pH示差法測定紫莢豌豆中花青素條件的優化

關鍵詞：pH示差法;紫莢豌豆;花青素含量測定;條件優化

豌豆（PisumsativumL.）在我國種植面積廣泛，已被證實含有大量的可溶性糖、類黃酮等一系列對人類健康有益的物質，具有較高的營養和商品價值。紫莢豌豆色彩鮮艷，富含花青素，市面上較少見，相比于常規綠色蔬菜，其商品性也大大增強。

研究顯示，果實之所以呈現出不同的顏色，如紫色、藍色、青紫色、紅色等，主要是由于類黃酮類物質經過新陳代謝后產生的花青素決定的。花青素類化合物在植物中具有重要的生物學功能。如賦予植物花瓣呈現出鮮艷的顏色進而吸引昆蟲進行花粉傳播;植物外表面的花青素能有效吸收過量的光照和紫外線，進而防止紫外線傷害和日灼病的產生等。花青素還具有其他重要的保健作用，如降血糖、抗腫瘤等功效。花青素較不穩定，多以花色苷的形式存在于細胞液泡中，這些花青素在生物合成卜具有共有的路徑，之所以不同是由于后期糖基化部位的修飾位點不一致而產生的區別。

截止目前，針對花青素的合成代謝路徑研究已經取得較為清晰的結論。近年來，越來越多的學者進行花青素相關的研究，許多物種的花青素含量均已被測定。豆科作物往往以豆粒為經濟器官，而紫色豆粒至今尚未見報道。因此，在豆科作物中花青素的研究并不像在藍莓等具有紫色經濟器官的作物中那么深入。本試驗中探索出的反應條件系豆科作物卜首次關于pH示差法測定花青素的研究。在豆科作物中，除本試驗中介紹的紫莢豌豆以外，豇豆上也存在紫莢性狀。由于均屬豆科作物，有理由相信豆莢中花青素組分在豇豆和豌豆卜會有極大的相似性。因此，本研究成果不僅在豌豆遺傳育種工作中具有重要研究價值，也可為豇豆紫莢性狀的研究提供重要的參考價值。

從當前的研究進展來看，測定花青素的含量一般采用基于紫外可見吸收光譜原理的pH示差法和單- pH法，以及基于高壓流動輸送原理的高效液相色譜法（HPIC）等;HPLC法精確度更高，但反應標準品要求高且需要量較多，測試成本高于pH示差法。該方法的準確度也容易受花青素標準品的選擇限制。pH示差法采用紫外分光光度計，其操作方法簡單，成本較低。采用pH示差法定量分析紫莢豌豆中的花色苷總含量至今未見研究報道。為了確定紫莢豌豆中的花青素含量，需要找到合理的分析測定方法，并對測定過程中的分析條件進行優化，以期為后期紫莢豌豆品種選育提供參考。

1材料和方法

1.1材料、試劑與儀器

材料：紫莢豌豆材料‘ST16-18’，由云南農業大學園林園藝學院蔬菜學實驗室提供;

試劑：花青素標準品，矢車菊素-3-葡萄糖苷標準品色譜級，乙酸、乙醇、鹽酸、氯化鉀、乙酸鈉、檸檬酸、檸檬酸鈉等均為分析純，蒸餾水實驗室自制。

儀器：UV-1100型一紫外分光光度計（上海元析儀器有限公司）;HH-2數顯恒溫水浴鍋（河南省艾瑞德有限公司）;電子數顯pH計（梅特勒一托利多國際貿易（上海）有限公司）;HC-3618R高速冷凍離心機（安徽中科中佳科學儀器有限公司）。

1.2試驗方法

1.2.1緩沖液的配置不同pH值的緩沖液配置方法如下：

pH值=0.5-2.0的緩沖溶液：逐滴加入HCl校正0.1 mol-L-1檸檬酸溶液的pH值。

pH值=1.0的緩沖溶液：按25：67的體積比配置02mol.L-1KCl與0.2 mol·L-1HCl溶液，校正其pH值。

pH值=3.0-6.0的緩沖液配制方法見表1。

1.2.2紫莢豌豆花青素提取采集紫莢豌豆品種‘ST16-18’開花后第30天的果莢，每個品種3個單株果莢，每個果莢稱取0.5 9，3次重復。新鮮的紫莢豌豆用液氮研磨，加人95%乙醇：1.5 mol.L-1鹽酸為85：15（V/V）的提取液進行二次萃取，100W超聲波處理30min，在2-4℃下以5000rpm的速度離心5min，吸取卜清液最終定容至50mL待用。

1.2.3花青素的定量分析準確吸取離心后的豌豆樣品1mL至10mL的試管中，使用兩種pH緩沖溶液分別將紫莢豌豆提取液稀釋至同定的稀釋倍數，于30水浴60min，試管冷卻后分別在最大吸光值和700nm下測定吸光值，紫莢豌豆中花青素的含量按公式1和2計算。

1.2.4最大吸收波長的選擇將紫莢豌豆樣品分別用pH=1.0和pH=4.5的緩沖液稀釋處理，然后在最大吸光值處測定樣品吸光值，使得吸光值在0.2 -0.7范圍左右，確定稀釋倍數。在370-710nm進行光譜掃描，根據吸光值的差值確定最佳吸收波長。

1.2.5測定pH的確定

為了確定最適合的緩沖液pH，將用pH=1.0和pH=4.5的緩沖液稀釋至稀釋倍數的提取液，在已得到的最佳測定波長下測定其吸光值。

1.2.6反應平衡溫度和時間的確定使用已確定的兩個最適pH值的緩沖液，將豌豆樣品稀釋至已得到的稀釋倍數后，分別放置于20，30，40，50℃水浴條件下，每隔10min，在最佳測定波長處測定其吸光值，確定反應體系的平衡溫度和時間。

1.2.7精密度試驗根據卜述試驗所得確定的條件，準確吸取離心后的豌豆樣品1mL至10mL的試管中，封口膜封住試管口，將豌豆樣品使用pH為1.0和4.5的緩沖溶液將樣品稀釋5倍，后置于30℃下水浴恒溫60min測定吸光值。連續測定8次豌豆中花青素的含量，評價條件優化后測定方法的精確度。

1.2.8加標回收率試驗稱取矢車mL-1的儲備液，再進行花色苷標準品溶液的2倍和4倍稀釋。取4份已知含量的紫莢豌豆提取液，每份3次重復。一份紫莢豌豆提取液直接采用pH示差法測定花青素含量，另外三份分別加入一定量的標準品原液、標準品2倍稀釋液和4倍稀釋液，再對加入標準品后的樣品采用pH示差法測定花青素含量，計算加標回收率，公式如下：

2結果與分析

2.1測定波長的選擇

在確定稀釋倍數的情況下進行最佳波長的選擇。分別用pH=1.0和pH=4.5的緩沖液稀釋處理后的紫莢豌豆樣品，然后在520nm處測定豌豆樣品的吸光值，確定稀釋倍數為5倍，能夠使得吸光值在0.2-0.7范圍左右。如圖1所示，在370-710nm的波長范圍下，吸收光譜出現唯一的峰值，最大吸收波長為520nm，即在520nm處紫莢豌豆樣晶有最大的吸光值。

2.2測定pH值的選擇

花青素在不同的pH緩沖液條件下以不同的結構形式存在，其吸光值會隨著pH值的變化而改變，pH值的選定可以影響花青素定量分析的穩定性和靈敏度。兇此，我們只測定樣品在不同pH值條件下花色苷提取液在最大波長520nm處的吸光度變化。結果如圖2所示，紫莢豌豆樣品在pH=1.0和pH=4.5時，具有最大的吸光值的差異，且附近的吸光值較穩定，故選擇pH=1.0和pH=4.5的緩沖液來測定紫莢豌豆中的花青素含量。

2.3反應平衡時間和溫度的確定

花色苷會隨pH值的不同而變化，加入不同pH緩沖液的紫莢豌豆樣品需要一定的時間和溫度來產生新的平衡。溫度會影響反應平衡的時間，溫度越高需要的反應平衡時間越短，但花青素在高溫下不穩定，因此，反應平衡溫度不宜過高且應控制在40℃以下。pH=1.0和pH=4.5的緩沖液將紫莢豌豆提取液稀釋5倍后，分別于20，30，40℃水浴，每10min測定其吸光值。如圖3所示，在30℃下，測定樣品的吸光值較大且十分穩定，恒溫水浴60min后樣品吸光值基本達到平衡。在40℃下恒溫80min時，反應體系吸光值出現增加的現象，可能是由于溫度導致花青素損失同時伴隨著褐變指數和聚合物色值的增加導致。而pH為4.5的緩沖溶液在不同溫度下吸光值隨溫度變化的結果，如圖4所示，30℃下吸光值最穩定且30℃下水浴恒溫60min后反應趨于平衡。因此，最佳的反應平衡條件為30℃下恒溫60min。

2.4精密度試驗

使用pH示差法在卜述優化條件，連續8次測定豌豆中花青素的含量。如表2所示，紫莢豌豆的花青素總含量在1.929-2.004mg'g-1，其中最低值為1.929mg'g-1，最高值為2.004mg'g。1，平均含量為1.972mg'g-1，相對標準偏差（RSD）為1.526%。試驗表明，使用該方法進行紫莢豌豆中花青素的定量分析試驗重復性好且準確率高。

2.5加標回收率

根據卜述條件優化后應用pH示差法測定紫莢豌豆花青素的加標回收率，在樣品含量一致，加標樣品含量有所區別的情況下，3組試驗重復中加標回收率最高值為99.75%，最低值為98.68%，均值為99.34%（表3），卜述加標同收率整體來看數據穩定性較好，波動范圍在可接受范圍內。該結果表明，pH示差法條件優化后能夠更加準確可靠地測定紫莢豌豆中花青素的含量。

3結論與討論

花青素因其特有的商品著色及保健價值，近些年來逐漸成為研究熱點。利用花青素含量有顯著差異的純系親本材料進行雜交并構建分離大群體，進而最終挖掘出花青素關鍵控制基兇位點在農業及生物學研究中具有重要的研究價值。而探索出一種穩定可靠的花青素含量測定方法以應用于大群體中各個單株表型鑒定，能為最終精細定位出花青素關鍵控制基因位點奠定實驗基礎。

相比HPLC法，pH示差法具有成本低，試驗速度快，操作簡單等優勢，因而更加適用于大型分離群體中各個個體的花青素含量測定。但是由于不同物種中花青素的組分并不相同，因而在不同的物種卜使用pH示差法進行花青素測定時，往往需要對測定條件進行優化。

已有的研究結果顯示，在不同pH值下，溶液中的花青素會存在4種結構之間的相互轉換，本試驗中測試了8種pH濃度梯度，發現在pH=1.0處以及pH=4.5處吸光值最為穩定。花青素的提取需要讓有機溶劑盡可能的滲透穿越細胞壁并讓有機溶劑盡可能的溶解細胞內的花青素。因此在試驗中，植物材料的研磨程度、有機萃取溶劑的類型以及反應時間、反應溫度等都會對花青素的提取量產生影響。本試驗中研磨方式及萃取方式均與已有文獻中所報道的相似。一般來說提取的時間越長，花青素的絕對提取量會越高，但是隨著提取時間的延長，單位時間內花青素提取量則會逐步下降，難以體現出pH示差法簡便快捷的特性;溫度越高的提取環境更加有利于萃取溶劑和花青素的分子接觸，但過高的溫度條件容易破壞花青素結構，而過低的溫度則會降低反應速度。大多數已有報道中花青素的最佳提取時間在30-90min之間，而溫度在30-80℃之間。本試驗中經過多個處理之間的比較發現最佳的反應平衡條件為30℃下恒溫60min，屬于正常范圍之內。

綜上所述，pH示差法測定紫莢豌豆花青素的最佳條件為：最大吸收波長為520nm，緩沖液pH為1.0，4.5，于30℃下恒溫60min。此時測定紫莢豌豆中花青素的平均含量為1.972mg'g-1，紫莢豌豆的花青素含量豐富，適宜選育推廣。該方法的RSD為1.526%，加標同收率為98.68%-99.75%，表明該方法具有較高的精確性，適合紫莢豌豆花青素含量的定量分析。