冰鮮雞肉腐敗微生物檢測技術研究進展

王 影，王 蕊，何鴻舉，馬漢軍

（1.河南科技學院食品學院，河南 新鄉 453003；2.河南雙匯投資發展股份有限公司，河南 漯河 462000）

近年來，雞肉及雞肉制品頗受人們歡迎，雞肉主要分為熱鮮肉、冰鮮肉和冷凍肉，冰鮮雞肉是宰后將胴體迅速冷卻到0～4 ℃，并且在加工、運輸和銷售過程，溫度始終保持0～4 ℃的生鮮雞肉。冰鮮雞肉以品質鮮嫩、高營養等優點，成為人們生活中必不可少的肉食選擇，雞肉已然成為餐桌上的主要肉食[1]。由于冰鮮雞肉中蛋白質含量、水分活度較高，是微生物生長繁殖的天然培養基，因此在屠宰、分割、預冷等生產加工環節以及車輛運輸和貯藏、銷售過程中極易受到微生物污染[2-3]。相關研究發現，冰鮮雞肉在冷藏條件下（0～4 ℃）不到1 周就會發生腐敗，主要表現為發酸、發黏、有菌斑、外觀明顯變色等[4-6]。腐敗菌在肉品貯藏過程中增殖，產生異味，是影響產品貨架期的主要微生物[7-8]。

本文通過分析冰鮮雞肉中的腐敗微生物，結合相關研究確定冰鮮雞肉中優勢腐敗菌，并綜述針對腐敗優勢菌的傳統檢測方法和現代檢測新技術的研究進展，為冰鮮雞肉質量檢測、貯藏保鮮及高效防腐提供理論基礎。

1 冰鮮雞肉優勢腐敗菌

由于不同肉的組織形態、屠宰加工方式等不同，眾多學者對不同肉的菌群分布及生長趨勢研究發現，不同肉中腐敗菌群類別及生長趨勢顯著不同[9-10]。目前很多學者對冰鮮雞肉腐敗優勢菌已有相關研究，傳統培養方式下優勢腐敗菌相差不明顯，并且變化趨勢相一致。孫彥雨[3]結合聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）和變性梯度凝膠電泳（denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE）2 種方法形成PCR-DGGE技術，研究冰鮮雞肉貯藏過程中不同時期的菌相變化，得出乳酸菌、肉桿菌、熱殺索絲菌、腐敗希瓦氏菌等是冰鮮雞肉主要優勢菌。梁慧等[11]研究表明，從冷鮮雞肉初始菌中分離出主導菌群為乳酸菌和葡萄球菌，二者所占比例最大，為35%。劉朏[12]采用傳統培養結合PCR-DGGE，確定冷鮮雞優勢菌為腸桿菌、假單胞菌、葡萄球菌、不動桿菌、莫拉克斯和洋蔥伯克霍爾德屬。張秋勤[13]通過結合傳統培養和PCR-DGGE技術，確定雞肉的優勢腐敗菌為不動桿菌、假單胞菌、肉桿菌和魏斯氏菌屬。通過上述研究結果可知，導致冰鮮雞肉腐敗的微生物主要為假單胞菌屬、嗜熱環絲菌、氣單胞菌、乳桿菌屬和腸桿菌科等[14]。鑒于傳統分離技術和檢測新技術之間存在差異，綜合2 種檢測方法確定導致冰鮮雞肉腐敗的優勢菌為熱殺索絲菌、假單胞菌、腐敗希瓦氏菌、乳酸菌、肉桿菌、不動桿菌屬、莫拉氏菌、氣單胞菌屬及魏斯氏菌屬。根據《伯杰氏系統細菌學手冊》，冰鮮雞肉中的優勢腐敗微生物特性如表1所示。

表1 冰鮮雞肉中優勢腐敗菌及其特征Table 1 Characteristics of dominant spoilage bacteria in chilled chicken

2 傳統微生物檢測方法

傳統微生物檢測依據國標4789系列標準，如GB 4789.2—2016《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗菌落總數測定》、GB 4789.35—2016《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 乳酸菌檢驗》、GB 4789.15—2012《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 霉菌和酵母菌計數》、GB 4789.28—2013《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 培養基和試劑的質量要求》、GB 4789.4—2016《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 沙門氏菌檢驗》、GB 4789.14—2016《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 蠟樣芽孢桿菌檢驗》及GB 4789.13—2012《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 產氣夾膜梭菌檢驗》。

傳統微生物檢測主要是為微生物提供適宜的生長環境，如需氧或兼性厭氧條件下pH 6.0～7.5、35～37 ℃培養18～48 h，以及所必需的營養物質，如水分、碳源、氮源等。傳統培養包含前增菌培養和分離培養2 個步驟，根據微生物種類，選擇不同培養基進行接種、培養，根據菌落形態特征、革蘭氏染色結果等再進行下一步的分離和鑒定[15]。傳統檢測作為經典方法，檢測結果準確、直觀、成本低、所需設備少，為肉制品加工企業檢測首選。但是傳統檢測方法中存在一些不確定因素，如環境中的微生物對制備的培養基及整個檢測過程都有污染風險，進而影響結果；在培養、分離、鑒定過程中，致病菌可能污染空氣環境，導致檢驗人員受到影響，造成一定的生物危害。傳統檢測方法操作繁瑣，需提前配制藥品，使用的稀釋管、槍頭等用品需要高壓滅菌，樣品處理、稀釋、培養、計數等一般需要48 h以上，才能得到分離純化的單個菌落，再進行鑒定，耗時耗力。而且傳統方法鑒定過程不確定因素較多，易被污染，結果準確率低，能夠分離和鑒別的菌株種類有限，不能夠充分反映所檢測樣品中微生物的真實性[16]。要想得到準確檢測結果的同時縮短檢測時間、降低檢測成本，就需要充分結合傳統分離和現代檢測2 種方法，這也是未來食品檢測發展的需要。

3 現代檢測新技術

3.1 分子檢測技術

3.1.1 分子印跡技術

分子印跡技術即利用分子印跡聚合物（molecularly imprinted polymers，MIPs），模擬酶與底物或者抗體與抗原之間的相互作用，對印跡分子進行專一識別的技術[17-18]?；诜肿佑≯E技術制備而成的高分子聚合物可通過三維空間結構和分子間作用力實現與模板分子或類似物的特異性識別，該技術具有專一性、結果準確度高、檢測過程快速、整體實用性高等優點，在活性成分分離、模擬酶催化危害物降解等方面進行了廣泛研究[19-20]。

Hu Tianliang等[21]基于該原理以大腸桿菌O157:H7為檢測模板，建立大腸桿菌O157:H7的電化學發光檢測方法。在最優條件下，檢測范圍為10～107CFU/mL，檢出限為8 CFU/mL。Idil等[22]以大腸桿菌為模板，通過微接觸紫外引發印跡聚合方法，制備大腸桿菌MIPs金電極傳感器的同時建立電容式電化學檢測方法。大腸桿菌的檢測范圍為102～107CFU/mL，檢出限為70 CFU/mL。Wu Jikui等[23]以大腸桿菌為模板，吡咯為單體，采用電化學聚合方法制備玻璃電極MIPs電化學傳感器，并建立了阻抗型電化學檢測方法，該方法可在1 h內實現對大腸桿菌O157:H7的檢測，檢測定量限為103CFU/mL，回收率為96.0%～107.9%。Fu Kaiyue等[24]采用微接觸印跡法在玻璃板上制備副溶血弧菌MIPs膜，該印跡膜對副溶血弧菌具有較好的選擇吸附性，捕獲率達62.9%。

3.1.2 PCR檢測技術

PCR技術的基本原理與DNA復制過程高度相似，是特定DNA分子片段的生物學技術。其特異性來源于與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物[25-27]?？梢酝ㄟ^破碎細胞、提取核酸、PCR擴增、凝膠電泳純化、核酸測序及數據庫比對分析等過程進行鑒定。PCR技術具有樣品前處理操作簡單、檢測周期短、靈敏度高等優點[28]。

DGGE被稱為DNA指紋圖譜技術，采用PCR-DGGE技術研究雞肉中微生物，在準確分析微生物菌群及其生長多樣性的同時，還能體現微生物在不同生長時期的詳細變化[3]。實時熒光定量PCR技術通過擴增反應，在監測熒光信號的基礎上，繪制擴增曲線進行深入分析，在實際檢測過程中具有極高的精準性和準確度[29-31]。

Li等[32]運用PCR-DGGE技術研究冷藏豬肉，分離出假單胞菌、熱殺索絲菌和乳酸菌是主要腐敗菌。孫彥雨[3]通過PCR-DGGE技術和傳統技術的融合，確定乳酸菌、肉桿菌、熱殺索絲菌和腐敗希瓦氏菌等是冰鮮雞肉主要優勢菌。李鳳珠等[33]采用TaqMan探針和SYBR Green染料2 種方法，實現對金黃色葡萄球菌的快速定量檢測，對目前已知變種菌株和相關菌株的檢測特異性接近100%。楊曼瓊[34]通過熒光定量PCR等技術實現假單胞菌的快速有效檢測。

3.1.3 等溫擴增技術

等溫擴增技術是指可以在恒定的溫度下對特定核酸片段進行擴增的技術，本文介紹環介導等溫擴增技術和交叉引物擴增技術[35]。

環介導等溫擴增技術是一種在恒溫條件下進行核酸擴增、能在體外迅速完成對靶序列上億次擴增的痕量檢測技術[36]。環介導等溫擴增技術檢測方式多樣，關鍵在于找到合適的靶基因并設計相應的特異性引物，從而實現定性檢測。Ledlod等[37]通過結合環介導等溫擴增技術和雙向側流試紙方法，可快速檢測肉及肉制品中單核細胞增生李斯特氏菌，檢出限達20 CFU/g。Chen Xingxing等[38]開發了基于等溫擴增技術的豬肉制品金黃色葡萄球菌快檢方法，檢出限達50 CFU/mL。張晉豪等[39]以冷鮮雞新鮮度與假單胞菌數量的高度正相關性為基礎，建立的檢測方法對假單胞菌特異性、擴增性顯著提高，在最優條件下靈敏度為3.05×102CFU/mL。

交叉引物恒溫擴增（cross priming amplification，CPA）技術能夠實現高效擴增目標核酸，但是需要在恒定的溫度條件下，通過特殊設計的引物和探針才能實現[40]。CPA技術具有特異性高、操作過程簡單、恒溫擴增過程迅速、不易被污染、成本低等優點[41]。向勇[42]根據銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa，PA）的特異性基因建立的PA-CPA方法操作簡便、特異性強、準確度高，在62 ℃恒溫擴增45 min，靈敏度是常規PCR的100 倍，而且重復性和穩定性良好，可用于銅綠假單胞菌的快速檢測。

3.1.4 高通量測序技術

高通量測序技術又稱為下一代測序技術或大規模平行測序技術[43-44]，可同時測序大量核酸分子，該技術在檢測普通微生物的同時還能檢測到那些不易培養、豐度低以及難以分離的微生物[45-46]，與傳統微生物學方法相比，能夠更好地解釋微生物基因的組成和多樣性，具有檢測快速、通量高、靈敏度高、能夠實現樣品間平行分析等優點[47]。隨著測序技術的發展和成本的下降，高通量測序技術在肉及肉制品腐敗微生物檢測及菌群多樣性方面有著廣泛應用[48]。

Xi La等[49]利用Illunima MiSeq高通量測序技術分析麥曲樣品中真菌的群落結構和多樣性，麥曲中的主要菌門為子囊菌門，平均相對含量達到90.21%。Dong Yun等[50]通過MiSeq高通量測序，分離出臘肉中的主要細菌門為硬壁菌門和變形菌門，平均相對含量分別為54.05%和44.28%。田建軍等[51]采用Illumina MiSeq技術分析風干肉制品中細菌16S rRNA V4區基因序列，在自然發酵和人工調控肉制品中分別鑒定出241 個和102 個細菌屬，細菌多樣性在屬水平上差異顯著（P＜0.05）。

3.2 光譜檢測技術

3.2.1 高光譜成像技術

高光譜成像技術是通過融合光譜和圖像2 種技術，可以對樣品快速、無損、高效檢測的光電分析技術，檢測過程中能夠同時得到樣品的光譜和圖像信息[52]。光譜波段涵蓋范圍廣，分辨率達到納米級別，是一種融合光學、計算機、信號處理學的無損、快速、準確、高效的現代化技術[53-54]。

王慧等[55]通過高光譜數據分析所建立雞肉嫩度預測模型的相關系數為0.94。何鴻舉等[56]利用900～1 700 nm近紅外高光譜成像系統對冷鮮雞胸肉的乳酸菌含量進行檢測，通過連續投影算法（successive projections algorithm，SPA），根據篩選出的最優波長，建立的SPAPLS模型預測相關系數達到0.949，驗證集均方根誤差為0.439（lg（CFU/g））。Feng Yaoze等[57]對雞肉中的腸桿菌科進行研究，通過使用近紅外高光譜成像建立的雞肉中腸桿菌科預測模型相關系數為0.93。何鴻舉等[58]基于近紅外高光譜成像技術，通過使用基線校正（baseline correction，BC）、偏最小二乘（partial least squares，PLS）算法等，研究熱殺索絲菌含量在雞胸肉冷藏過程中的變化，通過BC預處理，構建的全波段PLS熱殺索絲菌預測模型相關系數接近1.0。

3.2.2 近紅外光譜技術

近紅外光譜是對波長760～2 600 nm、可見光譜區及中紅外光譜區間電磁波的描述[59]。近紅外光譜技術是一種能夠實現預測樣品化學組成及其含量的無損檢測技術，并且可以關聯樣品本身的性質特征，來建立校正模型。近紅外光譜源于分子振動，可反映分子化學鍵基頻振動的倍頻和合頻吸收，結合化學計量學方法PLS[60]用于食品質量檢測，能夠實現快速、無損、多組分同時檢測，廣泛應用于鮮豬肉、鮮雞肉等肉類及肉制品的檢測中[61]。

Alexandrakis等[62]利用近紅外光譜技術定性檢測雞胸肉中李斯特菌、熒光假單胞菌、惡臭假單胞菌和大腸桿菌。張雷蕾[63]通過近紅外高光譜成像技術，建立冷卻豬肉中假單胞菌的預測模型，相關系數為0.948。王名星[64]運用嗅覺可視化及近紅外光譜技術，通過多傳感器信息融合技術分離鑒定雞肉中假單胞菌，建立的反向傳播人工神經網絡模型識別效果顯著提升。

3.2.3 拉曼光譜技術

拉曼光譜技術是一種分子水平的光譜分析技術。樣品被激光照射后，大部分光以與入射光相同的頻率發生散射（瑞利散射），但是仍有少量入射光以不同于入射光的頻率發生散射，即拉曼散射[65]。拉曼光譜技術具有樣品前處理簡單無損、檢測過程快速、全程操作簡便等特點。但是拉曼光譜易受干擾，導致信號較弱，實現痕量物質的快速檢測可通過表面增強拉曼，即通過貴金屬表面糙化處理進而增強拉曼信號[66]。

Ma Xiaoyuan等[67]在多刺納米金粒子上修飾巰基化適配體作為表面增強拉曼納米探針，檢測豬肉中沙門氏菌，最優條件下檢測限可達4 CFU/mL。Zhang Hui等[68]用適配體固定化磁性納米金粒子捕獲豬肉中金黃色葡萄球菌，優化后表面增強拉曼法檢出限為35 CFU/mL，加標回收率為94.12%～102.75%。Argyri等[69]使用拉曼光譜結合偏最小二乘回歸分析透氧和氣調2 種包裝的牛肉餡5 ℃貯藏期間的腐敗情況，精確檢測出菌落總數、乳酸菌數和腸桿菌數。楊鴻博[70]采用拉曼光譜技術預測貯藏21 d的牛肉中菌落總數和乳酸菌數的能力相關系數為0.75～0.99，驗證集均方根誤差為0.38～0.61。

3.3 免疫分析法

3.3.1 酶聯免疫法

酶聯免疫吸附測定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）是在保持抗體（抗原）活性的基礎上連接到固相載體或酶上制成的功能化載體或酶標抗體（酶標抗原）[71]。通過建立功能化載體以催化底物檢測體系，逐步實現利用顏色變化判斷致病菌的種類及數量。該方法還可以檢測抗體、其他大分子及小分子物質[72]。但是存在試劑盒需低溫存放、昂貴、壽命短、檢測中酶的活性易受環境影響、重復性和準確性差等問題。

謝琿等[73]建立黃曲霉毒素B1（aflation B1，AFB1）間接競爭ELISA檢測法，檢測限為1.04 μg/L，通過該方法與進口試劑盒檢測結果相比，具有較好的重復性，可以用于快速篩檢飼料中AFB1。姚永忠等[74]在食品質量安全檢測工作中，采用生物素-親和素斑點-ELISA法檢測李氏桿菌，檢測靈敏度達到104個/mL，并且整體檢測過程易于操作，不易受環境污染，檢測結果準確度高。

3.3.2 膠體金免疫層析法

膠體金免疫層析法是將已知的抗原或抗體固定在具有特異性的載體上，利用抗原-抗體之間的顯色反應，通過標記、免疫反應及色層分析法等形成的新型免疫檢測技術[75]。其優勢為檢測結果直觀、樣品前處理方便、抗原-抗體特異性強、儀器和試劑價格較低等[76]。Song Chunmei等[77]開發的膠體金免疫層析試紙條，可用于檢測肉凍等食品中志賀氏菌和大腸桿菌O157:H7，具有檢測快速、結果準確度高、價格低廉的優點。

檢測新技術應用優缺點詳見表2。

表2 檢測新技術在腐敗菌中的應用Table 2 Application of new technologies in detecting spoilage bacteria

4 結 語

本文綜述冰鮮雞肉中的腐敗微生物，確定冰鮮雞肉中優勢腐敗菌，分析不同類型檢測新技術的研究進展及應用情況，均能夠實現快速、無損、高效檢測，但是新技術仍有諸多不足。PCR檢測技術樣品前處理復雜，檢測過程易受環境和操作污染，所需試劑較貴、對檢測人員要求較高；高光譜技術采集信息更全面的同時數據量大、干擾信息多、數據分析較繁瑣；近紅外光譜技術檢測過程中易出現光譜帶寬大、強度低、特征峰重疊、檢測易受干擾等情況。在我國，新技術、儀器商品化程度低，多數處于實驗室研究階段，不能滿足實際生產檢測需求。目前許多食品生產企業在實際生產中腐敗菌、致病菌等微生物的分離檢測仍以傳統方法為主，新技術使用率較低。

未來我國微生物檢測發展方向應為操作簡便化、儀器產品化，通過各類學科技術的交叉與引進，形成現代化食品微生物檢測技術體系，滿足社會、企業等實際生產需要，不斷提高新技術的整體適用性，推動微生物檢測的發展，并廣泛應用到食品衛生檢測的各個領域。