植物乳桿菌KSFY04通過調節核因子κB信號通路干預小鼠血栓形成的效果

趙 欣，劉 佳，易若琨,2，騫 宇，楊貞耐

（1.重慶第二師范學院 重慶市功能性食品協同創新中心，重慶 400067；2.北京工商大學 北京食品營養與人類健康高精尖創新中心，北京 100048）

我國新疆地區幅員遼闊，畜牧業發達，擁有大量優質牧場。同時，新疆地區少數民族眾多，各少數民族都有自己較為獨特的飲食習慣，但是大部分均有食用乳制品的習慣。牧民家庭制作的自然發酵酸乳是最常食用的乳制品之一[1]。因為新疆少數民族牧民有食用自然發酵酸乳的習慣，這些自然發酵乳制品中的微生物經過上千年的自然馴化，已經適應了新疆的生存環境并且具有不同的發酵特性及益生功能，極具開發利用價值[2-3]。

經濟發展促進了我國國民生活水平的提高，也使居民飲食結構發生變化，大量不健康食品的攝入易造成心腦血管疾病等多種慢性疾病的發病率增加，嚴重威脅中老年人的身體健康[4]。心腦血管疾病具有突發性特點，發病突然、及時救治困難，嚴重威脅患者的生命[5]。內源性或外源性損傷引起的血液流動異常是引發心腦血管疾病的重要因素，進而加劇機體發生炎癥反應[6]。而炎癥也是誘發血栓形成的一個重要因素，同時血栓形成又會進一步加劇炎癥[7]。血栓會對機體器官造成一定損傷，隨著后續炎癥和血栓程度的加劇，機體器官損傷程度隨之加劇[8]。嚴重的血栓會導致復雜炎癥，使肝臟、腎臟等多器官發生功能障礙和組織壞死[9]。炎癥狀態下，大量促炎因子使血液處于高凝狀態，引起血栓形成；同時血栓又會加劇機體炎癥的發生和發展，炎癥和血栓的交互作用形成復雜網絡，造成心腦血管等器官和組織的嚴重損傷[10]。

角叉菜膠能夠引發實驗動物體內的炎癥反應，大量炎癥因子會快速進入血液循環，從而引發血管內皮細胞損傷或死亡，并最終導致血栓的形成。鼠尾血管是單循環血管，發生血栓后無法通過側支循環進行血液循環，鼠尾組織將逐漸缺血，造成組織壞死[11]。因此，本研究采用角叉菜膠建立小鼠尾血栓，觀察植物乳桿菌KSFY04（Lactobacillus plantarumKSFY04，LP-KSFY04）對血栓形成的減輕作用。LP-KSFY04是本團隊從新疆喀什地區維吾爾族家庭自產自然發酵酸乳中分離鑒定出的一株乳酸菌，本實驗通過動物模型研究LP-KSFY04通過NF-κB通路調節炎癥減輕血栓形成的作用，以抗血栓藥物雙嘧達莫作為陽性對照，比較評價LP-KSFY04對心腦血管疾病和組織器官損傷的潛在功能性作用，以期為LP-KSFY04作為益生菌的應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

LP-KSFY04分離鑒定于新疆喀什地區維吾爾族家庭自產自然發酵酸牛乳，菌種保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，專利保藏號為CGMCC No. 15657。

SPF級6 周齡雄性昆明小鼠，體質量（23±2）g，購于重慶醫科大學實驗動物中心，生產許可證號：SCXK（渝）2018-0003。本研究中動物實驗經重慶市功能性食品協同創新中動物實驗倫理委員會批準，批準號：2021050005B。

雙嘧達莫 亞寶藥業集團股份有限公司；腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor α，TNF-α）、白細胞介素（interleukin，IL）-6和IL-1β檢測試劑盒 上海酶聯生物科技有限公司；TRIzol試劑 美國Invitrogen公司；SYBR Green PCR Master Mix、定量聚合酶鏈式反應（quantitative polymerase chain reaction，qPCR）引物美國Thermo Fisher Scientific公司；其余試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

PUN-2048A半自動血凝儀 北京普朗有限公司；BX43顯微鏡 日本奧林巴斯公司；Varioskan LUX多功能酶標儀、StoponePlus定量PCR儀 美國Thermo Fisher Scientific公司。

1.3 方法

1.3.1 動物實驗

小鼠飼養在溫度（20±1）℃、相對濕度30%～40%環境下，自由采食和飲水，適應性喂養7 d。50 只昆明小鼠隨機分為5 組，每組10 只，分別為正常組、模型組、藥物陽性對照組、LP-KSFY04低劑量處理（LP-KSFY04-L）組和LP-KSFY04高劑量處理（LP-KSFY04-H）組。正常組小鼠按0.01 mL/（gmb·d）腹腔注射生理鹽水，其余各組小鼠按照0.01 mL/（gmb·d）腹腔注射質量分數0.2%的角叉菜膠溶液[12]；同時，藥物陽性對照組小鼠按20 mg/（kgmb·d）灌胃雙嘧達莫溶液，LP-KSFY04-L組和LP-KSFY04-H組小鼠按108CFU/（kgmb·d）和 109CFU/（kgmb·d）的劑量灌胃LP-KSFY04菌懸液，持續10 d。灌胃結束后小鼠斷頸處死，記錄各組小鼠尾部黑尾（血栓）長度，同時心臟取血和取內臟待測。

1.3.2 凝血指標檢測

將收集到的小鼠心臟血液采用半自動血凝儀測定活化部分凝血活酶時間（activated partial thromboplastin time，APTT）、凝血酶時間（thrombin time，TT）、纖維蛋白原（fibrinogen，FIB）水平和凝血酶原時間（prothrombin time，PT）。

1.3.3 血清和組織炎癥細胞因子水平測定

將收集到的小鼠心臟血液在1 500 r/min、4 ℃離心10 min，取上層血清待用。同時稱取0.1 g腎臟和肝臟組織分別加入0.9 mL生理鹽水，4 000 r/min、4 ℃均質10 min，離心后收集上清液待用。按檢測試劑盒說明書方法測定血清和組織中TNF-α、IL-6和IL-1β水平。

1.3.4 組織病理學變化觀察

解剖小鼠后，將小鼠腎臟、肝臟和尾部組織用10%福爾馬林溶液固定。脫水48 h后將組織樣品包埋在石蠟中，切片，并用蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色，用光學顯微鏡觀察組織病理學變化[13]。

1.3.5 小鼠尾靜脈組織炎癥及血栓形成相關細胞因子mRNA表達水平檢測

稱取0.1 g小鼠尾靜脈組織，加入0.9 mL生理鹽水，勻漿，再加入1.0 mL RNAzol提取小鼠尾靜脈組織RNA，使用超微分光光度法在260 nm和280 nm波長處測定吸光度，計算RNA純度和濃度，調整RNA質量濃度為1 μg/μL。然后通過反轉錄生成cDNA后，配制含1 μL cDNA的反應體系，其余試劑包括SYBR Green PCR Master Mix 10 μL、無菌蒸餾水7 μL和上、下游引物各1 μL。qPCR擴增反應條件：95 ℃、60 s，95 ℃、15 s，40個循環；55 ℃、30 s，72 ℃、35 s，95 ℃、30 s，55 ℃、35 s。選擇GAPDH作為內參，按2-ΔΔCt法計算NF-κB p65、IL-6、TNF-α、細胞間黏附分子1（intercellular cell adhesion molecule 1，ICAM-1）、血管細胞黏附分子1（vascular cell adhesion molecule 1，VCAM-1）和選擇素E（E-selectin）基因相對表達量[14]。引物序列如表1所示。

表1 本實驗中使用的引物序列Table 1 Primer sequences used in this experiment

1.3.6 小鼠糞便中微生物mRNA表達的測定

稱取1.0 g小鼠糞便，根據1.3.5節方法測定小鼠糞便中厚壁菌門、擬桿菌門、乳酸桿菌屬和雙歧桿菌屬細菌的mRNA表達水平，將小鼠糞便中總菌的mRNA表達水平設定為1，分析小鼠糞便中以上幾類微生物的豐度[15]。

1.4 數據統計與分析

所有實驗進行3 次平行測定，結果以平均值±標準差表示。同時采用單因素方差分析進行差異顯著性分析，P＜0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 LP-KSFY04對血栓小鼠黑尾長度的影響

如圖1A所示，除正常組，腹腔注射角叉菜膠后各組小鼠尾尖處出現黑尾，即出現尾血栓。如圖1B所示，模型組小鼠黑尾長度最長，為（8.43±0.52）cm，顯著長于其余各組（P＜0.05）。LP-KSFY04-H組和雙嘧達莫組小鼠黑尾長度分別為（3.02±0.44）cm和（2.35±0.47）cm，二者無顯著差異（P＞0.05），均顯著短于較LP-KSFY04-L組（（5.89±0.58）cm）和模型組（P＜0.05）。

圖1 LP-KSFY04對血栓小鼠黑尾長度的影響Fig. 1 Effect of LP-KSFY04 on the length of black tail in thrombus mice

2.2 LP-KSFY04對血栓小鼠凝血4 項指標的影響

如圖2所示，與正常組相比，模型組血栓小鼠的APTT顯著縮短，TT、PT和FIB質量濃度分別顯著延長和升高（P＜0.05）；LP-KSFY04-H組APTT（（129.6±5.5）s）顯著長于LP-KSFY04-L組和模型組，但顯著短于正常組（P＜0.05）；LP-KSFY04-H組TT（（85.9±5.0）s）、FIB質量濃度（（65.7±4.4）g/L）和PT（（11.2±1.0）s）分別顯著短于和低于LP-KSFY04-L組（P＜0.05）和模型組，但顯著高于正常組（P＜0.05）。LP-KSFY04-H組APTT、TT、FIB質量濃度和PT均與雙嘧達莫組接近，且無顯著差異（P＞0.05）。

圖2 LP-KSFY04對血栓小鼠凝血4 項指標的影響Fig. 2 Effect of LP-KSFY04 on four blood coagulation indexes in mice with thrombosis

2.3 LP-KSFY04對血栓小鼠炎癥細胞因子水平的影響

如圖3～5所示，與正常組相比，模型組小鼠血清、腎組織和肝組織的TNF-α、IL-6和IL-1β水平均顯著升高（P＜0.05）；與模型組相比，雙嘧達莫、LP-KSFY04-H和LP-KSFY04-L組小鼠血清、腎組織和肝組織的TNF-α、IL-6和IL-1β水平均顯著降低（P＜0.05）。其中LP-KSFY04-H組TNF-α、IL-6和IL-1β水平與藥物雙嘧達莫組之間無顯著差異（P＞0.05）。

圖3 LP-KSFY04對血栓小鼠血清TNF-α（A）、IL-6（B）和IL-1β水平（C）的影響Fig. 3 Effect of LP-KSFY04 on serum levels of TNF-α (A), IL-6 (B)and IL-1β (C) in mice with thrombosis

圖4 LP-KSFY04對血栓小鼠腎組織TNF-α（A）、IL-6（B）和IL-1β水平（C）的影響Fig. 4 Effect of LP-KSFY04 on the levels of TNF-α (A), IL-6 (B) and IL-1β (C) in renal tissue of mice with thrombosis

圖5 LP-KSFY04對血栓小鼠肝組織TNF-α（A）、IL-6（B）和IL-1β水平（C）的影響Fig. 5 Effect of LP-KSFY04 on the levels of TNF-α (A), IL-6 (B) and IL-1β (C) in liver tissue of mice with thrombosis

圖6 小鼠尾部（A）、腎臟（B）和肝臟（C）組織的HE染色切片Fig. 6 HE stained sections of tail (A), kidney (B) and liver (C) tissues of mice

2.4 LP-KSFY04對血栓小鼠尾組織、腎臟組織和肝臟組織病理學變化的影響

如圖6A所示，正常組小鼠尾靜脈血管形態完整且圓潤、血管壁形態光滑，模型組小鼠尾靜脈血管壁中有明顯的炎性滲出且出現白細胞浸潤，同時血管周圍有出血情況，血管內有血栓形成。LP-KSFY04和雙嘧達莫均能夠減輕小鼠尾靜脈血管的病變，且LP-KSFY04-H和雙嘧達莫的效果接近，均優于LP-KSFY04-L。對腎臟組織觀察也發現模型組小鼠腎臟組織出現病變，腎小球形態不規則，部分甚至出現破裂，組織間炎癥細胞浸潤現象嚴重；正常組小鼠腎臟組織和細胞完整，LP-KSFY04-H和雙嘧達莫都能夠減輕血栓造成的腎組織炎性病變，使腎臟組織形態接近正常組；同時LP-KSFY04-L也能一定程度減輕血栓小鼠腎組織的病變（圖6B）。如圖6C所示，正常組小鼠肝臟組織完好、細胞大小均勻、中央靜脈圓潤、肝小葉和肝細胞結構完整、細胞邊界清晰；模型組小鼠肝組織中央靜脈形狀不規則，出現大量炎性細胞浸潤，肝細胞邊界出現混亂，部分肝細胞的細胞核破裂；LP-KSFY04-H和雙嘧達莫能顯著抑制血栓造成的肝細胞損傷，兩者效果接近，均優于LP-KSFY04-L。

2.5 LP-KSFY04對血栓小鼠尾靜脈組織中炎癥及血栓形成相關因子mRNA表達的影響

如圖7所示，與正常組相比，模型組小鼠尾靜脈組織的NF-κB p65、ICAM-1、VCAM-1、E-selectin、IL-6和TNF-αmRNA表達水平顯著升高（P＜0.05）。與模型組相比，LP-KSFY04能夠顯著下調血栓小鼠尾靜脈組織中NF-κB p65、ICAM-1、VCAM-1、E-selectin、IL-6和TNF-α表達，且LP-KSFY04-H效果更好，與雙嘧達莫組無顯著差異（P＞0.05）。

圖7 LP-KSFY04對血栓小鼠尾靜脈組織中炎癥及血栓形成相關因子mRNA表達的影響Fig. 7 Effect of LP-KSFY04 on mRNA expression of cytokines related to inflammation and thrombosis in tail vein of mice with thrombosis

2.6 LP-KSFY04對血栓小鼠糞便中微生物水平的影響

如圖8所示，正常組小鼠糞便中的厚壁菌門微生物的mRNA相對表達水平（即相對豐度）顯著低于其他各組（P＜0.05），而擬桿菌門、乳酸桿菌屬和雙歧桿菌屬的mRNA相對表達水平顯著高于其他各組（P＜0.05）。LP-KSFY04能夠使模型組血栓小鼠糞便中的厚壁菌門相對表達水平降低，擬桿菌門、乳酸桿菌屬和雙歧桿菌屬的相對表達水平增強，且LP-KSFY04-H和雙嘧達莫效果相似。此外，LP-KSFY04-H組的乳酸桿菌屬相對表達水平顯著高于正常組（P＜0.05）。

圖8 LP-KSFY04對血栓小鼠糞便中的厚壁菌門（A）、擬桿菌門（B）、乳酸桿菌屬（C）和雙歧桿菌屬（D）mRNA相對表達的影響Fig. 8 Effect of LP-KSFY04 on relative abundance of Firmicutes (A),Bacteroidetes (B), Lactobacillus (C), and Bifidobacteria (D) in feces of mice with thrombosis

3 討 論

角叉菜膠可在實驗小鼠尾部形成與機體全身炎癥關聯的血栓，導致小鼠尾部出現混合性血栓充填，進而引起小鼠尾部發生組織缺血性壞死，能肉眼可見血栓引起的小鼠黑尾。因此，小鼠黑尾長度是直觀判斷實驗性血栓程度的一項重要指標[16]。本研究也證明了角叉菜膠可導致小鼠尾部血栓，形成明顯黑尾，LP-KSFY04能夠縮短血栓小鼠黑尾長度，且高劑量LP-KSFY04效果更優，能達到與抗血栓藥物雙嘧達莫同樣的效果。

凝血4 項（PT、APTT、TT、FIB）是臨床檢測凝血系統異常的常規方法，能夠較為準確地檢測出血液性疾病[17]。血栓形成過程中大量消耗凝血因子，致使PT延長，而凝血因子的大幅度缺失又會造成APTT縮短；同時凝血酶發揮作用可以使FIB持續轉化為血栓主要成分纖維蛋白，這個過程將導致血液長期保持在高凝狀態下，一旦血液纖維蛋白含量異常，機體纖溶增強，同時纖維蛋白降解產物也會增多，從而使TT延長[18-21]。本研究中雙嘧達莫和LP-KSFY04能夠調控凝血4 項指標，表明雙嘧達莫和LP-KSFY04具有抑制血栓形成的作用。

腎臟是機體的重要排毒器官，腎臟出現病變后，機體中各類毒素就難以排出體外，長時間在體內積累，對人體危害極大。機體出現血栓后腎臟代謝受到影響，進而腎臟排毒功能也會受損，嚴重的情況下由于持續加強的炎癥反應還會導致腎衰竭等惡性病變[22]。肝臟負責產生機體內幾乎所有凝血因子，在人體凝血和抗凝動態平衡中發揮至關重要的調節作用，肝功能被破壞后往往伴隨著血液促凝與抗凝的失衡，因此血栓的形成與肝臟密切相關[23]。本研究通過病理學觀察也發現小鼠尾部發生血栓后，腎臟和肝臟組織也出現炎性病變，再次證明了小鼠的尾血栓會累及腎臟和肝臟發生病變，而藥物雙嘧達莫和LP-KSFY04均能夠有效緩解這些病變，且高劑量LP-KSFY04與雙嘧達莫作用相當。

炎癥與血栓之間具有相互促進的關系，炎癥與血栓的持續加劇會導致更為嚴重的器官損傷，進而危及生命[20]。機體出現炎癥后通過Toll樣受體導致單核-巨噬細胞、淋巴細胞、內皮細胞等被激活，從而生產大量炎癥因子，如TNF-α、IL-6[24]。TNF-α是機體免疫-炎癥信號通路中的重要因子，也是血栓與炎癥之間的重要介質。TNF-α是細胞中炎癥反應的重要始動因子，NF-κB、絲裂原活化蛋白激酶等信號通路均受到TNF-α受體調節，從而大量釋放IL-6、IL-β等炎癥細胞因子；同時這些炎癥細胞因子又再次加強巨噬細胞和淋巴細胞活化，使血管內皮細胞的損傷加重，直接或間接促使血栓的形成[25-26]。特別是，IL-1β通過TNF-α調節從內皮細胞中大量釋放，并在血管內皮細胞損傷和血小板聚集過程中發揮關鍵作用，是導致血栓的重要因子[27]。NF-κB、TNF-α和IL-1β等炎癥細胞因子還能使血管內皮細胞中的血栓調節蛋白表達降低，促使血液抗凝活性降低，增加血栓風險；同時還可以增強血管收縮相關因子表達，從而通過血管的持續收縮引發血栓[28]。因此，控制體內NF-κB、TNF-α和IL-1β細胞因子的水平，一方面能夠控制機體炎癥程度；另一方面也能調節血栓相關因子的表達，從而起到干預血栓形成的作用。在本研究中藥物雙嘧達莫和LP-KSFY04均對以上炎癥細胞因子起到了干預作用，因此具有血栓形成抑制作用。

研究顯示NF-κB是血栓形成過程中炎癥相關機制的關鍵調節因子，NF-κB能夠在內皮細胞、血小板、炎癥反應中起到促進和調節作用，NF-κB通過這些調節作用使機體中的凝血-纖溶狀態失衡，導致血栓的形成[29]。ICAM-1在細胞之間和細胞與基質之間的黏附具有明顯的調節作用[30]。VCAM-1對血小板的黏附聚集具有調節作用，過度表達會加劇血栓部位的炎癥[31]。E-selectin對內皮細胞的炎癥損傷和通透性具有調控作用，還可以控制流動血液中總的白細胞與血管內皮細胞的黏附[32]。NF-κB在炎癥刺激狀態下可以促進ICAM-1、VCAM-1和E-selectin等黏附因子表達加強，進一步放大血栓危害和加劇血栓[33]。本研究中血栓導致小鼠尾部出現炎癥反應，以NF-κB通路為中心，ICAM-1、VCAM-1和E-selectin表達水平均較正常狀態顯著升高。雙嘧達莫和LP-KSFY04均能發揮調控NF-κB、ICAM-1、VCAM-1和E-selectin表達的作用，表明LP-KSFY04可能具有良好的血栓形成抑制作用。

血栓形成是心腦血管疾病的重要促因，在機體出現病變后，腸道菌群細胞壁中的有害成分進入血液循環后誘發內毒素血癥，造成機體慢性炎癥，此過程是血栓發病機制中的重要一環。腸道菌群失調也會導致機體出現炎癥，炎癥進一步導致血液中凝血因子異常增加，原有的纖溶酶原不足以抵抗凝血因子異常增加造成凝血和溶栓失調，使血栓形成的風險大大增加[34]。人體腸道內絕大部分細菌由厚壁菌門和擬桿菌門微生物組成，厚壁菌門與擬桿菌門豐度的比值與血液黏稠度密切相關，厚壁菌門豐度的增加可能會導致血栓形成[35]。乳酸菌和雙歧桿菌已被證實具有多種保健作用，對機體的正常代謝具有積極作用，能夠緩解炎癥造成的體內毒素積累和血液流動速度緩慢，從而降低血栓形成的風險[36]。另外健康的腸道菌群可通過調節血小板功能及改變凝血功能等多種機制來降低血栓風險[37]。本研究也證實LP-KSFY04能夠增加血栓小鼠腸道中擬桿菌門、乳酸桿菌屬和雙歧桿菌屬豐度，同時減少厚壁菌門豐度，從而通過調控腸道微生物，抑制機體炎癥，促進血液流通正常，發揮抗血栓作用。

雙嘧達莫的副作用包括頭痛、眩暈、惡心、嘔吐、腹瀉等不良反應，而LP-KSFY04作為食品中分離出的乳酸菌，無副作用，具有更好的應用前景。從韓國泡菜中分離出的短乳桿菌J-38被證實具有體外抑制血小板聚集的作用，具有潛在的抗血栓作用[38]。此外，肥胖也是血栓形成的誘因之一，有研究證實從四川泡菜中分離出的發酵乳桿菌CQPC05具有良好的減脂減肥效果，通過減脂減肥也能一定程度降低血栓形成的風險[39]。但是現有研究還缺乏體內實驗來準確驗證益生菌對血栓形成的干預作用，本研究通過動物實驗研究植物乳桿菌LP-KSFY04對小鼠血栓形成的抑制作用。實驗結果顯示，LP-KSFY04能夠有效降低血栓小鼠的黑尾程度和改善凝血4 項指標，一方面通過調控血清、腎臟和肝臟組織中的炎癥細胞因子，發揮抑炎作用；另一方面，通過調控NF-κB通路ICAM-1、VCAM-1和E-selectin等黏附因子表達，減輕血栓程度。同時，本研究結果進一步表明LP-KSFY04還通過改善小鼠腸道微生物健康，從而降低炎癥程度，發揮血栓形成抑制作用。綜上，LP-KSFY04具有較好的實驗性抗血栓作用，但目前缺乏臨床試驗的結果，還需要加強研究。