基于指紋圖譜和網絡藥理學的芍藥甘草湯抗肝損傷活性成分及含量測定研究＊

王迎春，馬永犇，甄亞欽，王 夢，田 偉，王凱歌，吳玲芳＊＊，牛麗穎＊＊

（1.河北中醫學院藥學院 石家莊 050091；2.河北省中藥配方顆粒技術創新中心 石家莊 050091；3.中藥材品質評價與標準化河北省工程研究中心 石家莊 050091）

肝臟是人體新陳代謝和解毒的重要器官，容易受各種化學物質影響導致肝損傷。目前全球肝損傷人群數量不斷攀升，長期肝損傷會演化成肝硬化、肝癌等疾病，嚴重威脅著人類的生命。目前市面上抗肝損傷的藥物如多烯磷脂酰膽堿、還原型谷胱甘肽、甘草酸二銨、復方甘草酸苷、異甘草酸鎂、雙環醇和六味五靈片等均存在不同程度的副作用，從傳統藥物中尋找高效低毒的抗肝損傷藥物，已經成為當前中醫藥工作者的重要任務[1]。

芍藥甘草湯是醫圣張仲景《傷寒論》中的名方，以芍藥合甘草滋養陰血，通行經脈而治療血虛身痛、脘腹氣血不足之疼痛等癥，且《傷寒論》中多個方劑均有芍藥甘草配伍使用，如桂枝加芍藥湯、桂枝新加湯、小建中湯等[2]。《醫學正傳》記載：“四時腹痛，芍藥甘草湯主之。”《醫宗必讀》有云：“芍藥甘草湯，一名戊己湯，治腹痛如神。芍藥（四錢），甘草（二錢）。酸以收之，甘以緩之。”

芍藥甘草湯中芍藥酸寒，養血斂陰，柔肝止痛；甘草甘溫，健脾益氣，緩急止痛。二藥相伍，酸甘化陰，調和肝脾，有柔筋止痛之效，因此芍藥甘草湯藥理作用研究也多集中在鎮痛方面[3-6]。然本課題組前期研究發現芍藥甘草湯有明顯的保肝作用，芍藥甘草湯連續灌胃14天后，給藥組大鼠血清丙氨酸氨基轉移酶（Alanine aminotransferase,ALT）、天門冬氨酸氨基轉移酶（Aspartate aminotransferase,AST）、血清堿性磷酸酶（Alkaline phosphatase ALP）、總膽紅素（Total bilirubin,TBIL）水平顯著低于肝損傷模型組，肝臟組織病理學結構得到顯著改善。宋軍等[7]也發現芍藥甘草湯的提取物芍甘多苷能減輕化學性和免疫性肝損傷，具有明顯的保肝作用，可用于治療慢性乙型肝炎，但芍藥甘草湯抗肝損傷活性成分尚不明確，不利于其質量控制指標性成分的確立。

中藥指紋圖譜結合化學計量學研究，可以在整體觀的基礎上篩選出最能反映中藥質量的標志性成分，已經大量用于中藥質量控制指標性成分的確定[8]。網絡藥理學多基因、多靶點的特點與中醫藥多成分、多靶點的特點有異曲同工之妙，在中醫藥現代化研究中具有較高的應用價值[9-10]。本研究采用指紋圖譜結合化學計量學，整合網絡藥理學研究結果，探索芍藥甘草湯抗肝損傷活性的主要指標性成分。針對化合物的最大吸收波長，采用多波長切換方法對主要指標性成分進行含量測定，為基于藥理活性的中藥質控指標成分的選擇提供一種新思路。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

Waters超高效液相色譜儀（美國Waters，ACQUITY H-Class系統，四元溶劑管理器（QSM）、自動進樣器（SMFTN）、二極管陣列檢測器（PDA）、高溫柱溫箱（CHA）），Waters ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.7μm，美國Waters），電子分析天平（型號：CPA225D、BSA224S-CW，北京賽多利斯）。

對照品：沒食子酸（Gallic acid,GA，批號：110831-201605，純度：91.5%）、甘草苷（Liquiritin,LQ，批號：111610-201607，95.01%）購自中國食品藥品檢定研究院；甘 草 酸（Glycyrrhizic acid,GCA，批 號：MUST-18060805，純度≥98.01%）購自成都曼思特生物科技有限公司；甘草素（Liquiritigenin,LQG，批號：DST171014-010，純度：99.65%）購自成都德思特生物技術有限公司；異甘草苷（Isoliquiritin,ILQ，批號：8101805，純度度：98.76%）、苯甲酰芍藥苷（Benzoylpaeoniflorin,BPA，批號：18020501，純度≥98.0%）購自成都普菲德生物技術有限公司）；芍藥苷（Paeoniflorin,PA，批號：PS0220-0025MG，純度≥98.0%）、芍藥內酯苷（Albiflorin,AB，批號：PS1168-0025MG，純度≥98.0%）、芹糖異甘草苷（Isoliquiritinapioside,ILQA，批號：PS2186-0020MG，純度≥98.0%）購自成都普思生物科技股份有限公司。乙腈、乙酸為色譜純（美國默克），水（屈臣氏），其他試劑均為分析純。

白芍、甘草（炙）飲片由河北省藥品檢驗院的孫寶惠老師鑒定，白芍為毛茛科植物芍藥Paeonia lactifloraPall.的干燥根，甘草（炙）為豆科植物甘草Glycyrrhiza uralensisFisch.的干燥根及根莖。樣品統一存放于河北中醫學院中藥配方顆粒工程技術研究中心。15批芍藥甘草湯編號為S1～S15，具體藥材產地及批號信息見表1。

表1 藥材產地信息

1.2 方法

1.2.1色譜條件

二元溶劑洗脫：A：乙腈，B：0.1%乙酸水，梯度洗脫（0-3 min，5-15%A；3-5 min，15-18%A；5～10 min，18-24% A；10～14 min，24-26% A；14-25 min，26-45% A；25-29 min，45-100% A；29-30 min，100-5% A；30-35 min，5%A）；體積流量0.3 mL·min-1；柱溫35℃；采用切換波長方法對不同化學成分峰面積進行采集，檢測波長：237 nm（芍藥內酯苷、芍藥苷、苯甲酰芍藥苷、甘草酸），270 nm（沒食子酸、甘草苷、甘草素），370 nm（芹糖異甘草苷、異甘草苷、新異甘草苷）；進樣量為4.0μL。

1.2.2供試品溶液的制備

《傷寒論》記載：白芍藥、甘草各四兩（炙）。上二味，以水三升，煮取一升五合，去滓，分溫再服。參考古代度量衡描述，按照漢代一兩=3 g，一升=200 mL，一合=20 mL計算。取白芍和炙甘草各12 g（四兩），加水600 mL（三升）：煮至300 mL（一升五合），濾過（去滓），濾液冷卻，濃縮至約50 mL（1 g∶2 mL）的浸膏，冷凍干燥，即得芍藥甘草湯水煎液凍干粉，凍干粉平均得率為23%。精密稱取芍藥甘草湯凍干粉適量，50%甲醇溶解，并配制成4.00 mg·mL-1的溶液，搖勻，0.22μm濾膜濾過。

1.2.3對照品溶液的制備

精密稱取GA、AB、PA、LQ、ILQA、ILQ、LQG、BPA和GCA對照品適量，用50%甲醇溶解，配制成質量濃度 分 別 為50.0、80.0、439.5、144.5、24.0、24.5、10.0、15.5、303.5 μg·mL-1的混合對照品溶液，置于4℃冰箱內保存，備用。

1.2.4指紋圖譜方法學考察（1）精密度試驗

精密稱取樣品（S1）0.1 g制備成供試品溶液，連續進樣6次，選擇色譜峰面積較大、含量較高且各批次均穩定出現的峰為參照峰，并計算各共有峰的相對保留時間（Rt）和相對峰面積的RSD值。

（2）穩定性試驗

精密稱取樣品（S1）0.1 g制備成供試品溶液，分別于制備后的0、2、8、12、18、24 h進樣，記錄各峰的峰面積，以6號色譜峰為參照峰，計算各共有峰的Rt及相對峰面積的RSD值。

（3）重復性試驗

精密稱取樣品（S1）6份，每份約0.1 g制備成供試品溶液，進樣，記錄各峰峰面積，以6號色譜峰為參照峰，計算各共有峰的Rt和相對峰面積的RSD值。

（4）指紋圖譜建立及相似度評價

制備S1-S15供試品溶液，進樣并記錄樣品信息。將樣品信息導入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統2012版”，建立芍藥甘草湯指紋圖譜并進行相似度評價分析。

（5）聚類分析

以15批樣品的共有峰面積為變量，導入SPSS 26.0軟件，對15批樣品進行系統聚類。（6）主成分分析

以15批樣品的共有峰面積為變量，導入SPSS 26.0軟件，對15批樣品進行主成分分析。

（7）正交偏最小二乘-判別分析

將15批樣品的共有峰峰面積導入SIMCA-P 13.0軟件，進行偏最小二乘判別分析。

1.2.5網絡藥理學及分子對接驗證

（1）活性成分及靶點的篩選

基于可測性及可溯性的原則篩選活性成分，目前報道的芍藥甘草湯活性成分主要為芍藥苷、芍藥內酯苷、苯甲酰芍藥苷、芍藥新苷、甘草酸、甘草素、甘草苷、異甘草苷和芹糖異甘草苷等，結合指紋圖譜篩選出來的質量標志性成分，再結合化合物在單味藥中的含量、研究熱度等標準篩選芍藥甘草湯中的活性成分。

基于TCMSP（http://lsp.nwu.edu.cn/index.Php）、Swiss Target Prediction（http://www.swisstargetprediction.ch/）、STITCH（http://stitch.embl.de/）數據庫獲得活性成分的潛在作用靶點。基于Genecards（https://www.genecards.org/）、OMIM（https://omim.org/search/advanced/geneMap）、OncoDB.HCC（http://oncodb.hcc.ibms.sinica.edu.tw/index.htm）和Liverome（http://liverome.kobic.re.kr/）數據庫獲得肝損傷相關靶點。通過R語言對化學成分的作用靶點與肝損傷相關靶點取交集，得到共有靶點。

（2）成分-靶點網絡構建

將活性成分和共有靶點導入Cytoscape軟件，構建“活性成分-靶點”可視化網絡圖。

（3）蛋白質-蛋白質相互作用的網絡構建與關鍵靶點篩選

將共有靶點導入String（https://string-db.org/）數據庫，限定物種為“人”，設置最低要求互動分數為0.8，構建蛋白相互作用關系，運用R軟件計算排名前10的關鍵靶點。

（4）GO生物過程富集分析

通過DAVID數據庫，以人類基因為背景，對交集靶點基因進行GO生物過程富集分析（P＜0.01）。

（5）KEGG信號通路富集分析

通過DAVID數據庫，以人類基因為背景，對交集靶點基因進行KEGG生物過程富集分析（P＜0.01）。

（6）分子對接驗證

使用Autodock Vina軟件對代表性成分與關鍵靶點的相互作用進行分子對接計算，結果通過結合自由能來表示，結合能小于0，表明配體與受體可以自發結合，能量越低表明兩者產生作用的可能性越大。一般認為，當結合能小于-5.0 kcal·mol-1時，化合物與靶點結合活性較佳。

1.2.6多成分含量測定

（1）線性關系考察

精密吸取“1.2.2”項下混合對照品溶液1、2、3、5、10 mL至10 mL量瓶中，加甲醇溶解至刻度，按“1.2.1”項下色譜條件進行測定，記錄峰面積。以各對照品進樣濃度對峰面積作圖，進行回歸分析。

（2）精密度試驗

精密吸取混合對照品溶液，按“1.2.1”項下色譜條件，連續進樣6次，測定峰面積并計算RSD值。

（3）穩定性試驗

精密稱取樣品（S1）0.1 g制備成供試品溶液，按“1.2.1”項下色譜條件，分別于0、2、8、12、16、24 h進樣分析，測定峰面積并計算RSD值。

（4）重復性試驗

精密稱取樣品（S1）0.1 g，共6份，制備成供試品溶液，再按“1.2.1”項下色譜條件，測定峰面積，計算平均含量的RSD值。

（5）加樣回收試驗

分別稱取已知含量的樣品9份，每份約0.05 g，按照樣品含量的50%、100%、150%加入各對照品，每個濃度3份，計算各成分的含量和平均加樣回收率。

2 結果和分析

2.1 指紋圖譜的方法學考察結果

2.1.1精密度試驗

根據1.2.4中（1）的條件，僅有6號色譜峰能滿足各項要求，因此以6號色譜峰為參照峰，各共有峰的Rt的RSD值在0.07-1.48%，相對峰面積的RSD值在0.89-2.78%，提示儀器精密度良好。

2.1.2穩定性試驗

各共有峰的Rt的RSD值在0.07-1.97%，相對峰面積的RSD值在0.46-2.72%，提示樣品溶液在24 h內穩定性良好。

2.1.3重復性試驗

各共有峰的Rt的RSD值在0.08-1.55%，相對峰面積的RSD值在0.23-2.89%，提示方法重復性良好。

2.1.4指紋圖譜建立及相似度評價

共標定17個共有峰，生成對照指紋圖譜R，見圖1。S1-S15與R相似度均在0.90以上，表明甘草、白芍兩味藥材雖然產地不同，但所含有的化學成分基本相似，同時表明所建立的指紋圖譜質量穩定，可反映其指紋特征。

圖1 S1-S15樣品UPLC指紋圖譜

2.2 聚類分析

采用SPSS 26.0數據分析軟件，對15批樣品的共有峰面積進行系統聚類，采用組間連接法，測量區間為平方歐氏距離，聚類結果見圖2。當聚類距離在10-15之間時候，15批樣品可分成3類，其中S1、S3、S9、S10、S12聚為一類，S6、S7、S8、S13聚為一類，S2、S4、S5、S11、S14、S15聚為一類。

圖2 芍藥甘草湯聚類分析圖

2.3 主成分分析

以15批樣品的17個共有峰面積為變量，導入SPSS 26.0軟件，以特征值＞1為提取標準，得到4個主成分，累計方差貢獻率為89.421%，說明前4個成分可以反映芍藥甘草湯指紋圖譜中的大部分化學信息。各色譜峰系數反映了成分貢獻率大小，排名前9的成分為別為峰10（ILQ A）、峰8（LQ）、峰11（ILQ）、峰6（PA）、峰14（BPA）、峰5（AB）、峰1（GA）、峰12、峰4。

2.4 正交偏最小二乘-判別分析

將15批樣品中17個共有峰峰面積導入SIMCA-P 13.0軟件，進行OPLS-DA建模分析，見圖3。15批樣品分為3組，與聚類分析結果一致，且分離顯著，說明不同產地樣品在組分上存在一定差異。并結合VIP值篩選差異性標志物，差異性標志物VIP見圖4。從圖4可以更直觀看出各色譜峰的影響程度排序依次為峰10（ILQ A）＞峰8（LQ）＞峰16（GCA）＞峰11（ILQ）＞峰17＞峰15＞峰13（LQG）＞峰2＞峰7＞峰3＞峰12＞峰14＞峰1＞峰4＞峰5＞峰9＞峰6。說明這些成分起關鍵性作用。

圖3 OPLS-DA得分圖

圖4 OPLS-DA VIP值圖

綜合主成分分析及正交偏最小二乘-判別分析結果，初步篩選出PA、AB、BPA、GA、LQ、ILQ A、ILQ、NILQ、LQG和GCA 10個成分對方劑藥效影響較顯著。

2.5 網絡藥理學及分子對接驗證

2.5.1活性成分及靶點的篩選

基于可測性及可溯性的原則篩選活性成分，從芍藥甘草湯中共篩選出潛在10活性成分作為候選化合物。基于TCMSP、Swiss Target Prediction、STITCH數據庫共獲得活性成分潛在作用靶點172個。基于Genecards、HPO、OMIM、OncoDB.HCC和Liverome數據庫中共找到肝損傷相關靶點1311個。藥物的靶點和疾病的靶點取交集，共得到79個共有靶點，見圖5。

圖5 芍藥甘草湯抗肝損傷相關靶點Venn圖

2.5.2成分-靶點網絡構建

將10個化合物和79個共有靶點導入Cytoscape軟件，構建“活性成分-靶點”可視化網絡圖，如圖6所示，該網絡由90個節點組成，其中紅色節點代表：肝損傷。藍色節點代表疾病相關靶點。10個紫色節點代表芍藥甘草湯抗肝損傷的主要活性成分PA、AB、BPA、GA、LQ、ILQ A、ILQ、NILQ、LQG和GCA。217條邊代表化學成分與靶點的相互作用。每個潛在活性成分均能作用于多個靶點，體現了芍藥甘草湯的多成分、多靶點作用。

圖6 芍藥甘草湯化合物-靶點網絡圖

2.5.3蛋白質-蛋白質相互作用的網絡構建與關鍵靶點篩選

將79個靶點導入String數據庫，限定物種為“人”，設置最低要求互動分數為0.8，構建蛋白相互作用關系，見圖7。同時保存string_interactions.tsv文件，運用R軟件計算排名前30的關鍵靶點，如圖8所示，按度值大小，排名前10的關鍵靶點：IL-6、VEGFA、CASP3、STAT3、ESR1、PTGS2、HSP90AA1、MMP9、KDR和IL-2，提示這些關鍵靶點在芍藥甘草湯抗肝損傷作用中發揮關鍵作用。

圖7 蛋白互作網絡(PPI)分析

圖8 蛋白相互作用網絡中關鍵靶點篩選

2.5.4 GO生物過程富集分析

通過DAVID（https://david.ncifcrf.gov/）數據庫，以人類基因為背景對79個靶點所對應的基因進行GO生物過程富集分析（P＜0.01）。結果顯示，生物過程共富集得到122項，主要涉及：核受體活性（GO：0004879），配體激活的轉錄因子活性（GO：0098531），蛋白質酪氨酸激酶活性（GO：0004713），跨膜受體蛋白酪氨酸激酶活性（GO：0004714），組蛋白脫乙酰基酶活性H3-K14特異性（GO：0031078），NAD依賴性組蛋白脫乙酰基酶活性（GO：0032041），見圖9。

圖9 生物學過程（GO）富集分析

2.5.5 KEGG信號通路富集分析

通過DAVID數據庫，以人類基因為背景，對79個靶點所對應的基因進行KEGG生物過程富集分析（P＜0.01），共得到61條生物過程，篩選出前20條信號通路，其中排名靠前的10條信號通路分別為：IL-17信號通路（hsa04657），MAPK信號通路（hsa04010），PI3K-Akt信號通路（hsa04151），癌癥相關蛋白聚糖（hsa05205），麻 疹（hsa 05162），EGF信 號 通 路（hsa01521），TNF信號通路（hsa04668），軍團菌病（hsa05134），癌癥相關的MicroRNAs（hsa05206），前列腺癌（hsa05215），膀胱癌（hsa05219）等信號通路，見圖10。

圖10 KEGG信號通路富集柱狀圖和氣泡圖

2.5.6分子對接驗證

研究認為白芍的指標性成分為芍藥苷、芍藥內酯苷以及苯甲酰芍藥苷，甘草的代表性成分為甘草酸、甘草苷和甘草素，結合成分-靶點網絡構建篩選出來的主要活性成分，本研究采用Autodock Vina軟件對6個代表性成分芍藥苷，芍藥內酯苷，苯甲酰芍藥苷，甘草苷，甘草素，甘草酸與核心靶點的相互作用進行分子對接計算。6個代表性成分與5個核心靶點的對接的結合自由能皆小于-5.0 kcal·mol-1，表明成分與核心靶點均有較好的結合活性，結果見表2。

表2 分子對接結合能

2.6 多成分含量測定

2.6.1線性關系考察

混合對照品溶液色譜圖如圖11，以各對照品進樣濃度對峰面積作圖，進行回歸分析，得標準曲線方程。結果見表3。

圖11 UPLC色譜圖

表3 線性關系考察結果

2.6.2精密度試驗

精密吸取混合對照品溶液，按“1.2.1”項下色譜條件，連續進樣6次，GA、AB、PA、LQ、ILQA、ILQ、LQG、BPA和GCA峰 面 積RSD值 依 次 為0.59%、0.16%、0.13%、0.07%、0.38%、0.66%、0.29%、1.95%、0.18%（n=6），RSD＜2%，提示精密度符合要求。

2.6.3穩定性試驗

GA、AB、PA、LQ、ILQA、ILQ、LQG、BPA和GCA的峰面積RSD值依次為1.42%、1.05%、0.60%、0.27%、1.93%、1.29%、0.74%、1.18%、0.39%（n=6），RSD＜2%，表明樣品24 h內穩定性良好。

2.6.4重復性試驗

GA、AB、PA、LQ、ILQA、ILQ、LQG、BPA和GCA的平均含量RSD值依次為1.29%、1.09%、0.59%、0.39%、0.86%、1.30%、0.80%、0.28%、0.41%（n=6），RSD＜2%，表明方法的重復性良好。

2.6.5加樣回收試驗

GA、AB、PA、LQ、ILQA、ILQ、LQG、BPA和GCA平均加樣回收率分別為102.93%、100.13%、96.54%、101.39%、99.77%、98.83%、104.38%、101.93%、103.72%，表明方法準確度良好。

2.6.6樣品含量測定

S1-S15樣品中GA、AB、PA、LQ、ILQA、ILQ、LQG、BPA和GCA的含量見表4。其中LQ、GCA成分含量差異較大，表明不同產地及批次間存在差異，主要受甘草原藥材質量的影響。

表4 15批芍藥甘草湯含量測定結果（mg·g-1）（n=6）

3 討論

目前芍藥甘草湯藥理活性研究多集中于鎮痛方面，抗肝損傷的文獻報道較少，我們前期研究發現芍藥甘草湯具有很好的抗肝損傷作用，芍藥甘草湯相關制劑如健肝樂顆粒等也已經被運用于臨床治療慢性乙型肝炎等肝臟疾病，但是芍藥甘草湯抗肝損傷活性成分和作用機制尚不明確。本研究采用指紋圖譜結合化學計量學整合網絡藥理學研究方法，探索芍藥苷甘草湯抗肝損傷活性的主要指標性成分，在此基礎上建立指標性成分的含量測定方法，為基于抗肝損傷活性的芍藥甘草湯質量標準的建立提供依據。

本研究首先建立了芍藥甘草湯UPLC指紋圖譜，采用全波長掃描，結果不同類型的成分最大吸收波長差異較大，遂采用多波長切換法，分別在237 nm（4-9 min、20-35 min）、270 nm（0-4 min、9-13 min、15-20 min）、370 nm（13-15 min）下進行檢測，可較為全面地反映芍藥甘草湯化學成分信息。聚類分析顯示第一類中甘草的產地均為甘肅，第二類中甘草的產地均新疆維吾爾自治區，第三類中甘草的產地均為內蒙古自治區，因此推測甘草產地不同，可能會影響樣品聚類的結果，進而影響整個方劑的療效。主成分分析及正交偏最小二乘-判別分析結果，初步篩選出潛在的生物標記物。在此基礎上，基于可測性和可追溯性，以網絡藥理學結合分子對接驗證，篩選出芍藥甘草湯抗肝損傷的藥效物質：芍藥苷、芍藥內酯苷、苯甲酰芍藥苷、沒食子酸、甘草苷、芹糖異甘草苷、異甘草苷、新異甘草苷、甘草素、甘草酸等10個化學成分，為芍藥甘草湯抗肝損傷主要活性成分。

目前已有文獻報道白芍中主要成分芍藥苷、芍藥內酯苷、苯甲酰芍藥苷對四氯化碳致小鼠急性肝損傷有明顯保護作用，可以改善肝臟病理變化，降低肝損傷小鼠血清中ALT、AST、TBIL、ALP、γ-谷氨酰轉肽酶（γ-Glutamyl transpeptidase,γ-GT）、總膽汁酸（Total bile acids,TBA）水平，升高肝臟組織勻漿上清中超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase,SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（Glutathione peroxidase,GSH-Px）水平，降低丙二醛（Malondialdehyde,MDA）水平[11-12]。甘草中主要成分甘草苷、異甘草苷、甘草素、甘草酸等已經部分運用于臨床，可以明顯降低肝損傷患者的轉氨酶，患者血清的ALP、ALT、AST及TBIL水平均低于治療前，IL-6、IL-1β、TNF-α水平均低于治療前，差異均有統計學意義（P＜0.05）[13-16]。

在芍藥甘草湯抗肝損傷的蛋白相互作用網絡構建與關鍵靶點篩選中，共發現79個靶點，按照Degree值從大到小進行排序，Degree值越大，越有可能是關鍵靶點，排名 前10的關鍵靶點：IL-6、VEGFA、CASP3、STAT3、ESR1、PTGS2、HSP90AA1、MMP9、KDR和IL-2，也均有文獻報道這些靶點與肝損傷的發生發展相關[17-21]。例如肝組織HE染色顯示阻斷血清IL-6表達后，肝細胞壞死明顯減輕，壞死灶數量減少，肝細胞凋亡減少，抑制肝組織IL-6表達可明顯減輕刀豆蛋白A（ConA）和油酸引起的急性肝損傷[17-20]。肝細胞通過上調VEGFA促進肝細胞再生[20]，CASP3直接與肝細胞凋亡相關，JAK2/STAT3信號通路上的STAT3基因表達下調也可以明顯降低ConA所致的肝細胞損傷[17-21]。

目前已有文獻報道芍藥甘草湯中3-7種化學成分含量測定方法，但是各類成分的最大吸收波長不一致，采用單一波長進行多個成分含量測定不太合理，本研究采用切換波長的方法進行數據采集，這是一種方法上的改進；另外目前已有文獻應用網絡藥理學方法研究芍藥甘草湯治療痛經、胃痛、神經痛等各種疼痛病癥的作用機制及活性成分，但并沒有文獻將指紋圖譜與網絡藥理學結合來研究芍藥甘草湯抗肝損傷作用的活性成分，然后對活性成分進行含量測定。因此本研究首次采用指紋圖譜結合化學計量學聯合網絡藥理學探索芍藥甘草湯抗肝損傷的活性成分，然后采用UPLC切換波長法快速測定主要活性成分的含量，為基于抗肝損傷活性的芍藥甘草湯質量控制提供依據，同時也為中藥質量控制指標性成分的選擇提供了一種新思路。