豬肉源大腸桿菌分離鑒定及其生物被膜形成

季君珂，宓曉雨，程 宇，張文棟，張 晨，袁楊洋，江 蕓

（南京師范大學食品與制藥工程學院，江蘇 南京 210023）

肉品腐敗變質給人類食品供應帶來極大危害。生鮮肉營養豐富、含水量高、極易腐敗。以往研究認為肉類微生物的污染主要來自胴體污染，但近年研究發現，最主要來源是接觸表面污染[1]。生豬屠宰、分割、運輸等階段均可能通過直接接觸使畜禽胴體和分割肉污染大腸桿菌[2]，而微生物在生產加工表面形成的生物被膜被認為是主要的交叉污染源頭[3]。

大腸桿菌在自然環境中廣泛存在，極易污染肉、魚、乳、蔬菜、水果等，引起食品腐敗[4]。致病性大腸桿菌還可引起人類腸道或腸道外感染，甚至會導致死亡[5]。在許多國家，大腸桿菌和大腸菌群通常被認為是食品衛生質量的指示菌[6]。大腸桿菌可以在不銹鋼、玻璃、聚苯乙烯等食品加工接觸表面及食品表面黏附、定植、形成生物被膜[7]。生物被膜是細菌為了更好地適應生存環境而黏附于接觸表面，通過菌體增殖生長、分泌大量胞外聚合物（extracellular polymeric substances，EPS）而形成的具有一定空間結構的細菌聚集體[8]。EPS是生物被膜中細胞周圍的厚基質，其多層性質是保護生物被膜內細菌細胞的主要機制[9]。EPS的主要成分是占比高達97%的水，此外還包括胞外多糖、聚合物、蛋白質、核酸、脂質、吸收的營養素及代謝物[10-11]。EPS的存在可以提供細菌物理屏障，減緩抗菌劑向生物被膜內細胞的擴散，從而使酶有時間降解某些毒性分子，使得生物被膜的抗藥性增強，難以消除，形成持續性污染[12-13]。

大腸桿菌生物被膜形成的相關基因，如csgA、fimH和papC是附著和感染宿主的重要因子，并且與抗菌素耐藥性有關[14]。csgA基因與大腸桿菌在接觸面的初始黏附有關，而fimH基因編碼F1菌毛的黏附亞基，促進定植、侵入和形成生物被膜。在一些犬類和人體中，papC基因能夠使大腸桿菌在內臟中黏附和存活[15]。

為此，本研究首先從生豬屠宰線、豬胴體表面及生鮮豬肉中分離鑒定大腸桿菌，進而采用微孔板結晶紫染色法評價豬肉源大腸桿菌分離株在屠宰加工常見溫度（15 ℃）下的生物被膜形成能力，進一步選取代表性菌株探討生物被膜形成過程中被膜量、EPS組成及大腸桿菌成膜基因表達的變化。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

生鮮豬肉，購于南京農貿市場某品牌專賣柜。

食品級304不銹鋼片（75 mm×25 mm×1 mm，2B光潔面）、玻璃容器 南通順豐醫療器械有限公司；96 孔透明細胞培養板 美國Corning公司；大腸桿菌標準菌株ATCC43895 美國菌種保藏中心；胰蛋白胨大豆瓊脂（tryptone soya agar，TSA）、胰蛋白胨大豆肉湯（tryptic soy broth，TSB）、酵母提取物（yeast extract，YE）、大腸桿菌和大腸菌群顯色培養基（E.coliand coliform chromogenic agar plates，ECCA）、麥康凱瓊脂（MacConkey agar，MAC） 北京陸橋技術有限公司；結晶紫、乙醇、磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）、丙酮（均為分析純） 南京藤春生物科技有限公司；苯酚（分析純） 南京峰昌生物科技有限公司；濃硫酸（分析純） 南京化學試劑有限公司；BCA蛋白含量測定試劑盒 南京建成生物科技有限公司；總RNA提取試劑盒、PrimeSTAR?Max DNA聚合酶、熒光定量試劑盒日本TaKaRa公司；DNA Marker（DL 2000）、Gel Red核酸染料 上海生物工程有限公司；PremixTaq酶 蘇州近岸蛋白科技有限公司。

1.2 儀器與設備

M2多功能酶標儀 美國Molecular Devices公司；Thermal Cycler普通聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀 美國Molecular Devices公司；Universal Hood II凝膠成像儀 美國Bio-Rad公司；2-16KL高速冷凍離心機 美國Sigma公司；Nano-30微量紫外分光光度計 杭州奧盛儀器有限公司；DYCP-32B瓊脂糖水平電泳儀 北京六一生物科技有限公司；SW-CJ-2F超凈工作臺 蘇州安泰空氣技術有限公司；HVE-50立式壓力蒸汽滅菌鍋日本Hirayama公司；HX-4拍打式無菌均質器 上海瀘析實業有限公司；QL-200微型渦旋混合儀 海門其林貝爾儀器有限公司；ZQTY-70臺式振蕩培養箱 上海知楚儀器有限公司；DHP-9052電熱恒溫培養箱 上海一恒科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 肉源大腸桿菌的分離鑒定

1.3.1.1 肉源大腸桿菌的分離純化

生鮮豬肉樣品于超凈工作臺剪取25 g，放入加有80 mL無菌生理鹽水的無菌均質袋中，均質機充分拍打2 min（8 次/s）。某生豬屠宰企業的屠宰車間（傳送帶表面、操作臺表面以及車間工人刀具、手套表面）及豬酮體表面采用棉簽涂抹擦拭法取樣，取樣后用無菌剪刀將棉簽頭剪于裝有10 mL無菌生理鹽水的離心管中，用渦旋混勻器充分渦旋。

取一定體積的上述樣液進行梯度稀釋，選擇合適稀釋度涂布于ECCA平板，37 ℃培養24 h。培養結束后挑取藍綠色并呈現圓形凸起的可疑菌落至MAC平板上反復進行平板劃線分離，分離純化3 次[16]。純化后的可疑菌株于含體積分數25%甘油的TSB中-80 ℃凍存。

1.3.1.2 大腸桿菌屬特異性PCR鑒定

將上述凍存的可疑菌株在TSA-YE平板上劃線活化2 次，37 ℃倒置培養24 h，挑取單菌落于加入150 μL滅菌蒸餾水的1.5 mL離心管，渦旋，99 ℃水浴10 min，冰浴2 min，12 000×g離心2 min，吸取上清液至另一離心管中即為細菌基因組DNA，-20 ℃凍存備用。

采用PCR擴增大腸桿菌屬特異基因phoA，其擴增序列引物：F：5’-CGATGCCTTACCGCTTAC-3’；R：5’-TTTCCCTGCCATTCACC-3’[17]。反應體系（25 μL）：模板DNA 1 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各0.5 μL，PremixTaq酶12.5 μL，ddH2O 10.5 μL。反應程序為95 ℃預變性5 min，95 ℃變性30 s、55 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s，共30 個循環，72 ℃延伸10 min。擴增完成后進行瓊脂糖凝膠電泳（120 V、25 min），凝膠成像儀成像觀察。

1.3.2 肉源大腸桿菌生物被膜形成能力比較

1.3.2.1 菌液制備

將凍存的肉源大腸桿菌在TSA-YE平板上劃線活化2 次，37 ℃培養24 h。挑取單菌落分別接種于3 mL TSB中，37 ℃、220 r/min振蕩培養18 h，連續活化2 次，取生長達到穩定期的菌液1 mL于4 ℃、8 000×g離心5 min，棄去上清，用PBS（pH 7.2）洗滌3 次，調整菌懸液濃度為108CFU/mL左右，備用。

1.3.2.2 微孔板結晶紫染色法分析大腸桿菌生物被膜形成能力

將上述菌懸液用TSB梯度稀釋至102CFU/mL，吸取180 μL至96 孔細胞培養板中，封口膜封口。置于15 ℃培養72 h，以無菌TSB作為對照。培養結束后，棄去微孔板中培養液，用無菌蒸餾水漂洗3 次，室溫下干燥30 min后，每孔加入200 μL 0.25 g/100 mL結晶紫染色30 min，棄去染液后用無菌蒸餾水漂洗3 次，之后用200 μL體積分數95%乙醇溶液洗脫（30 min）黏附于微孔表面的菌體，最后將微孔板置于酶標儀中，在570 nm波長處測定光密度OD570nm，每個菌株重復測定6 次，結果取平均值。

菌株根據所得OD570nm進一步作如下分類[18]：無生物被膜形成能力：OD570nm≤ODc；較弱生物被膜形成能力：ODc＜OD570nm≤2×ODc；中等生物被膜形成能力：2×ODc＜OD570nm≤4×ODc；較強生物被膜形成能力：4×ODc＜OD570nm。其中ODc為臨界值，按式（1）計算。

1.3.3 大腸桿菌生物被膜形成曲線

根據1.3.2.2節結果，選取1 株代表菌株按照上述方法進行微孔板操作，分別在培養24、72、120、168 h取樣，以無菌TSB作為對照組。經結晶紫染液染色、乙醇洗脫，測定OD570nm，去除對照組OD570nm后按照培養時間繪制生物被膜形成曲線。每個時間點均重復測定6 次。

1.3.4 大腸桿菌生物被膜形成時EPS含量分析

1.3.4.1 大腸桿菌生物被膜制備與處理

選用食品級304不銹鋼片作為生物被膜形成的接觸載體。為防止不銹鋼片表面附著的化學雜質及油污影響生物被膜的形成，使用前對不銹鋼片進行徹底清洗。具體方法如下：將洗凈的鋼片放入丙酮溶液中浸泡3 h，拭凈后用乙醇溶液浸泡12 h，最后用蒸餾水沖洗干凈并晾干[19]。實驗前，經121 ℃滅菌20 min備用。

將1.3.2.1節制備的大腸桿菌菌懸液接種至含新鮮TSB和不銹鋼片的無菌玻璃容器中，菌液濃度約為106CFU/mL。無菌保鮮膜封口，15 ℃下靜置培養72 h和168 h。培養結束后取出不銹鋼片并用無菌生理鹽水漂洗3 次以去除表面未黏附菌體，采用棉簽擦拭法收集不銹鋼片表面的生物被膜。將拭子置于裝有10 mL無菌生理鹽水和一定量玻璃珠的離心管中，充分渦旋3 min使拭子上的菌體充分脫落，得到的菌懸液用于EPS含量測定。實驗重復3 次。

1.3.4.2 EPS中蛋白質和多糖含量測定

參考Cao Bin等[20]的方法制備1.3.4.1節菌懸液中的松散型EPS（loose EPS，L-EPS）和緊密型EPS（bound EPS，B-EPS）。L-EPS和B-EPS的蛋白含量采用BCA蛋白含量檢測試劑盒測定。蛋白質-吸光度的標準曲線方程為y=0.001 8x＋0.151 4（R2=0.997 8），其中x為蛋白質質量濃度/（μg/mL），y為吸光度，根據標準曲線計算EPS中蛋白質含量?？偺呛坎捎帽椒恿蛩岱╗21]測定，多糖-吸光度的標準曲線方程為y=0.195 6x＋0.081 8（R2=0.997 3），其中x為葡萄糖質量濃度/（μg/mL），y為吸光度，根據標準曲線計算EPS中多糖含量。

1.3.5 生物被膜中相關成膜基因表達量測定

1.3.5.1 生物被膜的收集

以食品級304不銹鋼片作為接觸載體，15 ℃下靜置培養72 h和168 h后收集生物被膜，方法同1.3.4.1節。將菌懸液4 ℃、12 000×g離心15 min，沉淀用于核酸提取。

1.3.5.2 總RNA提取及cDNA合成

按照總RNA提取試劑盒說明書進行，用核酸蛋白微量測定儀測定提取的總RNA濃度和純度，確定RNA濃度和純度合格（OD260nm/OD280nm為1.8～2.0），調整RNA濃度后，根據Prime ScriptTMRT Master Mix反轉錄試劑盒進行反轉錄。反轉錄體系（10 μL）：2 μL 5×Prime Script RT Master Mix混合液、2 μL RNA、6 μL無RNA酶水；反應程序：37 ℃、15 min，85 ℃反轉錄酶失活反應5 s，保持4 ℃。將反轉錄得到的cDNA于-20 ℃保存進行后續實驗。

1.3.5.3 標準質粒構建及標準曲線建立

大腸桿菌csgA、papC、fimH基因及引物情況見表1，引物由上海生物工程有限公司合成。

表1 實驗所用PCR引物Table 1 PCR primers used in this study

標準質粒由南京擎科公司構建合成。取測序結果正確的質粒作為標準質粒，采用微量分光光度計測定純度和質量濃度，按式（2）計算質粒DNA拷貝數。

使用無RNA酶水梯度稀釋，使標準檢測質粒的質量濃度為100～10-6ng/μL，作為模板。PCR反應體系（20 μL）：SYBR Green Master（2×）（ROX）10 μL，PCR正、反向引物（10 μmol/L）各0.25 μL，DNA模板2 μL，雙蒸水7.5 μL。反應條件：95 ℃預變性30 s后，95 ℃5 s、60 ℃ 30 s反應40 個循環，95 ℃ 15 s、60 ℃ 1 min、95 ℃保持15 s。以拷貝數的對數值（lg（copies/μL））為橫坐標，循環閾（cycle threshold，Ct）值為縱坐標，構建一元線性方程，即為標準曲線。

1.3.5.4 相關成膜基因熒光定量PCR分析

以1.3.5.2節制備的cDNA為模板進行熒光定量PCR，用所得樣品的Ct值通過標準曲線計算目標基因表達量（lg（copies/μL）），進一步計算不銹鋼片生物被膜中成膜基因表達量（copies/cm2）。

1.4 數據處理

利用GraphPad Prism 8軟件（GraphPad Software公司）處理相應數據及圖表分析，采用SPSS 17.0（IBM公司）對數據進行單因素方差分析和Duncan’s多重比較檢驗，2 組之間顯著性差異分析采用t檢驗。結果以平均值±標準差表示，P＜0.05時差異顯著。

2 結果與分析

2.1 肉源大腸桿菌的分離與鑒定

由圖1可知，ECCA大腸桿菌顯色平板中共分離得到藍綠色可疑菌落350 個，可疑菌落進一步采用MAC平板劃線分離純化，得到粉紅色可疑菌株90 株。采用大腸桿菌菌屬特異性PCR擴增phoR基因，由圖2可知，擴增出陽性條帶（444 bp），共鑒定到陽性菌株31 株，其中4 株來源于生豬胴體表面，11 株來源于生豬屠宰線，16 株來源于生鮮豬肉，菌株信息見表2。

圖1 大腸桿菌在ECCA平板（A）和MAC平板（B）上的生長情況Fig.1 Growth of E.coli on ECCA (A) and MAC plates (B)

圖2 部分菌株的屬特異性PCR產物電泳圖Fig.2 Electrophoresis profile of genus-specific PCR products of selected isolates

表2 大腸桿菌鑒定結果Table 2 Results of identification of E.coli

大腸桿菌是人和動物腸道共生菌群的組成部分，部分致病性大腸桿菌能引起人體感染而致病[25]。受屠宰加工方式及運輸條件等因素影響，豬肉從屠宰場到餐桌的過程中，會受到不同程度的微生物污染[26]。國內有關學者對不同環境中大腸桿菌的污染情況進行了許多調查。吳萱[27]、于慶華[28]等的研究均從豬肉流通的不同環節中分離到大腸桿菌，可能來源于畜禽腸道及體表、屠宰、貯存、運輸、銷售環境，也有可能來源于屠宰或銷售人員。本研究從生豬屠宰線、豬胴體表面及生鮮豬肉表面分離到大腸桿菌，證實了大腸桿菌在豬肉生產環節中普遍存在，表明生產加工環境中加強衛生監控對控制豬肉微生物污染和降低食品安全隱患十分必要。

2.2 大腸桿菌生物被膜形成能力分析

采用微孔板結晶紫染色法評估31 株肉源大腸桿菌的生物被膜形成能力，大多菌株均可在微孔板底部見到一層淡紫色薄膜，加入乙醇溶解后，不同菌株孔板中顏色深淺不同。進一步測定OD570nm，由圖3可知，不同菌株間生物被膜形成能力存在顯著差異。31 株肉源大腸桿菌中，27 株菌株表現出生物被膜形成能力。按照臨界值ODc的生物被膜形成能力進行分類，強、中、弱、無4 種生物被膜表型的菌株數量分別為3、4、20、4 株，分別占菌株總數的9.68%、12.90%、64.52%和12.90%。

圖3 31 株大腸桿菌微孔板表面生物被膜形成能力Fig.3 Biofilm formation ability of 31 isolates of E.coli on polystyrene microplate surfaces

在實際生產中，生豬屠宰車間的溫度為13.28～16.70 ℃，平均（15.85±0.99） ℃[29]。因此本研究結合生產實際，探討15 ℃條件下肉源大腸桿菌生物被膜形成情況。研究表明，大多數食源性腐敗菌，如假單胞菌[30]、希瓦氏菌[31]等均具有一定的生物被膜形成能力且存在明顯菌株差異。本研究亦發現，肉源大腸桿菌的生物被膜形成能力存在明顯菌株差異，且大多數大腸桿菌生物被膜形成能力較弱。這與前人的一些報道類似，王嫻靜等[32]用微孔板結晶紫法評價14 株大腸桿菌O157:H7的生物被膜形成能力，發現所有菌株均具有一定的生物被膜形成能力，其中85.7%菌株成膜能力較弱且存在明顯的菌株差異性。即使大腸桿菌的成膜能力較弱，一旦形成生物被膜，對清潔劑、消毒劑等的抗性增強，不易清除，則可能成為持續的污染源頭。因此探討肉類屠宰加工環境及肉中大腸桿菌的生物被膜形成對生鮮肉安全生產和污染控制具有科學指導意義。

本研究中肉源大腸桿菌中60%以上菌株的生物被膜形成能力較弱，從這些菌株中隨機選取1 株大腸桿菌D4-18進行后續實驗。

2.3 結晶紫染色法檢測大腸桿菌D4-18生物被膜的生長過程

采用結晶紫染色法研究大腸桿菌D4-18生物被膜的形成過程。由圖4可知，大腸桿菌D4-18生物被膜在24 h時形成量較少，隨著時間延長，OD570nm逐漸增大，即生物被膜形成量逐漸增多，168 h時生物被膜量達到最大值。研究表明，生物被膜形成過程是一個動態的過程，分為起始黏附期、集聚增殖期、成熟期及脫落散播期4 個階段[33]。李安琪等[34]發現，副溶血弧菌在微孔板中37 ℃培養48～72 h時達到生物被膜的成熟階段，72～144 h時達到生物被膜的解離階段。鄧小玲等[35]報道了大腸桿菌在微孔板中37 ℃條件下形成生物被膜的動態過程，發現有部分大腸桿菌在72 h后進入脫落期。王嫻靜等[32]研究大腸桿菌O157:H7在微孔板中25 ℃條件下生物被膜形成過程，發現成膜能力較強的菌株J29培養48 h后生物被膜量緩慢增多，成膜能力中等的菌株ATCC43895在60 h后生物被膜量增長較快，168 h時達到最多，其他成膜能力弱的菌株在168 h內生物被膜量都維持在較低的相對穩定狀態。本研究中，大腸桿菌D4-18在微孔板中15 ℃條件下培養168 h生物被膜量持續增長。上述研究表明，生物被膜形成過程與菌種、菌株的生物被膜形成能力、培養溫度等成膜條件有關。

圖4 大腸桿菌D4-18生物被膜形成曲線Fig.4 Curve of biofilm formation of E.coli D4-18

2.4 大腸桿菌D4-18生物被膜形成時EPS中蛋白質和多糖含量變化

由圖5可知，成膜72 h時大腸桿菌D4-18產生了一定量胞外蛋白質和胞外多糖，隨著培養時間延長，EPS含量增加，其中L-EPS中蛋白質及多糖的含量均極顯著增加（P＜0.01），B-EPS中蛋白質含量極顯著增加（P＜0.01）。EPS基質在生物被膜發育、發展和成熟階段發揮重要作用，與菌體的黏附、支架、機械穩定性和保護作用密切相關[36]。EPS中蛋白質與多糖的含量可以在一定程度上反映生物被膜發育程度。蛋白質中含有的氨基酸及部分疏水性氨基酸增加了細菌細胞表面疏水性[37-38]，而多糖中含有的羧基、羥基等親水官能團增加了細胞的親水性。使得EPS同時具有疏水和親水的特性。多糖的黏性可以更好包裹細菌，使得菌體更加穩定地黏附在非生物表面。蛋白的疏水性增強了菌體在疏水性的不銹鋼表面定植、聚集、形成生物被膜和獲取營養的能力，從而增強了細菌對外界惡劣環境的抵抗力[39]。

圖5 大腸桿菌D4-18生物被膜中L-EPS和B-EPS蛋白質（A）及多糖（B）含量Fig.5 Content of protein (A) and polysaccharide (B) in L-EPS and B-EPS in the biofilm of E.coli D4-18

2.5 生物被膜中相關成膜基因的表達變化

大腸桿菌D4-18的3 種成膜基因papC、fimH、csgA標準曲線如表3所示，相關系數R2均大于0.99，Ct值滿足標準曲線要求。

表3 papC、fimH、csgA基因標準曲線Table 3 Standard curves for detection of papC, fimH, and csgA genes

由圖6可知，大腸桿菌在15 ℃條件下培養72 h時，papC、fimH、csgA基因的表達量分別為0.095、0.933、0.435 copies/cm2，培養168 h時papC基因表達量顯著增多（P＜0.05），fimH基因表達量極顯著增多（P＜0.01），csgA基因表達量無顯著變化。關于大腸桿菌生物被膜形成時相關基因表達方面有較多報道，朱琳等[40]研究發現，fimA基因和fliC基因編碼菌毛屬細菌的黏附結構，在生物被膜的初始黏附階段起重要作用，flu基因編碼的Ag43能促進細菌的自聚集，有利于細菌生物被膜團聚結構的形成。Surgers等[41]研究發現，papC基因的存在與生物被膜形成有很強的相關性。Ren等[42]采用DNA微陣列研究大腸桿菌生物被膜的基因表達，發現fimH基因在生物被膜形成時表達上調。Bhardwaj等[43]采用熒光定量PCR相對定量發現，csgA基因在大腸桿菌生物被膜形成時表達上調。本研究采用熒光定量PCR絕對定量同樣發現，在不銹鋼接觸表面形成的生物被膜中，papC、fimH、csgA基因進行了一定表達，且在生物被膜不同成膜階段，接觸面上相關基因表達量發生變化，表明這些基因在大腸桿菌生物被膜形成過程中發揮了不同程度的調控作用。

圖6 大腸桿菌生物被膜相關基因表達的變化Fig.6 Changes in the expression of biofilm related-genes of E.coli

需要指出的是，在實際生產環境中，多種微生物共存、多菌種混合生物被膜是更常見的存在狀態，混合生物被膜內部不同菌種之間相互作用將導致基因表達水平發生變化，形成更加緊密、復雜的微系統，生物被膜的結構和特性更復雜，抗性可能更強[44-45]。因此混合生物被膜的形成和控制值得進一步關注和重視。

3 結 論

從生豬屠宰線、豬胴體表面及生鮮豬肉表面均分離到大腸桿菌，證實了大腸桿菌在豬肉生產環節中普遍存在。大部分大腸桿菌可以形成生物被膜，雖然它們的被膜形成能力大多較弱，但生物被膜抗性強，增加了食品安全隱患，所以在生豬屠宰、豬肉加工、銷售各環節應加強衛生管理，加大清潔消毒，減少細菌及其生物被膜造成的污染。本研究發現，在大腸桿菌生物被膜形成過程中發生EPS的分泌，并受不同基因調控，這為大腸桿菌生物被膜的靶向控制提供了科學思路。本研究可為揭示肉類生產加工中大腸桿菌生物被膜的形成規律提供理論基礎。