巖藻黃素改善視網膜色素上皮細胞吞噬功能的非抗氧化途徑

郭紫欣，劉蕓君，劉翼翔,*，王彥波,2

（1.集美大學海洋食品與生物工程學院，福建 廈門 361021；2.浙江工商大學食品與生物工程學院，浙江 杭州 310018）

隨著電腦、寬屏手機等電子產品的廣泛使用，近年來視網膜相關眼科疾病人群快速增加。過量光輻射會導致視網膜組織的損傷，是高原地區生活人群及強光下工作人群易發老年性黃斑病變的主要原因[1]。因此，長時間注視電腦、手機、電視等電子設備屏幕會讓人產生眼睛干澀、刺痛、疲勞、視覺模糊等不適癥狀[2]。據統計，美國約20%的電腦使用者患有計算機視覺綜合癥[3]，每年由電腦引起的眼科疾病治療費用高達20億 美元[4]；在日本、印度和挪威，這一數據分別達到了19.6%、46.3%和62.5%[4-6]。此外，近視的發生也與視網膜光損傷密切相關。近視的流行病學研究發現，亞洲6～19 歲學生近視患病率達60%，比歐洲高出20%[7]。2001—2015年，中國浙江奉化高中生整體近視人群比例從79.5%上升到87.7%[8]。因此，研究開發具有抑制視網膜光損傷活性的膳食營養因子具有重要的科學意義與社會價值。

巖藻黃素是海洋中存量最豐富的類胡蘿卜素，占到自然界總類胡蘿卜素存量的10%[9]。巖藻黃素主要存在于褐藻、硅藻、金藻及黃綠藻中，是可食性褐藻，也是海帶、裙帶菜、羊棲菜等中的重要活性物質[10]。與其他類胡蘿卜素（包括葉黃素、玉米黃質）不同的是，巖藻黃素具有獨特的丙二烯、環氧烷、乙酰基等特殊結構。研究表明，巖藻黃素具有抗氧化、調節糖脂代謝、抗炎、減肥、神經保護等多種生物活性[11-14]。事實上，在結構方面，巖藻黃素具有與葉黃素、玉米黃質相似的共軛結構，顯示其突出的抗氧化作用[6]；在物化特性方面，作為褐藻適應海洋極端光環境的次生代謝產物，巖藻黃素還具有與葉黃素、玉米黃質相同的特征吸收光譜（光譜范圍350～550 nm；最大吸收波長450 nm），能有效猝滅過量光能對生物體的危害[12]。因此，巖藻黃素具有潛在的預防視網膜光損傷功能。

本課題組前期研究結果表明，口服灌胃巖藻黃素能有效抑制可見光誘導的青紫藍兔視網膜光損傷[2]；在細胞水平上，巖藻黃素能夠通過抗氧化途徑改善視網膜色素上皮（retinal pigment epithelium，RPE）細胞的吞噬功能[15]。值得注意的是，與葉黃素、玉米黃質以及花色苷等抗氧化成分相比，巖藻黃素在抑制RPE細胞活性氧（reactive oxide species，ROS）自由基方面并無明顯優勢，但卻具有更加顯著的改善RPE細胞吞噬功能的功效[2]。因此，本研究在前期研究基礎上，進一步從非抗氧化途徑探究巖藻黃素改善可見光誘導RPE細胞吞噬功能紊亂的作用機制，以期為利用巖藻黃素開發視力保護產品提供支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

人RPE細胞株ARPE-19（ATCC CRL-2302） 美國典型培養物保藏中心；巖藻黃素標準品、葉黃素標準品、二十二碳六烯酸（docosahexaenoic acid，DHA）、F12細胞培養液、熒光乳膠顆粒（直徑0.05 μm）西格瑪奧德里奇貿易有限公司；Mer酪氨酸激酶（Mer tyrosine kinase，MerTK）酶聯免疫吸附測定試劑盒（BMS2285） 北京諾為生物技術有限公司；αV整合素蛋白酶聯免疫吸附測定試劑盒（ZY-ITGaV-Hu） 上海澤葉生物科技有限公司；β5整合素蛋白酶聯免疫吸附測定試劑盒（YZ-E989582） 上海研尊生物科技有限公司；CD36酶聯免疫吸附測定試劑盒（EH88RBX5）賽默飛世爾科技（中國）有限公司；單克隆抗體兔抗MerTK（ab238516）、兔抗αV（ab179475）、兔抗β5（ab184312）、兔抗CD36（ab252922） 艾博抗（上海）貿易有限公司。

1.2 儀器與設備

Millicell ERS-2電壓電阻表 西格瑪奧德里奇（上海）貿易有限公司；Infinite M200 Pro酶標儀 德國Tecan公司；MCO-15AC二氧化碳培養箱、MLS2420/2420U全自動殺菌釜 日本Sanyo公司；XDOS-1B倒置生物顯微鏡 重慶光電有限公司；Thermo ScientificTM生物安全柜 賽默飛世爾科技（中國）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 RPE分化細胞單層培養

將第4代ARPE-19細胞用于TransWell培養。TransWell小室（0.4 μm孔徑、6.5 mm直徑）加入F12不完全培養基在CO2培養箱中孵育2 h后，移棄培養基，細胞按5×104個/mL接種到TransWell上層。為了確保細胞貼壁，開始時使用含質量分數10%胎牛血清的F12完全培養基，培養24 h后為避免細胞過快生長，完全培養基更換為含2%胎牛血清的F12完全培養基。每周換液3 次。接種48 h后，用電壓電阻表檢測TransWell膜上下兩層的跨膜電阻。當ARPE-19細胞單層跨膜電阻值≥25 Ω·cm2時，表明ARPE-19細胞分化完全，然后用于可見光暴露實驗[16-17]。

1.3.2 脂環境下可見光誘導RPE細胞損傷體外模型建立

在構建分化RPE細胞單層的基礎上，構建脂環境下可見光誘導RPE細胞損傷的體外模型[15,18]。將TransWell小室上層培養液替換為含有25.0 μmol/L DHA的無血清F12培養基，模擬RPE細胞處于高多不飽和脂肪酸的生理環境；然后在CO2培養箱中進行可見光輻照實驗。可見光強度設置為3 500 lx，光照時間分別為6、12 h和 24 h，空白組不進行光照處理。

1.3.3 巖藻黃素的干預實驗

以葉黃素為對照，配制含巖藻黃素的無血清F12培養基，終質量濃度均分別為5.0、10.0 μg/mL和20.0 μg/mL。在RPE細胞單層進行光照處理前，在TransWell小室上層中加入含巖藻黃素或葉黃素的F12培養基，在CO2培養箱中孵育24 h。然后按照1.3.2節實驗步驟進行光照實驗。模型組中不添加葉黃素和巖藻黃素，其余條件保持一致。

1.3.4 RPE細胞吞噬功能測定

RPE細胞吞噬功能評價方法參考文獻[2,19]方法。將直徑0.05 μm的熒光微粒水懸液用F12不完全培養基稀釋到1×107個/mL，并于培養箱37 ℃下孵育10～20 min。然后將含有熒光微粒的培養基加入到TransWell小室上層。RPE細胞經光照處理后，孵育24 h后將含有熒光微粒的培養基吸出。進行熒光檢測前，先加入pH 7.2 0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液洗兩次，再加入100 μL胰酶進行消化，然后用磷酸鹽緩沖液補足到1 mL，并將細胞吹打下來，最后轉入到96 孔黑板中進行熒光檢測（激發波長360 nm、發射波長420 nm）。以不加熒光微粒的細胞為空白組，平行實驗5 次。

光照結束后，繼續在CO2培養箱中培養24 h。以吞噬指數表征RPE細胞吞噬功能。吞噬指數計算公式如下。

式中：N0為光照前RPE細胞數量；Nt為光照t小時后RPE細胞數量。

1.3.5 RPE細胞吞噬受體相對表達量測定

采用酶聯免疫吸附測定試劑盒，測定1.3.3節光照實驗后細胞內MerTK受體、αV整合素蛋白受體、β5整合素蛋白受體及CD36受體表達量，具體實驗步驟按照試劑盒說明書進行。計算相對空白組（不進行光照處理）蛋白的表達量。

1.3.6 不同吞噬受體對RPE細胞吞噬功能影響的測定

為明確不同吞噬受體對RPE細胞吞噬功能的影響，采用吞噬受體的特異性抗體進行結合分析。在1.3.3節實驗過程中（葉黃素和巖藻黃素質量濃度均為20 μg/mL），同時分別加入MerTK、αV、β5及CD36受體的抗體進行共同孵育，然后分析比較吞噬受體與抗體結合后對RPE細胞吞噬功能的影響。

1.3.7 RPE細胞吞噬作用的L-型Ca2+通道途徑分析測定

RPE細胞L-型Ca2+通道可通過硝苯地平（nifedipine，NIF）進行抑制[20]。在1.3.3節實驗過程中（葉黃素和巖藻黃素質量濃度均為20 μg/mL），同時在巖藻黃素和葉黃素中分別加入NIF進行共同孵育，使NIF終濃度為5.0 μmol/L，然后分析比較RPE細胞吞噬功能的變化。

1.4 數據處理與分析

數據均用Origin 8.0統計軟件進行處理，用單因素方差分析和Duncans多重比較檢驗分析數據，實驗結果以平均值±標準差表示。

2 結果與分析

2.1 可見光暴露對RPE細胞吞噬功能的影響

RPE細胞經4 周的TransWell培養，細胞單層跨膜電阻達到35.2 Ω·cm2，表明其已分化完全，具備體內RPE的組織結構特性。經光強度為3 500 lx的可見光輻照后，RPE細胞的吞噬功能變化如圖1所示。結果表明，在24 h光照時間內，隨著光照時間的延長，RPE細胞的吞噬指數逐漸降低。與空白組相比，當可見光暴露時間為6 h時，RPE細胞的吞噬功能并沒有出現顯著降低（P＞0.05），當可見光暴露時間達到12 h和24 h時，RPE細胞的吞噬指數分別較空白組降低了（18.51±4.36）%和（31.64±3.25）%，說明RPE細胞的吞噬功能已發生明顯紊亂。

圖1 可見光暴露時間對RPE細胞吞噬指數的影響Fig. 1 Effect of visible light exposure time on phagocytic index of RPE cells

2.2 可見光暴露對RPE細胞吞噬受體表達的影響

如圖2所示，隨著可見光暴露時間的延長，MerTK受體、αV整合素蛋白受體、β5整合素蛋白受體及CD36受體的表達均出現不同程度的下降，該趨勢與RPE細胞吞噬功能的變化相一致。其中，可見光對αV與β5整合素蛋白受體表達的影響最大。光暴露時間為6 h時，與空白組相比，αV與β5整合素蛋白受體相對表達量均極顯著下降（P＜0.01），分別降低了10.72%和12.25%；經過24 h光暴露后，兩者的表達量降幅分別達到31.46%和28.74%。其次是MerTK受體，經24 h光照處理后其表達量降低了23.64%。然而，CD36受體經24 h光照后表達量僅降低了14.51%。

圖2 可見光暴露時間對RPE細胞吞噬受體相對表達量的影響Fig. 2 Effect of visible light exposure time on phagocytic receptor expression in RPE cells

2.3 巖藻黃素對RPE細胞吞噬功能的改善作用

根據本課題組前期研究報道，巖藻黃素和葉黃素在質量濃度≤20.0 μg/mL時對RPE細胞沒有細胞毒性[15]。如圖3所示，與空白組相比，RPE細胞經3 500 lx可見光輻照24 h后，模型組RPE細胞的吞噬指數僅為（62.36±4.15）%。經質量濃度10.0 μg/mL和20.0 μg/mL巖藻黃素預處理后，RPE細胞的吞噬指數分別提高到（78.34±4.21）%和（89.56±6.36）%。葉黃素的效果較巖藻黃素略差，在質量濃度20.0 μg/mL時，RPE細胞的吞噬指數提高到（80.36±4.69）%。

圖3 巖藻黃素及葉黃素對RPE細胞吞噬指數的影響Fig. 3 Effects of fucoxanthin and lutein on phagocytic index of RPE cells

2.4 巖藻黃素對RPE細胞吞噬受體表達的影響

如圖4所示，巖藻黃素及葉黃素對RPE細胞4種吞噬受體表達的影響均呈劑量依賴性。圖4A的結果表明，當巖藻黃素質量濃度為5.0 μg/mL時，與模型組相比，αV與β5整合素蛋白受體表達并未出現顯著增加（P＜0.05）；當質量濃度提高到10.0 μg/mL時，αV與β5整合素蛋白受體相對表達量分別增加了15.80%和15.08%。當質量濃度進一步提高到20.0 μg/mL，αV與β5整合素蛋白受體相對表達量較模型組分別增加了24.6%和25.0%。對于MerTK受體和CD36受體，經質量濃度20.0 μg/mL巖藻黃素處理后，其表達量均與空白組沒有顯著差異（P＞0.05）。與吞噬功能結果類似，葉黃素的效果較巖藻黃素略差。圖4B顯示，當葉黃素質量濃度為20.0 μg/mL時，MerTK受體、αV整合素蛋白受體、β5整合素蛋白受體及CD36受體的表達量分別為空白組的（89.34±3.48）%、（86.16±3.89）%、（90.26±2.37）%和（92.38±2.68）%。

圖4 巖藻黃素及葉黃素對RPE細胞吞噬受體表達的影響Fig. 4 Effect of fucoxanthin and lutein on phagocytic receptor expression in RPE cells

2.5 巖藻黃素通過調節吞噬受體表達改善RPE細胞吞噬功能的驗證

為進一步驗證巖藻黃素通過影響吞噬受體表達改善RPE細胞吞噬功能，本研究比較了不同吞噬受體特異性抗體的抑制作用，結果如圖5所示。MerTK抗體對RPE細胞吞噬功能的影響最明顯。巖藻黃素在質量濃度20 μg/mL下，RPE細胞的吞噬指數恢復到了89.56%。當加入MerTK抗體后，RPE細胞的吞噬指數僅恢復到70.36%。當分別加入αV整合素蛋白抗體、β5整合素蛋白抗體和CD36抗體，RPE細胞的吞噬指數分別恢復到76.25%、80.34%和87.18%。在質量濃度20 μg/mL葉黃素作用下，加入各抗體后RPE細胞的吞噬指數低于巖藻黃素。結果表明巖藻黃素主要是通過調節MerTK、αV、β5受體表達改善RPE吞噬功能。

圖5 不同吞噬受體抗體對RPE細胞吞噬功能影響的比較Fig. 5 Effects of different phagocytic receptor antibodies on phagocytic function of RPE cells

2.6 巖藻黃素通過L-型Ca2+通道途徑改善RPE細胞吞噬功能

研究表明，L-型Ca2+通道在RPE細胞吞噬過程中同樣扮演了重要角色[20]。本研究通過L-型Ca2+通道抑制劑NIF處理RPE細胞后，觀察巖藻黃素改善其吞噬功能效果的變化，結果如圖6所示。在沒有NIF的情況下，質量濃度20.0 μg/mL的巖藻黃素和葉黃素可將RPE細胞的吞噬指數從模型組的62.36%分別提高到89.56%和80.36%；然而當加入NIF后，巖藻黃素+NIF處理組和葉黃素+NIF處理組的吞噬指數分別僅恢復到72.52%和67.65%；表明L-型Ca2+通道是巖藻黃素及葉黃素改善RPE細胞吞噬功能的重要途徑。

圖6 巖藻黃素及葉黃素通過L-型Ca2＋通道途徑改善RPE細胞的吞噬功能Fig. 6 Fucoxanthin and lutein improved the phagocytic function of RPE cells through the L-type Ca2+-channel

3 討 論

視網膜是外界可見光聚焦與視覺信號轉換的場所，是視覺形成的重要組織。由于新陳代謝及視覺信號傳導的生理需要，視網膜不僅處于高氧壓環境，其感光細胞外節多不飽和脂肪酸含量高達50%以上[21]。如此生理結構特點導致視網膜極易受到光脂氧化的雙重脅迫[22-23]。其中，RPE細胞是視網膜損傷的主要靶細胞，承擔著吞噬感光細胞脫落膜盤（photoreceptor outer segments，POS）、維持視網膜正常生理功能的關鍵作用。當RPE細胞的吞噬作用發生紊亂，POS會在視網膜下腔堆積，造成感光細胞凋亡，從而導致視覺障礙[24]。因此，調節RPE細胞吞噬作用是維持視網膜正常生理功能的重要措施。

自然界中的多種生理活性物質已被證實具有視力保護作用，如葉黃素、玉米黃質、β-胡蘿卜素、花色苷、VC、VE以及多不飽和脂肪酸等。但在電腦等視頻終端設備高度普及的今天，光應激導致的視網膜生理功能紊亂對視力保護因子的生理調節作用提出了新的要求。研究表明，槲皮素能有效抑制過量光輻照引起的大鼠視網膜損傷[25]；青蒿素也被證實對可見光誘導的視網膜細胞凋亡及氧化損傷有良好的抑制功能[26]。本課題組也發現，膳食中的葉黃素、玉米黃質、花色苷等天然抗氧成分對光應激下的視網膜生理功能紊亂具有明顯的調節作用[1,27]，但β-胡蘿卜素、VC、VE等抗氧化成分的效果較差，多不飽和脂肪酸甚至具有加劇視網膜光損傷的風險[18,28]。

本課題組前期研究表明，巖藻黃素能通過抑制光-脂聯合誘導RPE細胞氧化損傷改善其吞噬功能[15]。與葉黃素相比，巖藻黃素在抑制RPE細胞ROS產生方面無明顯優勢可言[2]。然而，本研究發現，巖藻黃素在質量濃度20.0 μg/mL下將RPE細胞的吞噬指數從模型組的62.36%提高到了89.56%，明顯高于葉黃素的80.36%。巖藻黃素在調節RPE細胞吞噬作用與抑制RPE細胞產生ROS方面形成了巨大反差，說明巖藻黃素可能對RPE細胞的吞噬作用還存在其他調控途徑。

事實上，RPE細胞吞噬作用存在復雜的調控機制。研究表明，在RPE細胞膜上存在與吞噬作用密切相關的多個受體，包括甘露糖受體、毒蕈堿能受體、CD36、αV、β5整合素蛋白受體和MerTK酪氨酸蛋白激酶受體[29]。其中，αV、β5整合素蛋白受體負責吞噬作用的識別與結合；而CD36和MerTK受體負責內吞作用[29]。此外，最新研究發現，RPE細胞的吞噬作用還受L-型Ca2+通道及大電導鉀通道激活的信號轉導途徑調控[30]。然而，現有研究很少涉及膳食營養因子對上述吞噬受體、信號轉導途徑的影響。本研究結果發現，在光-脂聯合誘導RPE細胞氧化損傷的情況下，巖藻黃素對αV、β5整合素蛋白受體、MerTK受體表達以及L-型Ca2+通道信號途徑具有明顯的促進與調節作用，從而有效改善RPE細胞的吞噬功能。這有可能是膳食營養成分保護視力的重要作用途徑。然而，L-型Ca2+通道信號與吞噬受體表達之間是否存在關聯性還值得進一步研究。

4 結 論

過量的可見光暴露會導致處于多不飽和脂肪酸環境下的RPE細胞發生明顯的吞噬功能紊亂，參與細胞吞噬作用的MerTK受體、αV整合素蛋白受體、β5整合素蛋白受體及CD36受體的表達也受到了不同程度的抑制。巖藻黃素預處理主要通過上調MerTK、αV整合素蛋白和β5整合素蛋白受體表達顯著改善了RPE細胞的吞噬功能。此外，L-型Ca2+通道也被證實是巖藻黃素改善RPE細胞吞噬功能的重要途徑。由此可見，非抗氧化途徑在巖藻黃素改善RPE細胞生理功能方面扮演了重要角色。然而，該途徑與傳統抗氧化機制之間的關系還有待進一步研究。