副干酪乳桿菌Z17-殼聚糖復配對大腸桿菌O157:H7的抑菌效果及作用機制

谷恒梅，馬鑫敏，趙 宇，楊衛星，孟 鋒，康艷萍，陳 萍

（吉林農業大學食品科學與工程學院，吉林 長春 130118）

大腸桿菌O157:H7是造成人類食源性疾病的主要病原體[1]。美國疾病預防與控制中心報告顯示，2006年美國每10萬 人中就有3.4萬 人感染大腸桿菌O157:H7[2]；2012年在德國因食用被大腸桿菌O157:H7污染的冷凍草莓引起該國最大的食源性疾病爆發，約11 000 人感染[3]。

乳酸菌具有抑制致病菌和延長食品保質期的作用，其主要通過代謝產物有機酸、細菌素來抑制細菌的生長繁殖[4-5]。Wang Ni等[6]研究發現通過添加植物乳桿菌無細胞發酵上清液和控制培養基pH值能有效抑制地衣芽孢桿菌形成生物膜，并延緩細菌生物膜的形成；孫悅等[7]篩選的乳酸菌XCT1-1無細胞發酵上清液的粗提物能夠破壞耐藥性大腸桿菌細胞壁和細胞膜。研究發現，副干酪乳桿菌作為天然生物抑菌劑被廣泛應用于食品安全生產中，其代謝產物副干酪乳桿菌無細胞發酵上清液是能夠對宿主產生積極影響的可溶性物質[8]。

殼聚糖是天然的抑菌劑，其相容性較好且安全無毒[9]。王月慧等[10]研究發現殼聚糖可與細菌細胞內物質反應，阻止細菌細胞生長代謝從而達到抑菌作用。本課題組前期研究發現，將具有協同抑菌作用的殼聚糖與副干酪乳桿菌無細胞發酵上清液粗提物復配使用可提高抑菌活性，降低單一抑菌劑的使用量，但兩者復配的抑菌機理仍有待深入探索。因此，本研究以副干酪乳桿菌無細胞發酵上清液粗提物與殼聚糖復配作為抑菌劑，對草莓中大腸桿菌O157:H7進行處理，并對抑菌效果進行評價，同時通過流式細胞術、傅里葉變換紅外光譜、拉曼光譜及掃描電子顯微鏡技術進行分析以揭示其抑菌機制。

1 材料與方法

1.1 菌株、材料與試劑

大腸桿菌O157:H7（CICC21530）、副干酪乳桿菌Z17保藏于吉林農業大學食品安全實驗室。

丹東‘九九’草莓購于長春歐亞超市。

碘化丙啶 美國Beckman Coulter公司；殼聚糖（脫乙酰度大于90%） 深圳市富晟生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

DXR3顯微共聚焦激光拉曼光譜儀 美國賽默飛世爾公司；SU8010掃描電子顯微鏡 日本日立公司；BDLSRFortessa流式細胞儀 美國BD公司；UV-1800紫外分光光度計 日本島津公司。

1.3 方法

1.3.1 副干酪乳桿菌Z17-殼聚糖復配最佳抑菌條件的確定

1.3.1.1 大腸桿菌O157:H7菌懸液制備

參照王子元等[11]的方法，將大腸桿菌O157:H7菌液以1%的接種量接種于無菌胰酪大豆胨（tryptic soy broth，TSB）液體培養基，置于搖床中，在37 ℃、180 r/min條件下培養24 h，所得菌液10 000 r/min離心15 min，用無菌生理鹽水洗滌菌體3 次，加入去離子水稀釋，使菌液濃度達到108CFU/mL。

1.3.1.2 草莓樣品人工污染

參照Eunice等[12]的方法，草莓用自來水清洗后再用體積分數2%次氯酸鈉水溶液浸泡2 min，放入大腸桿菌O157:H7菌懸液中浸泡10 min，自然干燥。

1.3.1.3 副干酪乳桿菌Z17粗提物制備和最小抑菌質量濃度的測定

參照胡誠[13]的方法稍作修改，將副干酪乳桿菌Z17菌液以1%的接種量在無菌MRS液體培養基中連續活化2 代，10 000 r/min離心15 min，使用0.45 μm無菌濾菌器過濾上清液，將無細胞上清液真空冷凍干燥成粉末，制備成副干酪乳桿菌Z17粗提物備用。

用TSB液體培養基將副干酪乳桿菌粗提物溶解并定容至5 mL，使其終質量濃度分別為16.0、8.0、6.0、4.0、2.0、1.0、0.5、0.25、0 mg/mL，分別加入至100 mL 108CFU/mL的大腸桿菌O157:H7懸浮液中，置于搖床中37 ℃、180 r/min培養24 h，用分光光度法和平板涂布法確定副干酪乳桿菌Z17粗提物對菌株的最小抑菌質量濃度。

1.3.1.4 副干酪乳桿菌Z17-殼聚糖復配液制備和抑菌效果的確定

稱取一定量的殼聚糖粉末溶解于體積分數1%冰醋酸溶液中，加入副干酪乳桿菌Z17發酵上清液固體粉末使其達到最小抑菌濃度，得到副干酪乳桿菌Z17-殼聚糖復配液。取1.3.1.2節中草莓樣品隨機分為7 組，分別靜置于等體積無菌生理鹽水，質量分數1%殼聚糖溶液，殼聚糖質量分數分別為0、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%的副干酪乳桿菌-殼聚糖復配液中，對應記為CK、H、CH0、CH0.5、CH1、CH1.5、CH2組。

將上述處理后的草莓樣品每25 g裝入含有225 mL TSB液體培養基的無菌均質袋內，均質3 min。用TSB液體培養基稀釋均質后的樣品，以平板計數法測定活菌數，按下式計算減菌率。

1.3.2 副干酪乳桿菌Z17-殼聚糖復配抑菌機制分析

1.3.2.1 大腸桿菌O157:H7 DNA胞外釋放量的測定

參照寧亞維等[14]的方法，將大腸桿菌O157:H7培養至對數期，加入等體積副干酪乳桿菌Z17-殼聚糖復配液，分別以生理鹽水和體積分數0.1%的Triton X-100為陰性對照和陽性對照。37 ℃條件下培養3 h，每小時用超微量分光光度計檢測上清液中DNA質量濃度。

1.3.2.2 大腸桿菌O157:H7細胞膜完整性的測定

參照Hossain等[15]的方法，取1 mL培養至對數期菌懸液經過10 000×g離心30 s后，棄去上清液，用磷酸鹽緩沖液（0.2 mol/L、pH 7.4，下同）重懸菌體使其濃度達到1×106CFU/mL，加入等體積副干酪乳桿菌Z17-殼聚糖復配液，以生理鹽水處理作為對照，混勻靜置10 min后10 000 r/min離心15 min收集菌體，菌體用磷酸鹽緩沖液沖洗并重懸，用質量濃度為1 mg/mL碘化丙啶在4 ℃黑暗條件下染色，采用流式細胞儀檢測，激發波長為488 nm，在650 nm波長處對染色細胞進行計數并記錄熒光強度。

1.3.2.3 大腸桿菌O157:H7細胞膜成分分析

參照Wang Hongsu等[16]的方法，取1.3.2.2節中加入副干酪乳桿菌Z17-殼聚糖復配液的菌懸液并進行相同處理，以生理鹽水作對照，10 000 r/min離心15 min后收集菌體。用體積分數2.5%戊二醛溶液在4 ℃下固定菌體。以體積分數分別為50%、70%、80%、90%、100%的乙醇溶液依次逐級脫水，再用乙酸異戊酯置換2 次，冷凍干燥樣品。傅里葉變換紅外光譜掃描分析條件：波數4 000～400 cm-1，最高分辨率4 cm-1，掃描32 次。

1.3.2.4 大腸桿菌O157:H7細胞結構分析

參照Lü Xinran等[17]的方法，取1.3.2.2節中加入副干酪乳桿菌Z17-殼聚糖復配液的菌懸液并進行相同處理，以生理鹽水作對照，10 000 r/min離心15 min后收集菌體。采用785 nm激發光收集500～1 750 cm-1范圍內的表面增強拉曼光譜信號，激光功率約為30 mW，曝光時間為5 s。每個樣品測定3 次。取4 μL細菌樣品溶液進行表面增強拉曼光譜檢測。

1.3.2.5 大腸桿菌O157:H7細胞形態的觀察

取1.3.2.3節中乙酸異戊酯置換后冷凍干燥后的樣品粉末，進行噴金和掃描電子顯微鏡觀察，電壓1.5 kV、放大倍數10 000。

1.4 數據統計與分析

所有實驗重復3 次取平均值，采用SPSS Statistics 19軟件與Origin 2018軟件行統計分析和作圖。使用Duncan法進行顯著差異性比較，以P＜0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 副干酪乳桿菌Z17與殼聚糖復配對大腸桿菌O157:H7的減除效果

如圖1所示，副干酪乳桿菌粗提物質量濃度為6.0 mg/mL時即可完全抑制大腸桿菌O157:H7的生長，同時用平板涂布法也無活菌檢出，故確定副干酪乳桿菌Z17發酵上清液粗提物對大腸桿菌O157:H7的最小抑菌質量濃度為6.0 mg/mL。

圖1 副干酪乳桿菌Z17粗提物對大腸桿菌O157:H7最小抑菌質量濃度Fig. 1 Minimum inhibitory concentration of culture supernatant of L. paracei Z17 against E. coli O157:H7

如圖2所示，對照組鮮食草莓上大腸桿菌O157:H7菌落總數為4.7（lg（CFU/g）），0、0.5%、1%、1.5%、2%（質量分數，后同）殼聚糖和副干酪乳桿菌Z17復配處理組菌落總數分別為4.131、4.69、2.69、2.74、2.77（lg（CFU/g））。最小抑菌濃度副干酪乳桿菌Z17發酵上清液粗提物與1%殼聚糖復配時，減菌率已達到了99%，副干酪乳桿菌Z17（CH0）和殼聚糖（H）單獨處理組減菌率分別為73%和85%。以上結果表明，殼聚糖和副干酪乳桿菌Z17復配有協同抑菌作用，能有效提高減菌率。選擇1%殼聚糖與最小抑菌質量濃度副干酪乳桿菌復配進行后續抑菌機制的研究。

圖2 不同濃度副干酪乳桿菌Z17-殼聚糖復配對大腸桿菌O157:H7的減除效果Fig. 2 Bacteriostatic effect of mixture of different concentrations of chitosan solution with L. paracei Z17 on E. coli O157:H7

2.2 副干酪乳桿菌Z17與殼聚糖復配對大腸桿菌O157:H7 DNA胞外釋放的影響

DNA的釋放情況是判斷其細胞膜是否被破壞的依據[18]。由表1可以看出，副干酪乳桿菌Z17與殼聚糖溶液復配液處理組大腸桿菌O157:H7 DNA的胞外釋放量遠高于陰性對照組，在3 h時內DNA的釋放量不斷增加，在第3小時DNA釋放量達（381.00±3.53）ng/μL。因此推斷植物乳桿菌Z17與殼聚糖復合溶液是通過破壞細胞膜導致大腸桿菌O157:H7死亡。郭行[19]從鼠李糖乳桿菌中分離純化的新型細菌素也通過破壞大腸桿菌細胞膜的方式導致DNA胞外泄漏，在4 h內DNA泄漏量可達187.57 ng/μL，與之相比本實驗中副干酪乳桿菌Z17與殼聚糖溶液復配液對大腸桿菌O157:H7細胞膜的破壞作用更劇烈。

表1 副干酪乳桿菌Z17與殼聚糖復配對大腸桿菌O157:H7 DNA胞外釋放的影響Table 1 Effect of chitosan-L. paracei Z17 mixture on extracellular DNA release from E. coli O157:H7

2.3 副干酪乳桿菌Z17與殼聚糖復配對大腸桿菌O157:H7細胞膜完整性的影響

碘化丙啶是用于檢驗細胞膜完整性的熒光染色劑，只有在細菌細胞膜受到破壞或細胞已經死亡時，碘化丙啶才能夠進入到細胞內部與DNA或RNA嵌合，從而產生熒光，熒光強度可表示實驗中所收集的大腸桿菌O157:H7細胞中受損細胞所占百分比，即細胞膜破損率[20]。

由圖3A可知，經生理鹽水處理的對照組，大腸桿菌O157:H7細胞膜破損率為0.9%。由圖3B可知，副干酪乳桿菌Z17與殼聚糖溶液復配處理組大腸桿菌O157:H7細胞膜破損率為58.3%，處理組的大腸桿菌O157:H7細胞膜破損率遠高于對照組。楊昆等[21]研究發現大腸桿菌O157:H7菌懸液加入抗菌肽BCp12培養6 h后，細胞膜的破壞率可以達到25.1%。本實驗中副干酪乳桿菌Z17與殼聚糖溶液復配處理對大腸桿菌O157:H7細胞膜的破壞作用比其更強。

圖3 副干酪乳桿菌Z17-殼聚糖復配對大腸桿菌O157:H7細胞膜完整性的影響Fig. 3 Effect of L. paracei Z17- chitosan mixture on cell membrane integrity in E. coli O157:H7

由此可知，經副干酪乳桿菌Z17與殼聚糖復配溶液處理組后，菌體細胞膜受到損傷，通透性增強，導致細胞死亡。初步推測副干酪乳桿菌Z17發酵上清液粗提物中的酶類、蛋白或多肽類抗菌物質通過連接嵌入作用破壞了細菌細胞膜。

2.4 副干酪乳桿菌Z17與殼聚糖復配對大腸桿菌O157:H7細胞膜成分的影響

傅里葉變換紅外光譜技術可以分析微生物細胞質膜和細胞壁的組成和成分變化情況。大腸桿菌O157:H7細胞的紅外光譜圖呈現出革蘭氏陰性菌的特征振動峰，它由幾個重要的峰組成，一般可分為4個部分用以區分不同的微生物細胞成分[22-23]：1）指紋信息區：900～500 cm-1；2）細胞壁多糖信息區：1 200～900 cm-1；3）蛋白和多肽酰胺信息區：1 800～1 500 cm-1；4）脂肪酸信息區：3 000～2 800 cm-1。

如圖4所示，1 450～1 230 cm-1附近的吸收峰增強，此吸收峰歸因于肽聚糖中氨基酸和脂肪酸鏈羧酸酯基團（—COO—）中C＝O鍵的對稱拉伸振動；1 650 cm-1和1 450 cm-1周圍的特征峰對應大腸桿菌O157:H7細胞膜、細胞質、鞭毛、菌毛和核糖體中酰胺I帶和酰胺II帶；其中，1 650 cm-1處吸收峰歸因于C＝O的振動，1 450 cm-1處吸收峰歸因于肽基基團N—H鍵和C—N鍵的彎曲和拉伸；圖4中副干酪乳桿菌Z17與殼聚糖復配處理組1 650 cm-1和1 450 cm-1附近峰強度相對于對照組明顯下降，表明副干酪乳桿菌Z17-殼聚糖復配處理對大腸桿菌O157:H7細胞膜或壁上的蛋白質造成破壞；2 930 cm-1附近的吸收峰歸因于脂肪酸和脂類中的甲基（—CH3）和亞甲基（—CH2）官能團的C—H對稱拉伸譜帶拉伸振動；1 080 cm-1附近吸收峰主要對應糖苷鏈多糖中的醚和許多細胞的構成成分肽聚糖，此外還對應磷脂、核酸、脂肪糖中的含磷基團，此處峰強度的降低主要是由于磷脂中官能團P—O以及PO2的不對稱拉伸振動；副干酪乳桿菌Z17-殼聚糖復配液處理組在以上5個區間的吸收峰強度明顯高于對照組，由此可知細胞膜和細胞壁中蛋白質、肽聚糖成分被破壞，使大腸桿菌O157:H7失去活性。傅里葉變換紅外光譜分析結果進一步證明了副干酪乳桿菌Z17-殼聚糖復配液對大腸桿菌O157:H7第一作用靶點是細胞膜，可能是副干酪乳桿菌Z17發酵液和殼聚糖中的基團與細菌細胞膜脂質基團相互作用，其大量聚集使膜局部位移變薄，最后形成孔洞，大分子物質進入細胞，使細菌內容物泄漏，導致細胞死亡[24]。

圖4 副干酪乳桿菌Z17-殼聚糖復配對大腸桿菌O157:H7細胞膜成分的影響Fig. 4 Effect of L. paracei Z17-chitosan mixture on cell membrane composition of E. coli O157:H7

2.5 副干酪乳桿菌Z17與殼聚糖復配對大腸桿菌O157:H7細胞結構的影響

拉曼光譜是一種靈敏的成像工具，大腸桿菌O157:H7細胞壁的結構差異可通過拉曼光譜表征。如圖5所示，大腸桿菌O157:H7在827～840、845～880、1 095～1 100、1 494 cm-1和1 590 cm-1處有明顯的特征峰，對照組峰強度明顯高于處理組。827～840 cm-1處特征峰能夠表征酪氨酸含量；845～880 cm-1和1 590 cm-1特征峰能夠表征細胞壁中肽聚糖含量[25-26]；1 494 cm-1處特征峰歸因于C＝C、C—H伸縮振動；拉曼光譜分析再次證實副干酪乳桿菌Z17-殼聚糖復配能夠破壞大腸桿菌O157:H7細胞壁中肽聚糖、糖苷環、多糖結構。

圖5 副干酪乳桿菌Z17-殼聚糖復配處理大腸桿菌O157:H7拉曼光譜圖Fig. 5 Raman spectra of E. coli O157:H7 treated with L. paracei Z17-chitosan mixture

2.6 副干酪乳桿菌Z17與殼聚糖復配對大腸桿菌O157:H7細胞形態的影響

由圖6A可知，對照組樣品飽滿完整、形態均勻。由圖6B可知，經副干酪乳桿菌Z17-殼聚糖復配液處理后，菌體細胞表面塌陷、出現孔洞、局部破裂，菌體細胞壁失去剛性，發生質壁分離、細胞膨脹，最后裂解死亡。由此可知，副干酪乳桿菌Z17-殼聚糖復配液處理可破壞大腸桿菌O157:H7的細胞完整性。

圖6 副干酪乳桿菌Z17-殼聚糖復配對大腸桿菌O157:H7細胞表面形態的影響Fig. 6 Effect of L. paracei Z17-chitosan mixture on cell surface morphology of E. coli O157:H7

3 討 論

本實驗研究了副干酪乳桿菌Z17發酵上清液粗提物對大腸桿菌O157:H7的抑菌作用，確定其最小抑菌濃度為6.0 mg/mL，其與殼聚糖溶液復配處理對草莓中的大腸桿菌O157:H7有協同抑菌作用，且抑菌效果強于單獨使用。從大腸桿菌O157:H7細胞形態與結構、細胞膜的完整性、細胞壁膜成分3個方面分別探討了副干酪乳桿菌Z17發酵上清液粗提物與殼聚糖復配對大腸桿菌O157:H7作用機制。結果表明，其主要作用點在細胞膜上，副干酪乳桿菌Z17發酵上清液粗提物通過破壞大腸桿菌O157:H7細胞壁中肽聚糖、糖苷環、多糖結構成分，引起菌體形態結構的變化，從而導致DNA胞外泄漏，細胞內核酸和蛋白質的流失，細胞正常生理代謝活動被擾亂，這與Smaoui[27]和Kamal[28]等的研究結果相似。Hoda等[29]研究發現，殼聚糖能形成薄膜吸附在細胞膜上，影響營養物質進入，從而達到抑菌的作用。李小芳[30]研究發現，殼聚糖通過滲透作用進入細菌細胞內，與細胞中蛋白質和核酸物質結合，影響DNA的復制和蛋白質的合成，從而阻礙mRNA的合成，抑制細菌的繁殖，導致細菌死亡。副干酪乳桿菌Z17發酵上清液粗提物與殼聚糖復配有協同抑菌效果，推測可能是副干酪乳桿菌Z17發酵上清液破壞細胞膜后，殼聚糖大分子物質部分黏附在細胞壁膜表面，部分隨之進入細胞中，加快了細胞中內容物的泄漏，同時菌體死亡速度也隨之提升。