天然精油協同等離子體對鹽水鴨殺菌保鮮及脂質氧化的調控

錢 婧，王 晨，嚴文靜，章建浩

（南京農業大學食品科學技術學院，江蘇 南京 210095）

鹽水鴨作為醬鹵肉制品，水分活度高，具有現做即食、不適宜貯藏的特點，因此產品的貨架期普遍較短。此外，由于其特殊的低溫煮制工藝，不適宜進行高溫高壓的傳統滅菌，故難以大規模生產和擴大銷售范圍[1]。雖然現有的真空包裝或經商業殺菌的鹽水鴨具有較長的保質期，但其特有的香酥口感和風味會受到影響。因此，開發一種適用于低溫肉制品的新型殺菌技術是目前該行業發展的重要瓶頸。

低溫等離子體（cold plasma，CP）作為食品行業的一種新型殺菌技術，具有處理溫度低、營養物質破壞小、不破壞產品質構、顯著延長食品保質期等優點，近年來備受關注[2-4]。在高壓條件下，空氣被電離形成含有活性氧、活性氮、原子、電子、離子的第4態，即為等離子體[5-6]。CP處理過程中產生的活性氧和活性氮等活性物質已被證明有利于微生物的失活[7-8]，但當CP應用于肉類等食物時，會導致脂質氧化，影響其感官品質[3,9]。Choi等[10]研究發現，魚干經等離子體處理后其硫代巴比妥酸反應物（thiobarbituric acid reactive substance，TBARs）值與對照組相比增加1.5 倍。Wang Xiaoting等[11]采用介質阻擋放電CP處理牛肉餅，結果表明，在貯藏過程中CP處理組樣品的TBARs值顯著升高。但當一種新的殺菌技術應用于食品時，在保證高效殺菌的同時必須確保不會對產品產生重大影響。微生物污染和脂質氧化是肉質惡化的主要原因，會導致肉的色、香、味發生不良變化，營養價值和安全性降低[12]，因此，調控肉的脂質氧化現象具有重要意義。富含酚類物質的精油是一個很好的選擇，它已被廣泛應用于食品的抗氧化[13-14]。此外，精油也可用于食品的抗菌保鮮，其抗菌活性與單萜類、酚類、醛類和酮類化合物密切相關[15]。Viuda-Martos等[16]發現，精油中活性成分會作用于細菌細胞膜的磷脂層，并破壞脂質和蛋白質的結構。El Atki等[17]進一步指出，不同精油經復合后，在不增加濃度的情況下可提高其抗菌效果，如將肉桂精油與其他植物精油復合后，與單一精油相比，對細菌的抑菌效果顯著提高。

本研究采用復合精油（牛至精油、肉桂精油、迷迭香精油）協同CP技術對鹽水鴨進行處理，以實現在殺菌和保持產品品質上達到平衡。研究CP處理對復合精油基礎理化性質，包括大腸桿菌抑菌性、總酚含量、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除率的影響；并將復合精油協同CP處理鹽水鴨，對貯藏期內鹽水鴨的菌落總數、大腸桿菌菌落總數、色澤及TBARs值進行測定，為復合精油協同CP技術在低溫肉制品保鮮中的應用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鹽水鴨由南京鹽水鴨加工企業提供。

牛至精油 上海Macklin科技有限公司；肉桂精油上海源葉生物科技有限公司；脂溶性迷迭香 上海瑞祥生物科技有限公司；福林酚 上海瑞永生物科技有限公司；沒食子酸 上海阿拉丁生物科技有限公司；DPPH 梯希愛（上海）化成工業發展有限公司。

1.2 儀器與設備

MAP-H360盒式氣調保鮮包裝機 蘇州森瑞保鮮設備（科技）有限公司；BK130/36介質阻擋放電CP設備美國Phenix Technologies公司；CR-400色差儀日本柯尼卡-美能達控股公司。

1.3 方法

1.3.1 復合精油的制備

用體積分數40%乙醇溶液分別配制質量分數均分別為0.050%、0.075%、0.100%、0.125%的牛至精油和肉桂精油，將2 種相同質量分數的精油再與0.3 g/kg脂溶性迷迭香混合，復合精油質量分數以牛至精油/肉桂精油的質量分數計。復合精油的具體配制方法如下：稱取30 mg脂溶性迷迭香提取物于250 mL燒杯中，加入50 μL相應質量分數的牛至精油和肉桂精油，加入40 mL無水乙醇，超聲至完全分散，再加入60 mL無菌超純水，超聲15 min。

1.3.2 CP協同復合精油的抑菌實驗

從-40 ℃取出傳代培養2 次的大腸桿菌菌種保藏管，加至營養肉湯中進行活化，于37 ℃、300 r/min的條件下培養10 h。菌液4 ℃、7 500 r/min離心10 min，去上清，生理鹽水清洗3 次，通過調整菌液光密度將菌液濃度稀釋至108CFU/mL。

將菌液轉移至無菌12 孔板中，每5 mL菌液中加入1 mL復合精油，輕微混勻。將孔板置于聚乙烯熱成型盒（17 cm×12 cm×3.2 cm）內，用包裝機進行聚丙烯薄膜密封。隨后置于CP設備內進行處理，處理電壓65 kV[18]，處理時間30 s，處理后放置2 h。將未經CP處理的組別作為對照組，經CP處理的組別記為CP組。參照GB 4789.3—2016《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 大腸菌群計數》對大腸桿菌菌落數進行測定。

1.3.3 復合精油總酚含量的測定

參照Thiruvengadam等[19]的方法并略作修改。用體積分數40%乙醇溶液配制0.1 mg/mL沒食子酸溶液，取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL沒食子酸溶液置于具塞玻璃管中，分別加入6 mL超純水和0.5 mL 1 mol/L福林酚試劑，輕微振蕩后，避光靜置10 min。用0.1 g/mL Na2CO3溶液分別定容至10 mL，充分混勻，置于暗處反應2 h，用紫外分光光度計于763 nm波長處測定吸光度，并繪制該質量濃度梯度下的標準曲線。

吸取0.1 mL經CP處理或未經CP處理的復合精油，加入6 mL超純水和0.5 mL福林酚試劑，振蕩混勻避光靜置10 min后，加入3.4 mL 0.1 g/mL Na2CO3溶液，置于暗室使其充分反應2 h，于763 nm波長處測定吸光度，根據標準曲線得到總酚含量。樣品中總酚含量以每克樣品所含沒食子酸質量計，單位為mg/g。

1.3.4 復合精油DPPH自由基清除率的測定

參照Li Xican等[20]的方法稍作改進。稱取8 mg DPPH，用100 mL無水乙醇充分溶解，制得0.2 mmol/L DPPH-乙醇溶液（現配現用）。吸取2 mL經CP處理或未經CP處理的復合精油于具塞試管中，并與等體積DPPH溶液振蕩均勻，室溫暗處靜置反應0.5 h，于517 nm波長處測定吸光度。同時，測定2 mL DPPH溶液與2 mL體積分數40%乙醇溶液混合后的吸光度。復合精油的DPPH自由基清除率按式（1）計算。

式中：A0為DPPH溶液與體積分數40%乙醇溶液反應后的吸光度；A樣為DPPH溶液與復合精油反應后的吸光度。

1.3.5 鹽水鴨樣品處理

將鹽水鴨切塊，部分樣品置于聚乙烯熱成型盒（17 cm×12 cm×3.2 cm），每盒100 g，用包裝機進行聚丙烯薄膜密封；另一部分樣品置于0.100%復合精油（由1.3.2節得出的最優質量分數）中浸泡5 min，瀝干后包裝密封。按表1條件進行處理，于4 ℃貯藏。貯藏至0、6、12、18 d時，從4 組中各隨機抽取3 盒進行各項指標的測定。

表1 鹽水鴨樣品的不同處理條件Table 1 Different treatment conditions for salted duck samples

1.3.6 鹽水鴨中菌落總數及大腸桿菌的測定

參照GB 4789.2—2016《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 菌落總數測定》進行菌落總數測定，參照GB 4789.3—2016進行大腸桿菌測定。

1.3.7 鹽水鴨色差值的測定

采用色差儀測定樣品表面亮度值（L*）、紅度值（a*）和黃度值（b*），每個樣品測定3 次，每組隨機選3 個樣品，樣品總色差（ΔE）按式（2）計算[21]。

式中：L0*、a0*和b0*為樣品初始顏色參數；L*、a*和b*為樣品貯藏過程中的顏色參數。

1.3.8 鹽水鴨TBARs值的測定

參照Xiong Zhenjie[22]、彭澤宇[23]等方法并加以修改。稱取（10.0±0.1）g肉樣，剪碎后加入50 mL 75 g/L三氯乙酸溶液，混勻，加塞密封，于37 ℃下恒溫水浴振蕩30 min，用雙層濾紙過濾2 次，加入5 mL 0.02 mol/L硫代巴比妥酸溶液，混勻，于90 ℃下水浴40 min，取出冷卻至室溫，7 000 r/min離心10 min，取上清。在上清液中加入5 mL氯仿，混勻，靜置分層，取上清于532 nm波長處測定吸光度。TBARs值按式（3）計算。

式中：m為樣品質量/g；A532nm為樣品在532 nm波長處的吸光度。

1.4 數據處理

所有實驗重復3 次，采用SPSS Statistics 20.0軟件進行單因素方差分析。采用Duncan’s多重比較法進行顯著性分析（P＜0.05）。對于總酚含量和DPPH自由基清除率測定結果采用t檢驗法進行顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 CP協同復合精油對大腸桿菌的抑菌效果

由圖1可知，當不添加復合精油時，40%乙醇溶液對大腸桿菌幾乎沒有抑菌性，協同CP處理30 s后，對大腸桿菌的抑菌效果仍不明顯，僅能降低0.56（lg（CFU/mL））。隨著復合精油質量分數的增加，大腸桿菌菌落數隨之降低，且當復合精油協同CP處理時，對大腸桿菌的抑菌效果更為明顯。當復合精油質量分數為0.075%且協同CP處理時，大腸桿菌菌落數由5.2（lg（CFU/mL））降至2.75（lg（CFU/mL））。當復合精油質量分數為0.100%～0.125%且協同CP處理時，大腸桿菌未檢出。El Atki等[24]研究發現，肉桂精油與百里香酚和香芹酚復合使用對大腸桿菌具有顯著的抑菌作用。此外，肉桂精油中的主要活性成分肉桂醛具有較好的保鮮抑菌性，但分子遇光、熱、氧不穩定易降解，與天然多酚復配可有效提高肉桂醛的穩定性[25]。以上結果表明，CP協同復合精油處理會加速細菌的死亡。

圖1 復合精油協同CP處理對大腸桿菌抑菌效果的影響Fig.1 Inhibitory effect of essential oil blend combined with CP on E.coli

2.2 CP處理對復合精油總酚含量和DPPH自由基清除率的影響

由表2可知，隨著復合精油質量分數的增加，其總酚含量和DPPH自由基清除率顯著提高。且隨著總酚含量的增加，對應的DPPH自由基清除率也隨之增強，表明復合精油的抗氧化能力逐漸增強，這與盧俊宇等[26]研究中茶多酚復合膜總酚含量和DPPH自由基清除率的變化趨勢一致。與對照組相比，CP組總酚含量略有下降，由0.27～0.43 mg/g降至0.25～0.41 mg/g；DPPH自由基清除率也略有降低，從89.11%～94.25%降至88.91%～93.52%。以上結果表明，CP處理并不會對復合精油的總酚含量和DPPH自由基清除率造成顯著影響。但Umair等[27]研究表明，CP處理會對胡蘿卜汁中酚類物質的穩定性造成影響；同時Kodama等[28]研究發現，CP處理會造成柑橘精油中烯萜類物質含量降低。這可能歸因于復合精油的初始總酚含量相對較高，且CP處理電壓及時間相對較低/短，故未對復合精油的抗氧化特性造成顯著影響。

表2 CP處理對復合精油總酚含量和DPPH自由基清除率的影響Table 2 Effect of CP on the total phenol content and DPPH radical scavenging capacity of essential oil blend

2.3 不同處理條件對鹽水鴨菌落總數及大腸桿菌的影響

由圖2可知，對照組菌落總數在貯藏18 d內由4.46（lg（CFU/g））增至6.52（lg（CFU/g）），CP組由2.97（lg（CFU/g））增至5.69（lg（CFU/g）），EO組由3.12（lg（CFU/g））增至6.23（lg（CFU/g）），而EO＋CP組僅由2.12（lg（CFU/g））增至5.01（lg（CFU/g））。以上結果表明，CP處理和EO處理均對樣品具有抑菌效果，且EO協同CP處理的抑菌效果更為顯著。按照GB 2726—2016《食品安全國家標準 熟肉制品》，對照組菌落總數貯藏6 d已達到臨界值4.903（lg（CFU/g）），相比之下，EO＋CP組抑菌效果最佳，當貯藏至12 d時其菌落總數為3.75（lg（CFU/g）），仍低于臨界值，且貯藏18 d時才增至5.01（lg（CFU/g））。由此可知，EO協同CP處理可顯著降低鹽水鴨中的菌落總數，這與Moradi[29]、Gao Yue[30]等的研究相一致。

圖2 復合精油協同CP處理對貯藏期內鹽水鴨菌落總數的影響Fig.2 Effect of essential oil blend combined with CP on the total bacterial count of salted duck during storage

由圖3可知，貯藏0 d時，EO組與EO＋CP組大腸桿菌菌落數無顯著差異，分別為1.08、0.87（lg（CFU/g）），對照組和CP組分別為2.65、1.89（lg（CFU/g））。但隨著貯藏時間的延長，EO組與EO＋CP組的差異增大，EO＋CP組菌落數增長更為緩慢，表明CP處理和復合精油具有較好的協同抑菌作用。

圖3 復合精油協同CP處理對貯藏期內鹽水鴨大腸桿菌菌落數的影響Fig.3 Effect of essential oil blend combined with CP on E.coli count of salted duck during storage

2.4 不同處理條件對鹽水鴨色澤的影響

肉品的色澤和外觀是消費者首要考慮的產品屬性[31]。ΔE越大，表明樣品的色差值與原始色澤之間的差異越大。由圖4可知，隨著貯藏時間的延長，鹽水鴨ΔE顯著上升，這可能與樣品表面的腐敗變質程度有關[32]。

圖4 復合精油協同CP處理對貯藏期內鹽水鴨ΔE的影響Fig.4 Effect of essential oil blend combined with CP on the ΔE of salted duck during storage

由圖5可知，當4 組樣品貯藏18 d時，對照組已經明顯發生腐敗變質，肉色變暗，樣品表面出現小顆粒狀物質，且具有黏性。相比之下，在貯藏過程中，CP組和EO組間的ΔE差異不顯著（圖4），在貯藏末期，2 組樣品表面只是部分出現顆粒狀異物。EO＋CP組樣品則在外觀色澤上品質最佳。

圖5 復合精油協同CP處理對貯藏18 d后鹽水鴨外觀的影響Fig.5 Effect of essential oil blend combined with CP on the appearance of salted duck after 18 days of storage

2.5 不同處理條件對鹽水鴨TBARs值的影響

TBARs值反映丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量，MDA是脂質二級氧化的主要產物，也是肉類制品中最常用的脂質氧化指示物。由圖6可知，樣品的TBARs值隨著貯藏時間的延長而增加，對照組樣品由1.91 mg/kg增至5.84 mg/kg，CP組由3.29 mg/kg增至6.87 mg/kg，EO組由0.94 mg/kg增至3.95 mg/kg，而EO＋CP組僅由1.12 mg/kg增至4.58 mg/kg。在所有組別中，CP組樣品的TBARs值最高，EO組最低。此外，EO＋CP組樣品的TBARs值低于對照組。表明復合精油處理不僅能緩解CP處理對鹽水鴨造成的脂質氧化，且能減弱樣品自身在貯藏期內的脂質氧化現象。這與Gao Yue等[30]的研究結果一致，在雞肉餅中添加1%迷迭香提取物可顯著降低CP處理和非CP處理組樣品貯藏期內的TBARs值。

圖6 復合精油協同CP處理對貯藏期內鹽水鴨TBARs值的影響Fig.6 Effect of essential oil blend combined with CP on TBARs value of salted duck during storage

3 結 論

本研究分析復合精油協同CP處理對鹽水鴨品質的影響，以調控CP處理導致的肉品脂質氧化現象。結果表明：當復合精油質量分數為0.100%～0.125%且協同CP處理大腸桿菌菌液時，大腸桿菌未檢出；且CP處理未對復合精油的抗氧化特性造成顯著影響；同時，復合精油協同CP處理可使鹽水鴨貯藏時間顯著延長，且對表觀品質無顯著影響，并能減緩產品貯藏過程中的脂質氧化現象。本研究結果為低溫肉制品的保鮮提供了參考，為分析其在肉制品中應用的可行性及前景，后續研究將進一步探討精油與CP聯合處理對產品風味的影響。