基于量子化學(xué)計(jì)算分析裸燕麥源兩種活性肽抗氧化機(jī)理

付 媛，張美莉，張 宇，高韶輝

（1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)理學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018；2.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018）

抗氧化劑可以清除自由基，并在維持細(xì)胞功能方面發(fā)揮關(guān)鍵作用[1]。其中，抗氧化肽可通過(guò)抑制脂質(zhì)氧化、螯合金屬離子等多種方式來(lái)提高機(jī)體的抗氧化、抗衰老、抵抗疾病能力，是備受青睞的一類抗氧化劑[2-3]。最近的研究表明，抗氧化肽的抗氧化活性與肽段大小、組成以及肽序列都有很大關(guān)系[4-5]。蘆鑫[6]研究發(fā)現(xiàn)，芝麻抗氧化肽中天冬氨酸、苯丙氨酸、谷氨酸出現(xiàn)的幾率大；Luo Xiaoyu等[7]分離出氨基酸序列分別為GEVPW、YMENF、AFYRW的3種抗氧化肽，均表現(xiàn)出較好的抗氧化效果；付媛等[8]從裸燕麥中分離出的活性肽（苯丙氨酸-亮氨酸-色氨酸-甘氨酸-蘇氨酸-亮氨酸）表現(xiàn)出較好的自由基清除性能，經(jīng)結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，該活性肽鏈中亮氨酸也出現(xiàn)在末端，并且肽鏈中也出現(xiàn)色氨酸，推測(cè)其可能起到促進(jìn)抗氧化作用。然而，目前活性肽在體內(nèi)的抗氧化機(jī)理研究仍面臨很大的挑戰(zhàn)，一些研究利用各種動(dòng)植物蛋白水解產(chǎn)物中分離得到的多肽片段，通過(guò)氨基酸測(cè)序確定其一級(jí)結(jié)構(gòu)，試圖分析其構(gòu)效關(guān)系，但是由于抗氧化肽氨基酸組成和空間結(jié)構(gòu)復(fù)雜，實(shí)驗(yàn)手段很難準(zhǔn)確獲得多肽抗氧化活性的作用位點(diǎn)和電子轉(zhuǎn)移路徑[9-10]。在這種情況下，量子化學(xué)模擬方法體現(xiàn)出更大的優(yōu)勢(shì)。文超婷[11]采用量子化學(xué)對(duì)西瓜籽抗氧化肽P1-P5的化學(xué)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分子模擬，計(jì)算P1-P5的前線分子軌道分布和能量、原子凈電荷分布和鍵長(zhǎng)，并推測(cè)出P1-P5的活性位點(diǎn)；聶挺等[12]采用半經(jīng)驗(yàn)AM1和密度泛函理論（density functional theory，DFT）研究了天然抗氧化肽的活性位點(diǎn)，并提出了抗氧化肽自由基清除活性機(jī)理。

本課題組前期從燕麥中分離出兩種多肽（燕麥活性肽I及II），并確定了活性肽I的氨基酸序列結(jié)構(gòu)，前期研究證明，裸燕麥源多肽確實(shí)可通過(guò)改變代謝通路來(lái)實(shí)現(xiàn)抗氧化的作用[8]，但是對(duì)于多肽氨基酸序列結(jié)構(gòu)與抗氧化性之間的構(gòu)效關(guān)系并沒(méi)有闡明。本實(shí)驗(yàn)對(duì)活性肽II的氨基酸序列結(jié)構(gòu)進(jìn)行確定，并利用動(dòng)物實(shí)驗(yàn)測(cè)定了兩種多肽以及對(duì)照物分子VC的抗氧化活性，進(jìn)一步通過(guò)量子化學(xué)計(jì)算獲得兩種裸燕麥源多肽的電子結(jié)構(gòu)和分子構(gòu)型，推測(cè)其清除自由基的活性位點(diǎn)，以期揭示裸燕麥源多肽清除自由基的機(jī)理，為裸燕麥抗氧化產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)和生產(chǎn)提供參考。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、材料與試劑

健康昆明種小白鼠，雄性，體質(zhì)量（20±2）g，購(gòu)自內(nèi)蒙古大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部。生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（蒙）2016-0001，使用許可證號(hào)：SYXK（蒙）2010-0006。

裸燕麥產(chǎn)自內(nèi)蒙古自治區(qū)武川縣，曬干、粉碎后過(guò)60 目篩備用。

D-半乳糖 美國(guó)Sigma公司；堿性蛋白酶（200 000 U/g）英國(guó)BDH公司；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）、過(guò)氧化氫酶（catalase，CAT）、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）、單胺氧化酶-B（monoamine oxidase-B，MAO-B）試劑盒、總蛋白定量測(cè)試盒 南京建成生物工程研究所。

1.2 儀器與設(shè)備

SCIENTZ-12N冷凍干燥機(jī) 寧波新芝生物科技股份有限公司；Epoch2多功能微孔板檢測(cè)儀 美國(guó)BioTek公司；H2500R-2高速冷凍離心機(jī) 湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司；Triple TOF 5600+質(zhì)譜（mass spectrometry，MS）儀 美國(guó)SCIEX公司；1290 Infinity高效液相色譜（high performance liquid chromatography）系統(tǒng) 美國(guó)Agilent公司。

1.3 方法

1.3.1 燕麥源活性肽的制備

按本課題組前期研究[8-10]方法，以裸燕麥為原料制備兩種活性肽（活性肽I及II），并采用HPLC-MS/MS鑒定活性肽II氨基酸序列。

1.3.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及處理

50 只昆明種健康小鼠隨機(jī)分為5 組：正常對(duì)照組、衰老模型組、活性肽I治療組、活性肽II治療組及VC陽(yáng)性對(duì)照組。除正常對(duì)照組外，其他各組按120 mg/（kgmb·d）劑量頸背部皮下注射D-半乳糖，正常對(duì)照組注射等量生理鹽水；活性肽I治療組、活性肽II治療組分別灌胃1 000 mg/（kgmb·d）活性肽I或活性肽II，VC陽(yáng)性對(duì)照組灌胃100 mg/（kgmb·d）VC。每日定時(shí)灌胃、注射一次，連續(xù)6 周[13-15]。

1.3.3 生化指標(biāo)的測(cè)定

參考本課題組前期研究[10]方法，利用相應(yīng)試劑盒分別測(cè)定小鼠血清中SOD、GSH-Px、CAT活力以及腦組織中GSH-Px、MAO活力和MDA含量。

1.3.4 量子化學(xué)計(jì)算

本實(shí)驗(yàn)所有計(jì)算均基于DFT平面波超軟贗勢(shì)法，運(yùn)用Materials Studio 17.2軟件中的Dmol3模塊進(jìn)行計(jì)算與分析[16]。計(jì)算時(shí)采用廣義梯度近似（generalized gradient approximation，GGA）中的PBE（Perdew-Burke-Ernzerhof）泛函。使用Grimme的DFT-D經(jīng)驗(yàn)修正方案，研究范德華相互作用。優(yōu)化收斂公差集設(shè)置為1.0×10-5Ha（能量）、2.0×10-3Ha/?（梯度）、5.0×10-3?（位移）和1.0×10-6（自洽場(chǎng)（self consistent field，SCF）精度）。迭代子空間的直接反轉(zhuǎn)（direct inversion in the iterative space，DIIS）尺寸設(shè)置為6，自旋極化設(shè)置為不受限制。通過(guò)測(cè)定的氨基酸序列連接氨基酸分子建立活性肽I及活性肽II的初始結(jié)構(gòu)，對(duì)照物VC分子的初始結(jié)構(gòu)取自Materials Studio 17.2軟件數(shù)據(jù)庫(kù)。依據(jù)多肽分子優(yōu)化后的構(gòu)型使用公式（1）、（2）計(jì)算評(píng)估自由基進(jìn)攻能力的f0（r）指數(shù)[17]。

式中：E表示基態(tài)電子能；μ表示化學(xué)勢(shì)；N表示物質(zhì)所含電子數(shù)；v表示外勢(shì)；ρ（r）表示電子密度；η表示硬度；f（r）表示Fukui函數(shù)。

式中：ρHOMO（r）和ρLUMO（r）分別表示分子受到親電攻擊、親核攻擊時(shí)，分子中原子的最高占用分子軌道（highest occupied molecular orbital，HOMO）和最低未占用分子軌道（lowest unoccupied molecular orbital，LUMO）上的電荷密度；f0（r）為自由基攻擊指數(shù)，其反映自由基進(jìn)攻的能力；f+（r）為親核攻擊指數(shù)；f-（r）為親電攻擊指數(shù)。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

采用SPSS 20.0軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行t檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，測(cè)定結(jié)果數(shù)據(jù)均用表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 裸燕麥源活性肽的結(jié)構(gòu)

采用HPLC-MS/MS技術(shù)鑒定活性肽II結(jié)構(gòu)，結(jié)果如圖1所示，活性肽II的氨基酸序列為纈氨酸-苯丙氨酸-天冬酰胺-天冬氨酸-精氨酸-亮氨酸（Val-Phe-Asn-Asp-Arg-Leu，VFNDRL）；結(jié)合本課題組前期工作[8]，已知活性肽I的氨基酸序列為苯丙氨酸-亮氨酸-色氨酸-甘氨酸-蘇氨酸-亮氨酸（Phe-Leu-Trp-Gly-Thr-Leu，F(xiàn)LWGTL），顯然二者含有不同的氨基酸排列次序，由此可推測(cè)其抗氧化能力應(yīng)該有所不同。

圖1 活性肽Ⅱ的二級(jí)質(zhì)譜圖Fig. 1 Secondary mass spectrum of peptide Ⅱ

為分析多肽氨基酸序列結(jié)構(gòu)與抗氧化性之間的構(gòu)效關(guān)系，對(duì)活性肽I活性肽II的電子結(jié)構(gòu)進(jìn)行計(jì)算。首先根據(jù)活性肽I及活性肽II的氨基酸序列，構(gòu)建活性肽的結(jié)構(gòu)模型圖，并使用Dmol3模塊對(duì)構(gòu)型優(yōu)化，得到兩個(gè)活性肽的能量最穩(wěn)定結(jié)構(gòu)，如圖2A和2B所示。同時(shí)計(jì)算對(duì)照物VC的構(gòu)型，其初始構(gòu)型取自Materials Studio模型庫(kù)，得到的優(yōu)化結(jié)構(gòu)如圖2C所示。

圖2 兩種活性肽及VC的優(yōu)化結(jié)構(gòu)示意圖Fig. 2 Optimal geometric structures of peptides I and II and VC

2.2 兩種活性肽在衰老小鼠血清及腦組織中抗氧化活性的比較

圖3 兩種活性肽在衰老小鼠血清及腦組織中抗氧化活性（，n＝10）Fig. 3 Antioxidant activity of two bioactive peptides in serum and brain tissues of aging mice (, n = 10)

2.3 兩種活性肽的結(jié)構(gòu)特征及其抗氧化機(jī)理分析結(jié)果

采用Materials Studio 17.2軟件中的Dmol3模塊，利用GGA-PBE泛函，并通過(guò)Grimme的DFT-D經(jīng)驗(yàn)修正方案分別計(jì)算活性肽I、活性肽II和VC分子的Fukui指數(shù)f0（r）、自由基反應(yīng)活性位點(diǎn)、活性位點(diǎn)處電荷、鍵長(zhǎng)、HOMO能級(jí)（EHOMO）和LUMO能級(jí)（ELUMO）等電子結(jié)構(gòu)特征指標(biāo)。

2.3.1 兩種活性肽及VC的Fukui指數(shù)f0（r）、自由基反應(yīng)活性位點(diǎn)

Fukui指數(shù)f0（r）可反映局部反應(yīng)活性，f0（r）越大，表明是自由基反應(yīng)活性位點(diǎn)的可能性越高[23]，通過(guò)分析計(jì)算的結(jié)構(gòu)，f0（r）最大的5個(gè)原子如表1所示，這些原子位點(diǎn)更容易發(fā)生自由基清除反應(yīng)，這些反應(yīng)位點(diǎn)在分子中的位置如圖4所示（紅色圓圈處）。

表1 兩種活性肽及VC中高活性原子的Fukui指數(shù)Table 1 Fukui indices of the active atoms in two bioactive peptides and VC

圖4 兩種活性肽及VC的Fukui指數(shù)f0（r）活性原子示意圖Fig. 4 Schematic diagram of the active atoms with higher f0(r) of bioactive peptides I and II and VC

結(jié)合表1和圖4可知，活性肽I的活性位點(diǎn)在亮氨酸的羧基、苯丙氨酸的胺基以及色氨酸吲哚環(huán)的雙鍵上；活性肽II的活性位點(diǎn)在亮氨酸的羧基以及精氨酸胍基的兩個(gè)胺基上。而VC的活性位點(diǎn)在五元環(huán)上的酯基以及另外兩個(gè)羥基上。

2.3.2 兩種多肽活性位點(diǎn)處電荷及鍵長(zhǎng)

由表2可知，活性肽I中鍵長(zhǎng)較長(zhǎng)的分別是亮氨酸中的羧基、苯丙氨酸中的胺基、色氨酸吲哚環(huán)中的雙鍵；活性肽II中鍵長(zhǎng)較長(zhǎng)的分別是亮氨酸中的羧基和精氨酸胍基上的兩個(gè)胺基。化學(xué)鍵鍵長(zhǎng)越長(zhǎng)越容易斷裂，說(shuō)明上述位點(diǎn)是自由基清除反應(yīng)的活性位點(diǎn)。

表2 兩種活性肽及VC活性點(diǎn)位處電荷及鍵長(zhǎng)Table 2 Atomic charges and bond lengths at the active sites of bioactive peptides I and II and VC

綜合圖4、表1及表2可推測(cè)得出：1）活性肽I、II中C端的亮氨酸殘基可釋放活潑氫與自由基發(fā)生反應(yīng)，終止自由基破壞生物大分子，起到抗氧化的作用，而亮氨酸殘基轉(zhuǎn)化為羧基自由基，羧基自由基進(jìn)一步脫除CO2。這個(gè)反應(yīng)過(guò)程中，因?yàn)橛蠧O2的生成，使得體系熵增大，并且亮氨酸的支鏈?zhǔn)箍臻g位阻增大，均有利于反應(yīng)進(jìn)行。有研究顯示，亮氨酸羧基可脫除CO2，并伴隨著羧基上H的遷移[24-25]，另外，一些研究證明支鏈氨基酸，尤其是亮氨酸，可有效減緩氧化應(yīng)激，降低脂質(zhì)過(guò)氧化水平，保持機(jī)體抗氧化系統(tǒng)的平衡[26]，而且細(xì)胞中自由基的生成位點(diǎn)在線粒體中，如果抗氧化肽的N端含有疏水性氨基酸殘基，則會(huì)增大其在脂質(zhì)-水界面的溶解性，使其易于進(jìn)入線粒體中，發(fā)揮自由基清除作用[27]。活性肽I中N端為苯丙氨酸殘基，活性肽II中N端為纈氨酸殘基，二者均屬于疏水性氨基酸，故兩種活性肽在脂質(zhì)-水界面的溶解性都會(huì)增大，有利于清除自由基。2）活性肽I中苯丙氨酸的N—H鍵明顯偏長(zhǎng)，說(shuō)明殘基上的胺基容易釋放活潑氫，其N原子上的p電子與相鄰C—H上的σ電子產(chǎn)生超共軛現(xiàn)象，使結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，釋放出活潑氫與自由基發(fā)生反應(yīng)，起到抗氧化作用。此外，色氨酸殘基吲哚環(huán)上容易發(fā)生離域π鍵共軛，可以使電荷的流動(dòng)性增強(qiáng)，從而提供活潑氫來(lái)清除自由基[12]。3）活性肽II中精氨酸殘基N原子帶電較多，是堿性氨基酸，其與金屬離子可發(fā)生螯合反應(yīng)，從而阻止Cu2+、Fe2+對(duì)生物大分子的氧化損傷[28-30]；另外，精氨酸殘基的胍基釋放出活潑氫后，胍基上存在超共軛及共軛現(xiàn)象，使得結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，起到清除自由基的作用。

2.3.3 HOMO和LUMO結(jié)構(gòu)及其能級(jí)

前線軌道（HOMO和LUMO）是量子化學(xué)中一個(gè)重要參數(shù)[31]。EHOMO越大，表示越可能提供電子；ELUMO越小，表明越容易接受電子；二者軌道能級(jí)差ΔE＝ELUMOEHOMO是非常重要的指標(biāo)，ΔE越小，表明活性越強(qiáng)，越易發(fā)生反應(yīng)[32-33]。由圖5可知，活性肽I的HOMO主要位于色氨酸的吲哚環(huán)上，其LUMO主要位于亮氨酸的羧基，說(shuō)明電子轉(zhuǎn)移是從色氨酸的吲哚環(huán)轉(zhuǎn)移到精氨酸的羧基，和前述的電子流動(dòng)方向和活性位點(diǎn)相符，而活性肽II的電子轉(zhuǎn)移主要發(fā)生在末端亮氨酸的羧基及相鄰的精氨酸胍基上，轉(zhuǎn)移路徑較短，離域范圍小；同樣，對(duì)照物VC的電子轉(zhuǎn)移也發(fā)生在其自身的五元環(huán)內(nèi)，因此，活性肽II和VC的抗氧化能力明顯比活性肽I弱。由表3可知，活性肽I的ΔE為3.400 eV，活性肽II的ΔE為4.069 eV，VC的ΔE為3.763 eV，活性肽I的EHOMO最大，且相應(yīng)的ΔE最小，因此其自由基清除能力最強(qiáng)，抗氧化性最強(qiáng)，優(yōu)于VC和活性肽II；活性肽II的ΔE最高，其抗氧化性比VC略遜一籌，這與二者在衰老小鼠實(shí)驗(yàn)中的結(jié)果相符。

圖5 兩種活性肽及VC的HOMO與LUMO結(jié)構(gòu)圖Fig. 5 Highest occupied molecular orbital and lowest unoccupied molecular orbital of bioactive peptides I and II and VC

表3 兩種活性肽及VC的前線分子軌道能及其能級(jí)差Table 3 Frontier orbital energies and energy differences of bioactive peptides I and II and VC

3 結(jié) 論

由衰老模型小鼠體內(nèi)指標(biāo)的測(cè)定結(jié)果可知，灌胃兩種裸燕麥源活性肽后，各治療組均顯示出良好的抗氧化效果，其中活性肽I的治療效果更好，表明活性肽I的抗氧化性更強(qiáng)。

通過(guò)量子化學(xué)理論計(jì)算，得到Fukui指數(shù)、鍵長(zhǎng)、前線分子軌道能級(jí)及其能級(jí)差，結(jié)果表明，活性肽I的自由基反應(yīng)活性位點(diǎn)在亮氨酸的羧基、苯丙氨酸的胺基以及色氨酸的吲哚環(huán)的雙鍵上；活性肽II的自由基反應(yīng)活性位點(diǎn)在亮氨酸的羧基以及精氨酸胍基的兩個(gè)胺基上；活性肽I的電子離域范圍大且ELUMO和EHOMO的能級(jí)差ΔE最小，因此其抗氧化活性最強(qiáng)，優(yōu)于活性肽II和對(duì)照分子VC。