一清顆粒聯合環磷酰胺對三陰性乳腺癌荷瘤小鼠移植瘤的影響＊

邱劍飛，張知音，趙 鵬，李 珂，吳小森，李 靜，楊 玨＊＊，李艷梅＊＊

（1.省部共建藥用植物功效與利用國家重點實驗室 貴陽 550014；2.貴州省中國科學院天然產物化學重點實驗室貴陽 550014；3.貴州醫科大學基礎醫學院現代病原生物學特色重點實驗室 貴陽 550025；4.貴航貴陽醫院 貴陽 553009；5.湖南省湘西自治州煙草公司永順縣分公司 湘西自治州 416000）

根據世界衛生組織國際癌癥研究機構（IARC）發布的2020年全球最新癌癥負擔數據，2020年，新發女性乳腺癌病例（226萬例）首次超過肺癌（221萬例），成為全球第一大癌癥。中國是乳腺癌大國，2020年新發乳腺癌患者約42萬例，導致近12萬人死亡[1]。臨床上根據患者雌激素受體（estrogen receptor，ER）、孕激素受體（progesterone receptor，PR）和人類表皮生長因子受 體-2（human epidermal growth factor receptor-2，HER-2）表達情況的不同把乳腺癌分為3種類型，包括激素受體陽性乳腺癌、表皮生長因子受體-2陽性乳腺癌和三陰性乳腺癌（triple-negative breast cancer，TNBC）[2]。激素受體陽性乳腺癌是指患者ER或PR表達為陽性，HER-2表達為陰性。表皮生長因子受體-2陽性乳腺癌是指患者的HER-2表達為陽性，同時ER和PR表達均為陰性。三陰性乳腺癌是指患者ER、PR及HER-2表達均為陰性，也是乳腺癌中具有高度轉移特性的一種亞型。

手術治療是三陰性乳腺癌治療的首選方案[3]。對于全身情況較差，年老體弱不能耐受手術的乳腺癌患者，需要制定相應的化療及放療方案進行治療[4]。無論是化療還是放療，都存在作用靶點單一、治療效果有限的弊端，同時會帶來一些副作用，患者會出現一定程度的身體損傷，比如臨床上治療過程中因患者個人體質不同可能會出現惡心、嘔吐、頭暈、頭痛等不良反應。環磷酰胺是乳腺癌治療中的一種常見的烷化劑類化療藥物，與DNA發生烷化，形成交叉聯結，可直接破壞DNA的結構，誘導腫瘤細胞發生凋亡和抑制腫瘤細胞增殖，但其對機體正常細胞也會產生毒副作用，如骨髓抑制和免疫抑制等[5]。所以，目前在三陰性乳腺癌的治療方面可以選擇的方案有限。因此，開發有效治療三陰性乳腺癌的創新藥物或新的治療策略迫在眉睫。

近年來，基礎和臨床研究結果顯示部分中藥及其活性成分與環磷酰胺聯用具有良好的增效減毒作用，并且能夠延長患者生存期[6-8]，可見中醫藥在現代腫瘤防治中扮演著重要角色。一清顆粒源自張仲景《金匱要略》之三黃瀉心湯，由大黃、黃芩、黃連三味藥組成，具有清熱瀉火解毒、化瘀涼血止血之效[9]，臨床用于火毒血熱所致的身熱煩躁、目赤口瘡、咽喉牙齦腫痛和咽炎等。另有研究表明，一清顆粒中的大黃、黃芩和黃連三味藥均能表現出一定的抗三陰性乳腺癌的作用[10-12]，而三味藥聯合用藥是否能夠發揮協同作用、抑制三陰性乳腺癌，目前尚未見報道。以4T1乳腺癌荷瘤小鼠為模型對三陰性乳腺癌進行研究已有較多報道[12-13]。為此本實驗利用小鼠三陰性乳腺癌細胞4T1制備BALB/c乳腺癌荷瘤小鼠模型，以研究一清顆粒單用及與環磷酰胺聯用時對三陰性乳腺癌荷瘤小鼠移植瘤的影響，為臨床抗乳腺癌聯合藥物方案的選擇提供實驗依據，為復方中藥的二次開發提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 細胞

小鼠三陰性乳腺癌4T1細胞系，貴州省中國科學院天然產物化學重點實驗室常規保存。

1.2 實驗動物

雌性BALB/c小鼠，鼠齡4-6周齡，體重18-20 g，購自北京斯貝福生物技術有限公司。動物生產許可證號：SCXK（京）2019-0010。

1.3 藥品與試劑

一清顆粒，規格：每袋7.5 g，批準文號：國藥準字Z20055404，批號：20190605，購自貴州百靈企業集團正鑫藥業有限公司；環磷酰胺注射液，規格：每支3 mg，注冊證號：H20160467，批號：8D229A，自德國Baxter Oncology GmbH公 司。TRIzol購 自 美 國Invitrogen公 司，貨 號：15596-018，逆 轉 錄 試 劑 盒PrimeScript?RT reagent Kit with gDNA Eraser購 自 日本TaKaRa公司，貨號：RRO47Q，熒光定量試劑盒FastStart Universal SYBY Green Master(ROX)購自瑞士羅氏公司，貨號：4913850001。DMEM培養基、胎牛血清、胰酶，均購自美國Gibco公司。

1.4 主要儀器

細胞培養箱（Thermo scientific）生物安全柜（Thermo scientific），倒置顯微鏡（ZEISS公司），臺式離心機（BECKMAN），電子天平（METTLER TOLEDO公司）。NanoDrop 2000超微量分光光度計（Thermo scientific），StepOne PLUS熒光定量PCR儀（ABI）。

1.5 模型構建

取對數生長期4T1小鼠三陰性乳腺癌細胞，用0.25%胰酶和0.02%乙二胺四乙酸（EDTA）消化處理，收集細胞，用DMEM培養基重懸，制備單細胞懸液，調整細胞密度為1×106cell·mL-1，每只小鼠右側第二乳頭脂肪墊皮下注射50μL細胞懸液。

1.6 分組與給藥方案

將成功建立的乳腺癌荷瘤小鼠隨機分為陰性對照組、陽性對照組（環磷酰胺）、實驗組（一清顆粒）和聯合組（一清顆粒+環磷酰胺），每組8只。按照人與動物體表面積換算給藥劑量給與小鼠藥物，陽性對照組每日腹腔注射30 mg·kg-1環磷酰胺，實驗組每日灌胃20 g·kg-1一清顆粒，聯合組每日腹腔注射30 mg·kg-1環磷酰胺+每日灌胃20 g·kg-1一清顆粒。陰性對照組每日灌胃等體積0.9%NaCl+每日腹腔注射等體積0.9%NaCl。

1.7 觀察腫瘤生長體積

從給藥后第1天開始，每隔1天，用游標卡尺測量測量瘤體的長徑（A）和短徑（B），瘤塊體積=0.5×長徑（A）×短徑（B）2。

1.8 測定各組抑瘤率、胸腺指數

采血后，頸椎脫臼法處死各組小鼠，解剖并摘取小鼠的移植瘤塊組織、脾臟和胸腺，精密稱重后計算各組抑瘤率、脾指數和胸腺指數，抑瘤率（%）=[1-陽性對照組（實驗組或聯合組）平均瘤重/陰性對照組平均瘤重]×100%；脾(胸腺)指數=脾(胸腺)重(mg)/體重(g)。

1.9 測定各組中性粒細胞、外周血淋巴細胞和單核細胞的比例

末次給藥結束后，眼眶采血測定血常規，測定各組中性粒細胞、外周血淋巴細胞和單核細胞的比例。

1.10 測定各組荷瘤小鼠腫瘤組織中CD4+T和CD8+T細胞比例

將各組小鼠腫瘤組織在含有1 mg·mL-1I型膠原酶的RPMI-1640培養基中用剪刀剪成2 mm×2 mm的小塊，置于37℃，消化1 h。將組織過2次70 μm的細胞篩，使用紅細胞裂解液進行裂解，PBS清洗2遍，3000 rpm離心5 min，PBS重懸后得到腫瘤組織單細胞混懸液。按照使用說明書，使用Ficoll淋巴細胞分離液，分離得到淋巴細胞。用CytoFLEX流式細胞儀檢測腫瘤淋巴細胞比例，操作如下：將得到的淋巴細胞用2% BSA于4℃封閉30 min，之后取1.0×106細胞（100 μL體積）加入熒光標記的抗小鼠CD4和CD8抗體，離心，PBS重懸后，上機檢測CD4+T細胞和CD8+T細胞的比例。

1.11 RT-PCR技術測定各組瘤組織中IL-6和TNFα mRNA的表達水平

取各組小鼠的腫瘤組織適量，加入1 mL的TRIzol試劑，冰上研磨制成組織勻漿，裂解5 min，加200μL三氯甲烷，上下顛倒2 min，室溫靜置3 min；4℃12000 rpm離心15 min；將上層無色水相轉移到新的EP管中；加等體積異丙醇，混勻，-20℃靜置40 min；4℃12000 rpm離心10 min；棄去上清，用預冷的75%乙醇1.0 mL洗滌沉淀物；4℃7500 rpm離心5min；棄上清；風干5-10 min，用DEPC水溶解沉淀物；取適量溶解后的總RNA，用NanoDrop 2000超微量分光光度計測定RNA濃度。使用TaKaRa逆轉錄試劑盒進行逆轉錄合成cDNA。利用Roche熒光定量試劑盒FastStart Universal SYBY Green Master(ROX)，按照該試劑盒說明書配制反應體系，最后通過StepOne PLUS熒光定量PCR儀擴增檢測各組瘤組織中IL-6和TNF-α mRNA的表達水平，IL-6和TNF-α基因的引物序列設計如下：IL-6上游引物：5’-AGTTGCCTTCTTGGGACTGA-3’，下游引物：5’-TCCACGATTTCCCAGAGAAC-3’；TNF-α上游引物：5’-TATGGCTCAGGGTCCAACTC-3’，下游引物：5’-CTCCCTTTGCAGAACTCAGG-3’。

1.12 測定各組體質量增加率

稱量給藥前和給藥結束后小鼠體質量，計算各組體質量增加率，體質量增加率=（實驗結束后體質量-實驗前體質量）/實驗前體質量×100%。

1.13 統計學處理

使用SPSS 21.0軟件進行統計分析。計量資料用均值±標準差（±s）表示，兩組間比較使用t檢驗，多組間均數比較用單因素多樣本方差分析，計數資料采用卡方檢驗。

2 結果

2.1 對小鼠移植瘤腫瘤體積變化的影響

與陰性對照組相比，陽性對照組和聯合組腫瘤生長速度緩慢，而實驗組效果不明顯，并且聯合組腫瘤生長速度低于陽性對照組。給藥7天后，陽性對照組和聯合組的移植瘤體積與陰性對照組相比均有顯著差異（P＜0.01）。且給藥11天后，聯合組的移植瘤體積與陽性對照組比較，差異具有統計學意義（P＜0.05，P＜0.01），說明一清顆粒與環磷酰胺聯用可以顯著增強環磷酰胺對荷瘤小鼠瘤體積生長的抑制作用。結果見圖1。

圖1 各組荷瘤小鼠瘤體體積變化情況（±s，n=8）

2.2 對各組荷瘤小鼠存活時間的影響

體內實驗結果顯示陰性對照組、陽性對照組、實驗組和聯合組的生存比例分別為37.5%、50%、37.5%和87.5%，并且聯合組與陰性對照組和實驗組相比，差異均具有統計學意義（P=0.03）（P=0.047）。該結果表明一清顆粒和環磷酰胺聯用可以提高荷瘤小鼠的存活率，延長小鼠存活時間（圖2）。

圖2 各組荷瘤小鼠存活時間（n=8）

2.3 對小鼠移植瘤重量和抑瘤率的影響

實驗結果顯示陽性對照組、實驗組和聯合組的抑瘤率分別為60.34%、24.77%和76.46%。與陰性對照組相比，陽性對照組和聯合組的腫瘤重量均顯著降低（P＜0.01），與陽性對照組相比，聯合組的腫瘤重量顯著下降（P＜0.01）且抑瘤率增加。說明一清顆粒與環磷酰胺聯用可增強環磷酰胺的抑瘤效果，見表1和圖3。

表1 各組荷瘤小鼠腫瘤重量及抑瘤率（±s，n=3）

表1 各組荷瘤小鼠腫瘤重量及抑瘤率（±s，n=3）

注：各組間腫瘤重量采用t檢驗，與陰性對照組比，*P＜0.05，**P＜0.01，與陽性對照組比，#P＜0.05，##P＜0.01；抑瘤率采用卡方檢驗，與陽性對照組比，*P＜0.05。

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圖3 各組小鼠瘤體

2.4 對荷瘤小鼠脾指數和胸腺指數的影響

與陰性對照組相比，陽性對照組小鼠的胸腺指數受到明顯抑制（P＜0.05），而脾指數無明顯影響；實驗組和聯合組小鼠胸腺指數和脾指數也均無明顯影響。與陽性對照相比，聯合組小鼠胸腺指數顯著增加（P＜0.01），脾指數無顯著性差異，說明一清顆粒和環磷酰胺聯用可以改善環磷酰胺單獨使用時所抑制的胸腺指數。見表2。

表2 各組荷瘤小鼠脾指數和胸腺指數（±s，n=3）

表2 各組荷瘤小鼠脾指數和胸腺指數（±s，n=3）

注：與陰性對照組比，*P＜0.05，**P＜0.01，與陽性對照組比，#P＜0.05，##P＜0.01。

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2.5 對各組荷瘤小鼠中性粒細胞、外周血淋巴細胞和單核細胞比例的影響

與陰性對照組比較，陽性對照組的小鼠外周血淋巴細胞比例明顯下降（P＜0.05），實驗組和聯用組無顯著性差異。與陰性對照組比較，陽性對照組、實驗組和聯合組的小鼠中性粒細胞比例和單核細胞比例無明顯差異。與陽性對照組比，聯用組可以顯著提高淋巴細胞的比例（P＜0.05），說明一清顆粒可顯著改善環磷酰胺單獨使用時對淋巴細胞比例的抑制作用，見表3。

表3 各組荷瘤小鼠血常規指數（±s，n=3）

表3 各組荷瘤小鼠血常規指數（±s，n=3）

注：與陰性對照組比，*P＜0.05，**P＜0.01，與陽性對照組比，#P＜0.05。

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2.6 對各組荷瘤小鼠腫瘤組織中CD4+T和CD8+T細胞比例的影響

與陰性對照組比較，實驗組和聯合組的腫瘤組織中CD4+T和CD8+T細胞比例明顯增加（P＜0.05，P＜0.01），而陽性對照組無顯著性差異。與陽性對照組比，聯用組可以顯著提高腫瘤組織中的CD4+T和CD8+T細胞比例（P＜0.01），見表4和圖4。

圖4 各組荷瘤小鼠腫瘤組織中CD4+T和CD8+T細胞比例

表4 各組荷瘤小鼠腫瘤組織中CD4+T和CD8+T細胞比例（±s，n=3）

表4 各組荷瘤小鼠腫瘤組織中CD4+T和CD8+T細胞比例（±s，n=3）

注：與陰性對照組比，*P＜0.05，**P＜0.01，與陽性對照組比，#P＜0.05，##P＜0.01。

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2.7 對各組荷瘤小鼠腫瘤組織中IL-6和TNF-α mRNA表達水平的影響

與陰性對照組比較，實驗組、陽性對照組和聯合組的腫瘤組織中IL-6和TNF-α mRNA表達水平顯著降低（P＜0.05，P＜0.01）。并且與陽性對照組比，聯用組的腫瘤組織中IL-6表達水平較低（P＜0.05），而TNF-α沒有顯著性差異，見表5。

表5 各組荷瘤小鼠腫瘤組織中IL-6和TNF-α mRNA表達水平（±s，n=3）

表5 各組荷瘤小鼠腫瘤組織中IL-6和TNF-α mRNA表達水平（±s，n=3）

注：與陰性對照組比，*P＜0.05，**P＜0.01，與陽性對照組比，#P＜0.05。

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2.8 對各組荷瘤小鼠體質量增加率的影響

與陰性對照組相比，陽性對照組、實驗組和聯用組的體質量增加率均顯著降低（P＜0.05，P＜0.01）。與陽性對照組相比，實驗組和聯用組的體質量增加率明顯提高（P＜0.05），說明一清顆粒與環磷酰胺聯用可以降低環磷酰胺對小鼠體重的影響，見表6。

表6 各組荷瘤小鼠體質量增加百分率的比較（±s，n=3）

表6 各組荷瘤小鼠體質量增加百分率的比較（±s，n=3）

注：與陰性對照組比，*P＜0.05，**P＜0.01，與陽性對照組比，#P＜0.05

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3 討論

據統計約15%的患者為三陰性乳腺癌，由于缺失3種關鍵的治療靶點：雌激素受體（ER）、孕激素受體（PR）和人類表皮生長因子受體2（HER-2），導致內分泌治療或抗HER-2靶向治療的方案對之療效甚微[14-15]。目前，化療是三陰性乳腺癌的主要治療方式，但是5年內患者復發轉移的風險高達20%[16]。另一方面，長期使用化療藥物會產生副作用和藥物抗性，也成為三陰性乳腺癌治療的難點[17]。

與大多數其他惡性腫瘤不同，乳腺癌最初被認為是免疫原性較低的癌癥類型。然而，多項研究表明，具有高水平淋巴細胞浸潤的早期和晚期三陰性或HER-2陽性乳腺癌患者預后較好，表明三陰性乳腺癌患者也可以從免疫檢查點抑制劑中獲益[18-20]。雖然腫瘤免疫檢查點抑制療法（如PD-1和PD-L1抗體）已被批準用于局部晚期或轉移的三陰性乳腺癌的臨床治療，但是由于腫瘤異質性、免疫逃逸和腫瘤微環境的復雜性，免疫檢查點抑制療法仍然存在一定的障礙和挑戰。數據顯示只有10-20%的三陰性乳腺癌患者對免疫治療有好的響應[21]。因此，開發有效治療三陰性乳腺癌的創新藥物迫在眉睫，但是如何發現這類新型藥物是亟需探究和解決的科學問題。

多年的臨床實踐表明，清熱類中藥的藥理作用廣泛，具有解熱、抗炎、抗腫瘤和提高機體免疫能力等功能，且療效確切。目前，傳統清熱類中藥在三陰性乳腺癌的治療上也取得許多新進展。例如，在中藥提取物方面，蒲公英的提取物能夠通過內質網應激相關信號通路誘導三陰性乳腺癌MDA-MB-231細胞發生凋亡，抑制細胞增殖[22]。在中藥復方制劑方面，復方半邊蓮口服液能夠顯著提高CD4+T和CD8+T細胞比例，降低調節性T細胞比例，提高了荷瘤小鼠的抗腫瘤免疫能力[23]。由此可見，清熱類中藥可通過多種途徑發揮抗三陰性乳腺癌的作用，這為治療三陰性乳腺癌的新型藥物開發提供了潛在的活性物質基礎。

目前化療常作為三陰乳腺癌根治性手術后的一線治療手段，臨床上常見副作用較多，對患者的生理功能損害較大，而使用一些清熱類藥物輔助化療治療在臨床上具有一定增效減毒的作用。如施曉麗等[24]采用清熱解毒法與新輔助化療相結合的方法治療乳腺癌，發現能明顯改善患者免疫功能，使白細胞及中性粒細胞減少的發生率得以減少。戴玉娜等[25]復方苦參注射液聯合乳腺癌新輔助化療的療效觀察結果顯示，聯合組能提高治療效果，減輕血小板減少、肝功能異常和胃腸道反應等毒副作用。可見清熱類中藥不僅自身具有抗三陰性乳腺癌的潛能，也可以作為輔助化療治療三陰性乳腺癌，可起到增加療效、減輕毒副反應和改善患者生存質量的作用。因此發現與化療藥物聯用具有增效減毒的清熱類藥物，對于解決化療藥物的毒副作用及耐藥現象具有一定的臨床意義。

中醫學認為乳腺癌屬于氣血失調和痰凝毒滯等所致的雜癥，機體正氣受損，而化療又進一步耗損氣血和熱毒損傷，因此治宜清熱解毒以及養陰益氣。一清顆粒是由黃連、大黃、黃芩三味藥組成的清熱劑，方中黃連和黃芩分別重于清心胃之火和肺胃之火，并可涼血止血。大黃清熱解毒，攻積泄熱，三味藥聯合具有清熱瀉火解毒、化瘀涼血止血之效。為了考察一清顆粒是否具有抗三陰性乳腺癌的作用，本研究利用小鼠三陰性乳腺癌細胞株4T1建立乳腺癌荷瘤小鼠模型，分為陰性對照組、一清顆粒、陽性藥環磷酰胺和一清顆粒與環磷酰胺聯用組，以在體內評價一清顆粒單用和聯用時對三陰性乳腺癌的作用。結果顯示一清顆粒單用時對三陰性乳腺癌荷瘤小鼠的效果不佳，但是與環磷酰胺聯用可增強環磷酰胺對荷瘤小鼠體積生長的抑制作用，提高環磷酰胺的抑瘤率，并且能夠延長荷瘤小鼠的存活時間，能夠發揮協同增效的作用，為一清顆粒這種清熱解毒藥物能夠用于三陰性乳腺癌的輔助治療提供實驗依據。由于化療藥物長期使用可能使腫瘤細胞對其的敏感性降低，一清顆粒作為復方中藥具有多成分，多靶點的作用特征，是否可能通過改善腫瘤微環境而發揮增效作用，仍需要進一步探究。

環磷酰胺有顯著的抗腫瘤效應，但是同時也具有免疫抑制的作用，長期使用會導致一些副作用，比如胃腸道反應、對血液系統有一定的損傷和骨髓抑制等。本研究中結果顯示陽性對照組的小鼠外周血淋巴細胞比例、胸腺指數以及體質量增加率都顯著低于陰性對照組。淋巴細胞是介導機體特異性免疫應答的主力，而胸腺是T細胞發育、分化的主要場所，是身體免疫系統重要的器官，其器官指數可反映免疫功能[26-28]。免疫功能對腫瘤的發生、發展有著重要的調控作用，腫瘤浸潤淋巴細胞(tumor infiltrates lymphocytes,TILs)是最早被發現的免疫細胞，其中的CD4+T和CD8+T細胞具有一定的抗腫瘤免疫作用[29-30]。一清顆粒與環磷酰胺聯用組可以明顯拮抗環磷酰胺單獨使用時對胸腺指數和淋巴細胞比例的抑制作用。同時一清顆粒與環磷酰胺聯用組腫瘤組織中的CD4+T和CD8+T細胞比例也顯著增加，提高了機體抗腫瘤免疫應答。腫瘤微環境的炎癥因子如IL-6、IL8和TNF-α等在包括乳腺癌在內的多種腫瘤中扮演著重要的角色，最近有研究表明乳腺癌腫瘤微環境中IL-6過度表達，并且能激活下游信號通路介導乳腺癌的增殖、轉移和耐藥等[31-32]。有研究人員發現下調血清中TNF-α的表達可以促進長期抗腫瘤免疫[33]。本研究的結果發現一清顆粒、環磷酰胺及兩者聯用均能下調乳腺癌瘤組織中IL-6和TNF-α的表達，表明一清顆粒與環磷酰胺對腫瘤炎癥因子有一定的影響。體質量增加率可一定程度上反應小鼠生存質量[34-35]。陽性對照組的結果提示環磷酰胺可造成小鼠免疫抑制并且體重下降。一清顆粒與環磷酰胺聯用組可以降低環磷酰胺對小鼠體重的影響，改善小鼠的生存質量，因此一清顆粒能夠減輕因環磷酰胺引起的毒性反應，發揮減毒作用。

綜上所述，一清顆粒聯合環磷酰胺不僅可以有效抑制三陰性乳腺癌荷瘤小鼠移植瘤的生長，同時可以在一定程度上改善環磷酰胺所造成的骨髓、免疫器官等損害，從而起到增效減毒的作用。該研究不僅為一清顆粒這種清熱藥物在臨床腫瘤化療中的輔助應用提供了實驗依據和理論基礎，同時也對一清顆粒的二次開發提供新的思路，但是其具體的分子機制及化學物質基礎仍需進一步深入研究。

參考文獻2

1 Sung H,Ferlay J,Siegel R L,et al.Global cancer statistics 2020:GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries.CA Cancer J Clin,2021,71(3):209-249.

2 Feng F,Zhang D J,Han F K,et al.Downregulation ofGATSgene inhibits proliferation,clonogenicity and migration in triple negative breast cancer cells MDA-MB-231 by cell autophagy.Cancer Biomark,2019,26(3):261-269.

3 Cont N T,Maggiorotto F,Martincich L,et al.Primary tumor location predicts the site of local relapse after nipple-areola complex(NAC)sparing mastectomy.Breast Cancer Res Treat,2017,165(1):85-95.、

4劉曉宇,李靜蔚,劉曉菲,等.中藥聯合新輔助化療治療乳腺癌的研究進展.環球中醫藥,2021,14(2):357-362.

5 Zong S,Li J L,Yang L,et al.Synergistic antitumor effect of polysaccharide fromLachnumsp.in combination with cyclophosphamide in hepatocellular carcinoma.Carbohydr Polym,2018,196:33-46.

6代春美,陳香,胡相卡,等.芪膠升白膠囊聯合環磷酰胺對S180荷瘤小鼠增效減毒作用研究.天然產物研究與開發,2016,28(7):1029-1034.

7趙妙惠,周佳妮,漆勇.桑黃多糖調控PI3K/AKT/mTOR通路抑制肝癌腹水荷瘤小鼠及對化療的減毒增效作用.中國臨床藥理學與治療學,2020,25(4):401-407.

8劉丹,謝楓楓,陳瑩.香砂六君子湯對乳腺癌化療患者的減毒及增效作用觀察.湖南中醫藥大學學報,2018,38(4):455-458.

9陳哲杰,李文,林美斯,等.三黃瀉心湯研究現狀及其關鍵技術與核心問題分析.中草藥,2016,47(22):4111-4117.

10張淑群,高曉燕,薛興歡,等.黃芩素對人乳腺癌MDA-MB-231細胞株SATB1表達的影響.中國腫瘤臨床,2014,41(6):355-358.

11孫瑋.蘆薈大黃素與順鉑對乳腺癌MDA-MB-231細胞Bcl-2及Bcl-xL表達水平的影響.中國實用醫刊,2018,45(21):112-115.

12王斌,許詩雨,劉嘉欣,等.黃連總生物堿聯合運動通過阻滯細胞周期G1/S轉換抑制原位移植4T1乳腺癌小鼠荷瘤生長的研究.中國中藥雜志,2019,44(8):1635-1641.

13陸慧敏,孫文熙,霍晨星,等.基于MEKK1/SEK1/JNK1/AP-1通路探討三七總皂苷對4T1乳腺癌荷瘤小鼠腫瘤模型的影響.中國實驗方劑學雜志,2020,26(24):75-81.

14 Waks A G,Winer E P.Breast cancer treatment.JAMA,2019,321(3):316.

15 Denkert C,Liedtke C,Tutt A,et al.Molecular alterations in triplenegative breast cancer—The road to new treatment strategies.Lancet,2017,389(10087):2430-2442.

16 Li J J,Yu K D,Pang D,et al.Adjuvant capecitabine with docetaxel and cyclophosphamide plus epirubicin for triple-negative breast cancer(CBCSG010):An open-label,randomized,multicenter,phase III trial.J Clin Oncol,2020,38(16):1774-1784.

17 Nedeljkovi?M,Damjanovi?A.Mechanisms of chemotherapy resistance in triple-negative breast cancer-how we can rise to the challenge.Cells,2019,8(9):957.

18 Loi S,Drubay D,Adams S,et al.Tumor-infiltrating lymphocytes and prognosis:A pooled individual patient analysis of early-stage triplenegative breast cancers.J Clin Oncol,2019,37(7):559-569.

19 Park J H,Jonas S F,Bataillon G,et al.Prognostic value of tumorinfiltrating lymphocytes in patients with early-stage triple-negative breast cancers(TNBC)who did not receive adjuvant chemotherapy.Ann Oncol,2019,30(12):1941-1949.

20 Wein L,Luen S J,Savas P,et al.Checkpoint blockade in the treatment of breast cancer:current status and future directions.Br J Cancer,2018,119(1):4-11.

21 Keenan T E,Tolaney S M.Role of Role of immunotherapy in triplenegative breast cancer.J Natl Compr Canc Netw,2020,18(4):479-489.

22 Li X H,He X R,Zhou Y Y,et al.Taraxacum mongolicumextract induced endoplasmic reticulum stress associated-apoptosis in triplenegative breast cancer cells.J Ethnopharmacol,2017,206:55-64.

23夏雪竹,董永強,劉翠紅,等.復方半邊蓮口服液對乳腺癌荷瘤小鼠抗腫瘤免疫的影響.川北醫學院學報,2020,35(2):203-206.

24施曉麗,謝俊.清熱解毒法聯合新輔助化療治療乳腺癌的療效及對免疫功能和生活質量的影響.現代中西醫結合雜志,2019,28(12):1288-1291.

25戴玉娜,韓建軍,李菊梅,等.復方苦參注射液應用于乳腺癌新輔助化療的療效觀察.遼寧中醫雜志,2019,46(10):2121-2123.

26 Zhou Y L,Chen X Y,Yi R K,et al.Immunomodulatory effect ofTremellapolysaccharides against cyclophosphamide-induced immunosuppression in mice.Molecules,2018,23(2):239.

27吳儀,龍承星.痛瀉要方對泄瀉肝氣乘脾證小鼠血常規及臟器的影響.湖北中醫藥大學學報,2020,22(4):18-21.

28張林超.白花蛇舌草多糖對腎癌荷瘤小鼠腫瘤生長及免疫調節作用的影響.中成藥,2021,43(3):765-769.

29 Désage A L,Karpathiou G,Peoc'h M,et al.The immune microenvironment of malignant pleural mesothelioma:A literature review.Cancers,2021,13(13):3205.

30 Nelson M A,Ngamcherdtrakul W,Luoh S W,et al.Prognostic and therapeutic role of tumor-infiltrating lymphocyte subtypes in breast cancer.Cancer Metastasis Rev,2021,40(2):519-536.

31 Masjedi A,Hashemi V,Hojjat-Farsangi M,et al.The significant role of interleukin-6 and its signaling pathway in the immunopathogenesis and treatment of breast cancer.Biomed Pharmacother,2018,108:1415-1424.

32 Siersb?k R,Scabia V,Nagarajan S,et al.IL6/STAT3 signaling hijacks estrogen receptor α enhancers to drive breast cancer metastasis.Cancer Cell,2020,38(3):412-423.e9.

33 Lou Y,Wang J J,Peng P,et al.Downregulated TNF-α levels after cryo-thermal therapy drive tregs fragility to promote long-term antitumor immunity.Int J Mol Sci,2021,22(18):9951.

34侯超,胡志希,曾柏榮,等.抗癌防移片對4T1小鼠乳腺癌影響的研究.湖南中醫藥大學學報,2014,34(4):6-9.

35彭莉,蘇澤琦,趙保勝,等.滋陰安神方對實驗性更年期模型大鼠的影響.中國實驗方劑學雜志,2018,24(15):137-142.