集作用藥物開發和篩選的重要靶點[3-4]。

大黃?蟲丸是根據漢代著名醫學家張仲景所著的《金匱要略》中的名方所制的，由大黃、?蟲、水蛭、虻蟲、蠐螬、桃仁、干漆、黃芩、杏仁、生地黃、芍藥、甘草12味藥物組成，具有“活血化瘀，清熱潤燥，滋陰養血”之功效，現在主要用于活血破淤，通經消癥[5]。現已有大量的臨床應用結果顯示，大黃?蟲丸在治療急性期腦梗死、抑制動脈血栓形成和抗動脈粥樣硬化等疾病中顯示出較好的抗凝血、抑制血小板活化相關因子的表達、改善血小板功能和血液流變等的療效[6-9]。但是其作為由多味藥配伍而成的制劑，成分的豐富性和復雜性在帶來該復方制劑功效多樣性這一優點的同時，也給其成分與藥效活性的關聯以及成分發揮藥效的機制探索帶來了挑戰，給大黃?蟲丸這一經典名方的現代化研究及其治療疾病的中醫藥理論的豐富和發展帶來了難度。

因此本文嘗試從抑制血小板聚集這一抗血栓作用的常見途徑之一作為切入點，以血小板膜上的P2Y1和P2Y12為具體靶點，對大黃?蟲丸中9種含量較高的特征性成分（大黃酚、大黃素、大黃酸、大黃素甲醚、蘆薈大黃素、黃芩苷、苦杏仁苷、芍藥苷和甘草酸）[10-11]進行分子對接，篩選大黃?蟲丸中基于血小板P2Y1和P2Y12通路的潛在抗血小板聚集的成分，并對這些成分進行抗血小板聚集作用的實驗確證，將大黃?蟲丸的活性成分與活血破瘀藥效活性進行關聯，為大黃?蟲丸這一經典名方在活血破瘀方面的臨床應用及其機制探索提供現代科學依據。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

新西蘭兔（蘇州高新區鎮湖實驗動物科技有限公司），Sorvall ST 16R離心機（賽默飛世爾科技（中國）有限公司），Coatron M4半自動血凝儀（德國TECO（德高）有限公司），檸檬酸三鈉（國藥集團化學試劑有限公司，批號：20150629），大黃酚、大黃素、大黃酸、大黃素甲醚、蘆薈大黃素、黃芩苷、苦杏仁苷和芍藥苷（中國食品藥品檢定研究院，批號分別為：110796-201922、110756-201913、110757-201607、110758-201817、110795-202011、110715-202122、110820-201808、110736-202044），甘草酸（阿拉丁，批號：1405-86-3），腺 苷-5'-二 磷 酸 鈉 鹽（ADP，sigma公 司，批 號：SLCB5611）。

1.2 軟件及參數

使用Scripps研究所Olson實驗室開發的AutoDock Tools軟件進行蛋白質受體的結構預處理，使用Cambridge Soft公司開發的ChemBio Office 2012軟件包中的ChemBio Draw和ChemBio 3D組件進行配體化合物分子結構的準備，采用Scripps研究所Oleg博士開發的AutoDock Vina軟件進行分子對接的計算機模擬及計算，使用DeLano Scientific LLC公司的Pymol v0.99軟件進行受體和化合物配體三維結構的展示，使用European Bioinformatics Institute開發的Ligplus程序進行分子間中氫鍵和疏水作用的分析，使用BIOVIA公司開發的Discovery Studio 3.5分子間進行π相互作用的分析。

1.3 P2Y1和P2Y12受體蛋白及小分子配體的準備

選取血小板膜上的P2Y1和P2Y12這兩個G蛋白偶聯受體作為靶蛋白，在RCSB PDB數據庫（https://www.rcsb.org/）下載靶蛋白對應的蛋白晶體結構。對蛋白晶體進行前處理，包括刪除溶劑分子、去除金屬離子以及非相關的蛋白質構象，定義該蛋白為受體，并設置結合口袋的參數，使受體分子包含在結合口袋中。然后使用AutoDock Tools軟件對蛋白質進行加氫和加電荷，最后生成pdbqt文件作為受體文件備用。

進行分子對接篩選的候選小分子配體，本文選擇了大黃?蟲丸中9種主要成分（大黃酚、大黃素、大黃酸、大黃素甲醚、蘆薈大黃素、黃芩苷、苦杏仁苷、芍藥苷和甘草酸）進行對接。這些小分子配體的準備步驟包括：首先根據名稱在傳統中藥數據庫（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Data base and Analysis Platform，TCMSP）[12]中找到化合物的結構，使用ChemBio draw軟件將這些化合物的結構轉換為mol2格式，使用ChemBio 3D軟件的MM2力場最小化功能對化合物的結構進行能量最優化處理，將這些化合物的二維結構轉化為三維結構，隨后使用Autodock Tools軟件對這些化合物的三維結構進行加氫、計算所帶電荷，最后保存為pdbqt文件作為分子對接的配體分子數據庫。同時選用P2Y1和P2Y12受體文件中自帶的配體MRS 25000和AZJ作為分子對接的對照配體，其準備方法同其他候選的小分子配體。

1.4 對接參數及分子對接

分子對接采用AutoDock Vina軟件進行，該軟件使用快速梯度優化構想搜索算法和簡單的評分函數，根據Lamarckian遺傳算法尋找小分子與配體蛋白的最佳結合構象，并計算配體和受體間的結合能，結合能越小，配體和受體間的相互作用越強。具體對接參數設置如下：采用AutoDock Tools軟件調整P2Y1和P2Y12受體的結合盒子（Grid Box）的中心以及大小進，使受體分子能完全包含在Grid Box中，具體的Grid Box參數如下：P2Y1（4xnw）的中心坐標為x=27.589、y=-6.278、z=-13.036，Grid Box的大小為size x=56、size y=70、size z=100；P2Y12（4ntj）的中心坐標為x=20.376、y=-77.279、z=-32.660，盒子為size x=58、size y=84、size z=78。同時設置AutoDock Vina運行參數：num_modes=20、energy_range=4、exhaustiveness=100，其他均為默認值進行分子對接，計算不同化合物與P2Y1和P2Y12受體結合的最小結合能。

1.5 血小板聚集試驗

血小板聚集實驗參照文獻方法進行[13]，健康的新西蘭兔，心臟取血，置于含有3.8%枸櫞酸鈉（體積比1∶9）的試管中，混勻后180 g離心10 min，吸取上層的富血小板血漿（PRP）靜置備用，將下層血漿繼續1800 g離心20 min，再次取上層的血漿，即為貧血小板血漿（PPP）。向PRP中加入用PPP以調整血小板的數量約為3.5×108個·mL-1。PRP和PPP均需要靜置保存在18-25℃環境下。測定時先用PPP樣本進行透光度調零，將所得180μL PRP與20μL空白溶劑或不同的化合物在37℃下孵育3 min，再將待檢測的比色管放入經過調零后的檢測通道內，最后加入誘導劑ADP(10 μmol·L-1終濃度)立即進行血小板聚集的檢測，記錄聚集率，并計算抑制率。小分子配體的終濃度均為2 nmol·L-1，化合物先用DMSO溶解后再用生理鹽水稀釋至所需濃度。通過SPSS 16.0進行統計學分析，使用單因素方差分析比較各組結果是否有差異，統計結果以均值±標準差的形式表示，以P＜0.05判斷具有統計學差異。

2 結果與分析

2.1 對接結果分析

分別分析大黃?蟲丸中大黃酚、大黃素、大黃酸、大黃素甲醚、蘆薈大黃素、黃芩苷、苦杏仁苷、芍藥苷和甘草酸這9種成分、以及P2Y1受體與自帶配體MRS 2500和P2Y12與自帶配體AZJ的相互作用情況，并計算各成分或自帶配體分別與P2Y1和P2Y12受體的結合能。P2Y1和P2Y12受體與大黃?蟲丸中的9種成分及其自帶配體的結合能計算結果見表1。與P2Y1進行分子對接的大黃?蟲丸9種成分中，結合能較低的化合物為甘草酸、黃芩苷和大黃酸，其 結 合 能 分 別-10.6 kcal·mol-1、-9.7 kcal·mol-1和-9.1 kcal·mol-1，P2Y1自帶配體MRS 2500與P2Y1受體的結合能為-9.5 kcal·mol-1，結果顯示，甘草酸和黃芩苷與P2Y1受體自帶配體的結合能大致相當；與P2Y12進行分子對接的大黃?蟲丸9種成分中，結合能較低的化合物為大黃酸、大黃酚、大黃素、大黃素甲醚和蘆薈大黃素，其結合能除大黃酸為-9.7 kcal·mol-1之外，其余化合物均為-9.1 kcal·mol-1，P2Y12自帶配體AZJ與P2Y12受體的結合能為-10.2 kcal·mol-1，結果提示大黃酸、大黃酚、大黃素、大黃素甲醚和蘆薈大黃素與P2Y12受體的結合能力尚可，但并未優于其自帶配體。

表1 小分子配體與P2Y1和P2Y12受體的結合能

續表

續表

化合物與受體靶點間的結合能力，主要受到化合物配體與受體靶點間相互作用的驅動，這種相互作用力主要包括了疏水作用、氫鍵的相互作用以及空間位阻等影響因素。因此分析各小分子配體與靶蛋白受體的相互作用模式，得到這些配體與各靶蛋白受體的相互作用的情況，包括氫鍵的作用，π-π相互作用和疏水作用，能更加有助于篩選作用效果更好的配體。對各化合物配體與P2Y1和P2Y12受體結合后，結合能最低的結合模式的分子間作用分析結果見表2。

最后從表1和表2中篩選得到P2Y1和P2Y12配體結合能最低且結合位置與其自帶配體較類似的化合物各1個（即甘草酸和大黃酸）作為最具潛力的候選化合物，分析其與靶蛋白對接的構象圖（見圖1）。構象圖顯示，甘草酸與P2Y1受體主要結合在以Tyr110、Arg195、Arg287、Tyr303和Arg310等形成的結合口袋中（圖1左），大黃酸與P2Y12受體主要結合在以Tyr105、Tyr109、Val190、和Asn191等 形 成 的 結 合 口 袋 中（圖1右）。

圖1 化合物與受體對接的構象圖（左：甘草酸與P2Y1受體；右：大黃酸與P2Y12）

表2 化合物與P2Y1和P2Y12受體的分子間作用力

2.2 化合物對血小板聚集的抑制作用

為了對上述分子對接的結果進行驗證，采用ADP誘導的體外血小板聚集試驗對大黃蟄蟲丸中的9種成分的作用進行了初步的實驗驗證。如果化合物具有抑制血小板聚集的作用，相對于空白組而言，經不同化合物孵育后的給藥組的血小板最大聚集率會下降，以此可以計算不同化合物對血小板聚集的抑制率[抑制率=（空白組聚集率-給藥組聚集率）/空白組聚集率×100%]，以評價他們對血小板聚集過程的抑制能力。在血小板聚集的實驗結果中（圖2），大黃酸（2 nmol·L-1）對ADP誘導的血小板聚集具有較好抑制作用，聚集率為41.3%，抑制率為51.2%，與空白組相比具有顯著性差異。蘆薈大黃素在2 nmol·L-1時對ADP誘導的血小板聚集也具有一定的抑制作用，與空白組相比有顯著性差異，但抑制作用較弱，為13.5%。而大黃酚、大黃素、大黃素甲醚、黃芩苷、苦杏仁苷、芍藥苷和甘草酸在2 nmol·L-1時對ADP誘導的體外血小板聚集的作用與空白組相比均無顯著性差異，抑制率均小于10%。

圖2 化合物對血小板聚集的抑制作用（Mean±SD,n=5）

3 討論

中藥復方制劑是在中醫理論指導下由兩味或以上藥物配伍而成的[14]，其成分的豐富性和復雜性在帶來功效多樣性的同時，也給其藥效物質基礎的確定與作用機制的探索帶來了挑戰。而中藥復方制劑成分-藥效活性間的關聯研究卻是中醫藥現代化研究的關鍵領域之一，是中藥安全性、有效性和質量控制的基礎[15]。大黃?蟲丸作為《金匱要略》中的經典名方已在臨床使用多年，大量臨床相關研究都已提示其具有抗凝血等的相關作用[6-9]，但在大黃?蟲丸復雜的組分中，究竟是哪個或哪些組分發揮了抗凝血的相關作用以及是通過哪些機制發揮的作用，暫未有明確的文獻報道。因此本文通過分子對接的虛擬篩選以及血小板聚集的初步試驗將大黃?蟲丸中的9種主要成分與抑制ADP誘導的血小板聚集這一功效進行了關聯性篩選，得到了大黃酸和蘆薈大黃素與P2Y1和P2Y12受體介導的血小板聚集間聯系，初步確定了與抑制P2Y1和P2Y12受體介導的血小板聚集這一功效相關的大黃?蟲丸中的相關功效成分，為大黃?蟲丸這一經典名方的功效物質基礎研究提供了新的理論和實驗依據，有利于進一步明確其“臨床療效-活性成分-作用機制”間的關聯，以指導和拓展大黃?蟲丸這一經典名方的臨床應用。

本文首先采用分子對接的方法對大黃?蟲丸中具有潛在抗血小板聚集作用的成分進行了篩選。此次分子對接中選用的受體為P2Y受體家族中的P2Y1和P2Y12受體。P2Y1和P2Y12受體是P2Y受體家族中主要分布在血小板細胞膜上是一類受體，與血小板聚集密切相關[16-17]。在凝血過程中，P2Y1跨膜受體會首先被ADP激活，觸發細胞內鈣動員，引起血小板變形，發生快速可逆的血小板聚集。隨后P2Y12受體會繼續激活后引發更為強烈持久的血小板聚集。另外P2Y1和P2Y12受體的激活還可增強其他不同機制的血小板活化作用，從而達到凝血和止血的目的。由于P2Y1和P2Y12受體在血小板活化和聚集中發揮的重要作用，因此本文選擇了這兩個受體進行抗血小板聚集化合物的篩選。而分子對接中選用的小分子配體則是已有文獻報道的大黃?蟲丸中大黃酚、大黃素、大黃酸、大黃素甲醚、蘆薈大黃素、黃芩苷、苦杏仁苷、芍藥苷和甘草酸這9種含量較高特征性成分[10-11]。

隨后，為了更好的尋找與P2Y1和P2Y12兩種受體的自帶配體結合方式更為相似的小分子配體，本文對各小分子配體與P2Y1和P2Y12受體的分子間相互作用進行了分析。結果顯示，在與P2Y1受體的分子對接的9種成分中，甘草酸、黃芩苷和大黃素的結合位置和分子間作用力與P2Y1受體自帶配體MRS 2500較為接近，主要結合在以Tyr110、Arg195、Arg287、Tyr303和Arg310等形成的結合口袋中，說明甘草酸、黃芩苷和大黃酸具有較大的通過抑制P2Y1的活性減少血小板聚集的潛力。

在P2Y12受體與大黃?蟲丸中9種含量較高特征性成分的分子對接結果中，僅大黃酸與P2Y12受體的結合能與自帶配體AZJ的結合能較為接近，且結合口袋較為相似，在由Tyr105、Tyr109、Val190、和Asn191等形成的結合口袋中進行結合，其余結合位置與其自帶配體AZJ的結合位點存在差距，說明與其他主要成分相比，大黃酸通過抑制P2Y12抑制血小板活性的潛力稍高。

另外，大黃酚、大黃素、大黃素甲醚、蘆薈大黃素和大黃酸等主要來源于大黃的單體成分，因結構較為類似，與P2Y1和P2Y12受體結合時，其結合位點以及與受體相互作用的分子間作用力也較為相似，與P2Y1受體主要結合在以Tyr110、Tyr111、Thr115、Arg128、Arg195、Cys202、Asp204、Arg287和Arg310等殘基形成的結合口袋中；與P2Y12受體結合主要結合在Tyr105、Tyr109、Asn159和Asn191等殘基形成的結合口袋中，因此結合能也較為接近。

在對大黃?蟲丸中大黃酚、大黃素、大黃酸、大黃素甲醚、蘆薈大黃素、黃芩苷、苦杏仁苷、芍藥苷和甘草酸這9種含量較高的特征性成分的抗血小板聚集的驗證實驗中，由于部分化合物水溶性較差，為保證化合物能夠全部溶解，實驗采用了2 nmol·L-1這一終濃度進行試驗。結果顯示僅大黃酸對ADP誘導的血小板聚集有較好的抑制作用，抑制率接近50%，這一結果與上述采用分子對接進行的虛擬篩選結果基本一致。而甘草酸和黃芩苷雖在分子對接中與P2Y1的結合口袋與MRS 2500有一定的相似，但是在血小板聚集中對ADP誘導的血小板聚集卻無明顯的抑制作用，推測產生此現象可能有以下三種原因，其一可能是甘草酸和黃芩苷對血小板的抑制作用的機制不僅僅為對P2Y1的作用，還存在其他的作用通路，比如對血小板膜糖蛋白PAC-1（GPⅡb/Ⅲa復合物）相關通路的抑制作用[18]，并且依賴其他通路產生的對血小板活化的抑制作用可能發揮著更主要的作用，因此在本文選用ADP誘導的血小板聚集模型中未能觀察到；其二可能是化合物對P2Y1或P2Y12受體發揮藥理作用可能還涉及其他未知機制，在本文的分子對接中未加入這些機制；其三，還可能是本次實驗所使用的甘草酸和黃芩苷的濃度未能達到發揮作用的濃度，上述這些因素都有可能導致甘草酸和黃芩苷分子對接模擬結果與血小板聚集得實際實驗結果不一致。此外，在甘草酸與P2Y12受體的分子對接中，其結合位置與自帶配體AZJ的結合位置相比差異卻較大，且結合能與自帶配體相比較高，可以推斷其與P2Y12受體的作用方式與P2Y12自帶配體AZJ的相差較大，也可能是導致甘草酸分子對接模擬結果與血小板聚集的實驗結果不一致的可能原因。因此本文還存在一些不足之處，比如在對大黃?蟲丸中主要成分的抗血小板作用的驗證，僅采用了一個誘導劑和一個濃度進行了體外的初步驗證，因此為更加細致的闡述這些成分抑制血小板作用的藥效及機制，還需要在后續的實驗中選擇不同驗證模型以及不同的濃度進行更為詳細的驗證及機制探索。

綜上所述，本文將分子對接應用到大黃?蟲丸主要成分的抗血小板聚集的虛擬篩選，選用血小板膜上的P2Y1和P2Y12受體為抗血小板聚集的靶點，從大黃?蟲丸已有文獻報道的9種單體成分中，篩選得到與P2Y1受體結合能較低的為甘草酸、黃芩苷和大黃酸，與P2Y12受體結合較好的為大黃酸、大黃酚、大黃素、大黃素甲醚和蘆薈大黃素，并且這些化合物與P2Y1和P2Y12受體自帶配體的結合位點相似度較高。后續經血小板聚集實驗的驗證結果證實，終濃度為2 nmol·L-1的大黃酸對ADP誘導的血小板聚集與空白組相比具有顯著的抑制作用。同時蘆薈大黃素也具有一定的抑制作用。由此推測，大黃酸和蘆薈大黃素可能是大黃?蟲丸中基于P2Y1及P2Y12受體通路的抑制血小板聚集的主要活性成分。