神經絲輕鏈蛋白在周圍神經病中的應用價值探究

孫小玲，黃凱偉，萬新貝，吳瑩，李志軍

神經軸索損傷和喪失是許多導致永久性殘疾的急慢性神經系統疾病的病理基礎，神經絲（neurofilaments，Nfs）對神經元細胞損傷和死亡具有高度特異性，神經絲輕鏈蛋白（neurofilament light protein，NfL）已被確定為許多中樞神經系統（central nervous system，CNS）疾病中軸突損傷的生物標志物［1-3］。腦脊液NfL（cerebrospinal fluid neurofilament light protein，cNfL）和/或血清NfL（serum neurofilament light protein，sNfL）水平在診斷神經變性病［3-6］、中樞神經系統脫髓鞘病變［7-11］、創傷性腦損傷［12］、感染性疾病如Creutzfeldt-Jakob病［13］、遺傳性疾病如亨廷頓病［14］以及其他神經/精神疾病等［15］，評估疾病活動，監測治療反應，判斷預后方面已顯示出巨大優勢，而且，cNfL和sNfL作為CNS疾病非常有潛力的生物標志物的證據還在逐漸增加中。

近年來NfL在周圍神經病中的應用價值也逐漸引起關注，現綜述如下。

1 Nfs的結構與功能

細胞骨架蛋白根據其直徑可分類為6 nm的肌動蛋白絲、10 nm的中間絲（包括Nfs和神經膠質絲等）以及馬達蛋白構成的15 nm的肌球蛋白絲。而Nfs是中樞和外周神經元中高度特異性的主要細胞骨架成分，由大直徑有髓軸突表達，在結構上維持軸突的穩定性，為樹突和軸突提供拉伸強度，使軸突能夠徑向生長［1，16］；在功能上，Nfs相互組裝并提供與肌動蛋白絲和金屬硫蛋白的交叉橋接。動態細胞骨架在細胞內向軸突的運輸中提高軸突的脈沖傳導速度，以及在調節神經突生長的翻譯后修飾的過程中至關重要［17］。Nfs由神經絲輕鏈、神經絲中鏈、神經絲重鏈以及α-互連蛋白組成，這些亞基均具有一個保守的α-螺旋桿結構域，該結構域具有可變的氨基末端和羧基末端區域，可變區域的不同長度使亞基具有不同的分子量，分別為61.5、102.5、112.5、55.4千道爾頓（kDa）。NfL被認為是Nfs中最重要的一部分，是唯一可以自我組裝成功能性纖維的Nfs，也是Nfs中最豐富、最易溶解的亞基，這使得NfL成為可測量的最可靠Nfs亞基。

2 NfL檢測方法、參考范圍和生理影響因素

許多研究使用酶聯免疫吸附試驗法（ELISA）和/或商業試劑盒來檢測NfL。ELISA測定試劑盒使用兩種高度特異性的非競爭性單克隆抗體（mAB47∶3和mAB2∶1）來量化可溶性NfL，其被認為在cNfL的檢測中是可靠的［18-19］，但ELISA檢測的靈敏度一般只能達到pg/ml水平，對于血液中超低豐度蛋白的檢測常顯示出一定的不足［20］，而基于電化學發光（electrochemiluminescence，ECL）測定法具有高靈敏度、寬動態范圍和小樣本量的特點。但這兩種技術均無法檢測到與疾病相關的NfL微小變化。

單分子陣列（single molecule array，Simoa）技術，是近年來新開發的一種超高靈敏度，以順磁珠的雙抗夾心ELISA法為基礎的單分子蛋白質檢測技術，其靈敏度為ELISA技術的1 000倍以上，檢測下限達到fg/ml。該方法可測量各種不同基質（血清、血漿、腦脊液、尿液、細胞提取物等）中的蛋白質。目前已有多項研究證實了Simoa技術能可靠地檢測血液樣本中的NfL（全濃度范圍內），包括健康個體中的NfL［20-23］，進而改變了腦損傷和神經退行性疾病的診斷方式。

正常情況下，低水平的NfL以年齡依賴性的方式不斷從軸突釋放。正常對照人群中cNfL水平每年增加 3.30%，男性cNfL較高［3］。VAGBERG等［24］研究顯示，30歲以下的正常健康成年人cNfL水平約為187 ng/L；30～＜40歲為274 ng/L；40～＜60歲為466 ng/L；而在老年時釋放更高水平的cNfL，60歲及以上者為693 ng/L。一項對335例年齡為38.5～85.6歲的健康個體進行的研究結果顯示，中位sNfL水平為32.30（23.15，43.95）pg/ml［25］，與其他研究中的結果［17］不太一致，這可能與尚無全球標準化的認證參考材料和/或方法有關，也強調了在實驗室指標被可靠地用于臨床實踐之前，標準化測試和臨界值確定的必要性［26］。

3 NfL與周圍神經病

3.1 NfL與吉蘭巴雷綜合征（Guillain-Barre syndrome，GBS） GBS是一種免疫介導的、以弛緩性麻痹為主要特征的急性周圍神經病變，其導致的嚴重失能和死亡風險高［27］。在GBS疾病早期，亟需能夠識別出不良預后的血清或腦脊液生物標志物。既往研究發現GBS患者的sNfL和cNfL水平明顯升高［28-29］。ALTMANN等［21］研究了27例GBS患者的臨床結局與sNfL之間的相關性，GBS患者入院時sNfL中位數水平為85.5 pg/ml，對照組為9.1 pg/ml，基線sNfL水平增加與住院時間長、進入重癥監護室（ICU）以及出院短期預后差等臨床結果相關。K?RTVELYESSY等［30］在近期研究中也有類似發現，GBS患者sNfL和cNfL水平高于對照組，入住ICU的患者中sNfL明顯增高，sNfL與GBS患者殘疾功能評分顯著相關。MARTíN-AGUILAR等［22］通過Simoa技術測量了GBS患者98個血清樣本和24個腦脊液樣本中的NfL，對GBS患者的遠期預后進行了評估，結果顯示GBS患者sNfL和cNfL水平顯著高于對照組；進一步通過多變量回歸分析發現，sNfL水平與GBS患者1年后功能殘疾相關，提示sNfL水平還可作為評估GBS遠期預后的生物標志物。AXELSSON等［19］采用ELISA法對18例GBS患者進行cNfL檢測，發現起病時高cNfL水平預示著長期殘疾和更差的生活質量。綜合上述研究可以發現，GBS患者基線sNfL、cNfL水平升高與疾病嚴重程度相關；sNfL、cNfL水平對GBS患者短期預后和長期預后均具有獨立預測價值。早期在GBS患者中進行NfL檢測可以實現后期的個體化疾病風險分層和預后判斷。

MARTíN-AGUILAR 等［22］在不同臨床亞型的GBS的觀察中發現，急性運動軸索型神經病（acute motor axonal neuropathy，AMAN）患者的sNfL水平高于其他患者（199.53 pg/ml和46.77 pg/ml，P=0.006）。急性運動感覺軸索性神經病（acute motor sensory axonal neuropathy，AMSAN）和電生理分型不清的患者sNfL高于急性炎性脫髓鞘性多神經根神經病（acute inflammatory demyelinative polyradiculoneuropathy，AIDP）患者（三者分別為107.15、104.7、33.88 pg/ml）。純運動變異型和Miller Fisher綜合征患者的sNfL水平高于感覺運動型GBS患者（三者分別為162.18、95.50、38.02 pg/ml）。而在K?RTVELYESSY等［30］研究隊列中，電生理檢查結果顯示混合性神經病變類型或純軸索損傷類型的患者cNfL/sNfL比值較正常對照組降低，而3例脫髓鞘類型的患者cNfL/sNfL比值與正常對照組類似。以上研究均提示NfL在不同亞型GBS患者中存在差異，sNfL水平升高及cNfL/sNfL比值降低更多提示了以軸突損傷為主的亞型，顯示出NfL作為軸突損傷生物標志物的潛力。

sNfL水平與軸突損傷的相關性最近也從腓腸神經的活檢研究中得到驗證，在軸索性神經病變為主的研究中，sNfL水平與腓腸神經軸突損傷相關，sNfL和纖維密度之間存在反比關系［31］。但ALTMANN等［21］納入27例GBS患者（包括17例AIDP、5例AMAN以及5例分型不明患者）的研究結果顯示，sNfL水平在AIDP亞型和AMAN亞型之間無顯著差異。研究者認為，這可能是由于在以脫髓鞘損傷為主的亞型中，已有Nfs持續從受損的神經纖維中釋放，但軸突損傷低于神經電生理學可檢測到的閾值。因此，GBS患者的神經電生理模式不能代表真正發生的病理學過程。而sNfL可以作為GBS患者一種敏感的血清生物標志物，在出現明確的電生理損害之前對軸突的損害做出早期評估。

3.2 NfL與慢性炎性脫髓鞘性神經根神經病（chronic inflammatory demyelinating polyradiculoneuropathy，CIDP） CIDP是一種罕見的獲得性免疫介導的脫髓鞘性神經病，在臨床表現、預后和治療反應方面具有很強的異質性［32-33］。迄今為止，還沒有適用于CIDP人群的可靠的、能夠幫助診斷和觀察疾病活動進展以及判定預后的血液生物標志物。此外，在接受維持治療的患者中也亟需客觀的疾病活動參數來指導治療。

近期證據表明，在高疾病活動性的CIDP患者中可觀察到sNfL水平顯著升高；但sNfL水平和疾病持續時間不相關，新診斷的患者與復發患者之間的sNfL水平無顯著差異；此外，sNfL與年齡和性別相關［34-36］。VAN LIEVERLOO 等［36］對CIDP患者治療前的神經傳導檢測（NCS）結果進行評估，發現較高的sNfL水平與較低的正中神經復合肌肉動作電位（compound muscle action potential，CMAP）負峰面積和較低的總CMAP負峰面積相關，提示sNfL水平與軸索損傷之間存在相關性。FUKAMI等［35］通過NCS和病理研究進一步證實了該推測，sNfL水平與脛神經CMAP變化幅度呈負相關，并與病理中的活動性軸索變性程度呈正相關。因此，sNfL可與NCS聯合評估CIDP中的神經軸索損傷；sNfL比NCS更具有優勢，因為sNfL無侵入性，而且可動態反應持續的軸索損傷。

HAYASHI等［37］觀察11例CIDP患者接受丙種球蛋白治療前后，發現治療前基線sNfL水平顯著升高，治療后以及緩解期sNfL水平顯著下降。VAN LIEVERLOO等［36］觀察到5例有治療應答的患者隨訪期sNfL水平大幅下降和正常化，而活動性CIDP患者隨訪期sNfL水平更高，提示sNfL可作為評估CIDP疾病活動的生物標志物。GODELAINE等［38］采用增強化學發光法（ECL法）測定76例CIDP患者的sNfL發現，隨訪期間sNfL與CIDP的1年疾病進展（MRC總分減低）相關，而高sNfL水平患者在隨訪期間治療效果欠佳的概率增加。這些證據進一步提示sNfL可作為評估周圍神經病的疾病活動、預后的生物標志物。此外，sNfL還可能在CIDP的臨床決策中具有重要價值，可以識別最終需要轉換治療或應立即開始接受更強化的治療（例如聯合治療）的患者。

近期已有研究闡明，針對郎飛結結旁連接成分如神經肌束蛋白155（ Neurofasciu-155，NF155）的IgG4型自身抗體患者與巨噬細胞誘導脫髓鞘的CIDP患者的神經病變機制不同［39］。FUKAMI等［35］的CIDP研究隊列中納入了13例抗NF155抗體陽性患者，與抗體陰性的患者相比，抗NF155抗體陽性的患者sNfL水平顯著升高。8例患者治療后的sNfL水平和抗NF155抗體滴度與基線相比均明顯降低，且sNfL水平的變化與NF155抗體滴度呈正相關。該研究提示自身抗體可能直接損害軸突-雪旺細胞，導致廣泛的神經元損傷，進而導致sNfL水平升高。FUKAMI等［35］研究還發現，在CIDP經典型和變異型間sNfL水平并無明顯差異。目前尚無研究單獨關注CIDP患者的cNfL水平。

3.3 NfL與其他免疫介導性/炎性周圍神經病變MARIOTTO等［28］的隊列研究中納入12例CIDP、5例GBS、3例多灶性運動神經病（multifocal motor neuropathy，MMN）、3例抗髓鞘結合糖蛋白（myelin associated glycoprotein，MAG）抗體陽性周圍神經病、1例非系統性血管炎性神經病患者，結果顯示，總體NfL水平顯著升高，且cNfL水平高于sNfL；此外，sNfL與疾病活動相關，并可預測隨后的殘疾進展。遺憾的是研究者未進行疾病分組研究。STASCHEIT等［34］的研究中未直接比較6例MMN患者與對照組sNfL水平的關系，但MMN患者與CIDP經典型和變異型之間的比較無差異；該研究中63例CIDP患者sNfL水平明顯升高，間接提示sNfL水平在MMN疾病活動中可能的評估作用。此外，2022年最新的前瞻性觀察研究中納入24例未接受過抗MAG周圍神經病治療的患者，未發現sNfL與疾病活動相關［40］。因此，sNfL與其他免疫介導性周圍神經病的疾病活動關系還有待進一步研究確定。

血管炎性神經病（vasculitic neuropathies，VN）的診斷金標準為外周神經活檢，但因為有創性等原因限制了其臨床應用的可行性。BISCHOF等［41］通過回顧性分析11例VN患者的臨床資料，發現sNfL水平可作為血管炎損傷和/或疾病活動的標志物，在VN診斷時sNfL水平明顯高于緩解期間。因此，sNfL作為能夠進行快速篩查并提示急性軸突損傷的生物標志物在VN的應用中非常有前景。

3.4 NfL與遺傳性周圍神經病 SANDELIUS等［42］和MILLERE等［26］分別對兩個腓骨肌萎縮癥（Charcot-Marie-Tooth disease，CMT）隊列（包括CMT1A、CMTX1和SPTLC1等類型）進行研究發現，sNfL水平均顯著升高，并與疾病嚴重程度相關；CMTX1型患者的sNfL水平高于CMT1A和其他CMT疾病類型。而且，sNfL水平在以軸突或脫髓鞘類型為主的CMT患者中類似。上述兩位作者指出，鑒于雪旺細胞與軸突相互作用在神經元功能維持中的重要性，以及先前觀察到CMT1A（脫髓鞘為主）的殘疾程度是由軸突損傷的程度而不是傳導速度減慢的程度決定，這個結果是合理的。9例CMT患者隨訪1年后sNfL水平變異性為16.4%，符合遺傳性疾病緩慢恒定的進展預期，表明其可用作衡量疾病進展的標準。MAIA等［43］對不同階段的未經治療的遺傳性轉甲狀腺素蛋白淀粉樣變（hereditary transthyretin amyloidosis，ATTR）周圍神經病進行研究發現，sNfL可區分無癥狀突變攜帶者和早期有癥狀患者，以及區分感覺神經病變患者和運動神經病變患者，并可用作臨床和臨床前試驗中以疾病為導向的治療療效指標。隨后的研究［44］也驗證了MAIA等［43］的結論，而且發現在淀粉樣蛋白輕鏈變性周圍神經病和ATTR周圍神經病患者中sNfL水平均升高，并且還與后者的嚴重程度有關。近期LUIGETTI等［45］研究進一步驗證了前人的結論，sNfL可用于評估ATTR周圍神經病嚴重程度并監測其進展。

綜合現有的證據顯示，sNfL可作為遺傳性周圍神經病活動的生物標志物，以及可能的治療療效評估指標。

3.5 NfL與化療藥物相關周圍神經病（chemotherapy induced peripheral neurotoxicity，CIPN） 近期關于CIPN與NfL的研究陸續有報道。通過長春新堿化學療法誘導的CIPN動物模型中，sNfL水平在長春新堿給藥過程中持續顯著升高，當出現軸索征象和表皮內神經喪失時，sNfL水平升高近4倍［46］。而在用順鉑和紫杉醇化學療法誘導的CIPN動物模型中sNfL水平升高，升高的時間也與軸突結構的形態和功能改變的嚴重程度有關［47］。奧沙利鉑誘導的CIPN患者在奧沙利鉑給藥期間sNfL水平增加［48］。HUEHNCHEN等［49］分別通過細胞試驗（將誘導的多能干細胞衍生的感覺神經元暴露于紫杉醇）以及接受紫杉醇化療的乳腺癌或卵巢癌患者中觀察NfL變化，發現sNfL與CIPN的發展和嚴重程度相關，化療期間監測sNfL可以提示正在發生的神經軸索損傷和CIPN的嚴重程度。3.6 NfL與糖尿病周圍神經病（diabetic peripheral neuropathy，DPN） DPN與 NfL的研究較少。CELIKBILEK等［50］最早提出sNfL-mRNA可作為早期預測糖尿病前期周圍神經病變的替代標志物。近期MORGENSTERN等［51］發現，DPN患者sNfL水平升高，而且sNfL的升高可能與痛覺過敏表型的發展相關。

4 cNfL與sNfL在中樞神經系統與周圍神經系統不同的起源和診斷價值

MILLERE等［26］指出，未來將NfL作為生物標志物仍需解決幾個問題：疾病患者和對照組之間NfL水平重疊的區域、檢測方法和臨界值的標準化、NfL的非特異性以及與疾病嚴重程度的一般適度相關性。

在CNS疾病中，細胞破壞導致軸突細胞骨架蛋白家族Nfs釋放到腦脊液，并通過蛛網膜顆粒進入血液循環，因此cNfL被認為是CNS起源，這種情況下cNfL與sNfL之間具有一定的相關性。最新關于cNfL的系統綜述表明，在現有的研究中，在認知受損的艾滋病（HIV）患者、肌萎縮側索硬化癥、額顳葉癡呆和亨廷頓病中觀察到高水平的cNfL［18］；33.3%的研究觀察到男性cNfL水平高于女性，而且cNfL水平隨著年齡的增長而升高；大多數同類型CNS疾病cNfL檢測水平相當，但cNfL具有幫助鑒別額顳葉癡呆與阿爾茨海默病和帕金森病與非典型帕金森綜合征的潛力［18］。

而在周圍神經系統疾病如GBS/CIDP中，病變影響周圍神經系統的鞘內和鞘外部分，相關研究中也觀察到GBS患者cNfL與sNfL之間的顯著相關性［22，34］。sNfL水平的升高反映了神經根和/或周圍神經的損傷情況，推測認為大多數急性活動期的GBS患者中sNfL起源于周圍神經系統損傷。通過cNfL/sNfL比率可大致評估sNfL的外周起源或者中樞起源［30］。K?RTVELYESSY 等［30］研究顯示，對照組平均cNfL/sNfL比率為26.7，表明正常生理狀態下NfL的CNS起源占主導；而軸突或混合軸突脫髓鞘病變的GBS患者的cNfL/sNfL比率顯著降低，提示病理狀態下sNfL可能更多起源于周圍神經系統。當血-神經屏障（BNB）和血-腦脊液屏障（BCB）受到破壞，神經根的軸突損傷釋放NfL到腦脊液；BNB/BCB廣泛惡化時外周血中NfL也可進入腦脊液系統［19］。而在其他周圍神經病變中，任何sNfL水平的變化僅反映神經病變的變化。因此在監測周圍神經系統疾病活動和組織損傷方面，sNfL水平可能比cNfL更敏感。

綜上所述，綜合各種證據表明，sNfL定量可作為一個非常有潛力的生物標志物，動態測量軸突損傷，動態監測周圍神經系統疾病活動度，以及用于未來的臨床試驗和監測治療效果等。

作者貢獻：孫小玲、黃凱偉、萬新貝、吳瑩、李志軍負責文獻檢索與整理；孫小玲負責論文起草與修訂，對論文進行質量控制；李志軍負責最終版本修訂，對論文負責。

本文無利益沖突。