梁 杉,王 琨,劉佩瑤,何曉桐,鄒澤斌,黎 攀,杜 冰
(華南農業大學食品學院,廣東 廣州 510642)
山藥(Dioscorea oppositaThunb.)又名薯蕷、土薯、山薯等,是薯蕷科(Dioscoreaceae)草本植物的地下塊莖,主要分布于非洲、美洲和亞洲的熱帶和亞熱帶地區,山藥在我國栽培歷史悠久,其原產地是河南焦作,現在華北、華中、山東、江蘇、福建、云南等地均有廣泛分布[1]。山藥是一種藥食同源植物,含有蛋白質、脂肪、維生素等多種營養成分,同時還含有多糖、尿囊素、皂苷等多種活性成分[2],其中多糖是其主要的活性成分。
山藥多糖因其復雜的組成和結構,具有多種功效作用,是近年來的研究熱點。山藥多糖主要由葡萄糖(glucose,Glu)、甘露糖(mannose,Man)、半乳糖(galactose,Gal)等單糖組成,具有抗氧化[3]、降血脂[4]、抗腫瘤[5]、抗衰老[6]、調節免疫活性[7]等多種生物學功效。山藥多糖的生物活性與其結構特征息息相關,因此本文主要從山藥多糖的結構、活性機制及結構與活性的關系進行綜述,旨在為研究山藥多糖的結構特征及生物活性提供理論依據。
山藥多糖主要是由7種單糖和2種糖醛酸組成,其中單糖分別是Glu、Man、鼠李糖(rhamnose,Rha)、Gal、木糖(xylose,Xyl)、核糖(ribose,Rib)和阿拉伯糖(arabinose,Ara),在樣品中含量較高的是Gal、Glu、Rha和Ara,糖醛酸只有半乳糖醛酸(galacturonic acid,GalA)和葡萄糖醛酸(glucuronic acid,GluA)兩種(表1),山藥多糖的單糖組成和含量受產地、品種、純化方法、洗脫液、生長環境等多種因素的影響。
不同產地的山藥,其單糖組成和含量存在差異。河南和廣東產的山藥中普遍Glu含量高,浙江和河北產的山藥中單糖種類少[8-10];而同一產地的不同品種山藥,其單糖含量有一定區別,如種植于河南的4種山藥,懷山藥和白玉山藥中Glu含量較高,懷山藥中Gal含量較高,鐵棍山藥中Man含量較高[11-14]。
不同純化方法純化出的多糖中單糖組成存在差異。目前用于分離純化山藥多糖的方法主要有DEAE纖維柱層析法、葡聚糖凝膠柱層析法及膜分離法3種,其中使用DEAE纖維柱層析法純化得到的3個山藥多糖組分(多糖I、多糖II、多糖III)中,多糖II糖醛酸含量高;超濾膜包法純化得到的3個HSY組分(HSY-I、HSY-II、HSY-III)中,組分II中Glu含量較高,組分III中Gal含量較高,組分I中僅含有Gal和GluA;而高速逆流色譜法(high-speed countercurrent chromatography,HSCCC)和Sephadex凝膠柱層析法純化后的山藥多糖僅由Glu和Gal組成[15-16,19]。

表1 山藥多糖的單糖和糖醛酸組成Table 1 Monosaccharide and uronic acid compositions of yam polysaccharides
山藥多糖中單糖組成會受到洗脫液的影響。山藥多糖經過DEAE纖維柱層析時,蒸餾水洗脫出的為中性多糖,NaCl洗脫出的為酸性多糖[20]。目前山藥多糖主要包括中性多糖和酸性多糖兩種,其中中性多糖主要由Glu、Gal、Man、Ara、果糖(fructose,Fru)5種單糖組成,酸性多糖主要包括Glu、Man、Gal、Xyl、Ara、阿卓糖、GalA 7種單糖[21-24]。
不同生長環境的山藥中單糖組成和含量受土壤類別、土壤pH值等因素的影響。如砂土栽培的山藥中Glu含量較高且單糖含量最高的是Glu、GalA和Gal,而黃土栽培的山藥中含量最高的是Gal、Man和Ara[8]。對于種植于砂土的山藥,由于連作土壤中pH值降低,引起土壤養分元素發生變化,使得連作砂土種植的山藥中Gal相對含量由7.03%升高至26.19%[8,25]。此外化學修飾也會影響山藥多糖的單糖組成。硫酸化修飾后,多糖中Rha、巖藻糖、GluA的含量降低,而Gal和GalA的含量增加[12,26]。
目前提取山藥多糖的方法有熱水提取法、酶法、超聲波輔助提取法等。多糖類物質由于其分子中含有大量極性基團,因而對水分子具有較大的親和力,一些分子質量較小、分支程度較低的多糖在水中有一定溶解度,并且溫度越高,其溶解性能越好[27];傳統的熱水提取法成本低、操作簡單,是提取植物多糖最常用的方法[28]。分子質量較大的多糖,疏水性強,溶解度差,就需要采用酸、堿、有機溶劑或酶法、超聲波等輔助方法來將植物細胞壁降解成易溶于提取溶劑的小分子物質,或是機械性地破壞植物細胞壁,加快細胞質中成分的傳遞,從而加速植物細胞中有效成分的溶出[29-31],因此不同分子質量大小的山藥多糖應選用不同的多糖提取方法[29,32]。Zhao Chengcheng等[33]分別采用熱水、溫水、冷水、超聲輔助來提取山藥多糖,其中熱水提取出的多糖分子質量最低,其他3種方法提取的多糖分子質量相差不明顯,可能是熱水提取過程中隨著溫度的升高,多糖發生熱降解,分子質量減小[34]。
目前用于測定山藥多糖分子質量的方法主要是高效凝膠滲透色譜法(high-performance gel permeation chromatography,HPGPC)和高效液相色譜法(highperformance liquid chromatography,HPLC)(表2)。HPGPC是將分子質量大小不同的聚合物按其由大到小的順序依次洗脫,當聚合物分子質量大于填料孔徑時,不能被洗脫出,因此用于測定分子質量在一定范圍內的聚合物,此外這種方法會因聚合物分子中某些陰離子基團與凝膠色譜柱表面殘留的陰離子基團相互排斥而導致測出的分子質量偏大[37-38];HPLC是根據固定相對組分的吸附力大小不同而將不同的組分分離,適用于分子質量大、分子質量范圍廣的化合物分析[39]。從表2可看出,山藥多糖的分子質量在1~370 ku范圍內,其中HPGPC測得的分子質量為1~50 ku,HPLC測得的分子質量為9~370 ku,此外陳運中等[24]采用多角度激光光散射檢測器和示差折光檢測器與凝膠滲透色譜聯用測出山藥多糖的分子質量為34.78~65.09 ku。分子質量大小還與多糖種類有關,多糖提取方法和分子質量測定方法相同時,酸性多糖的分子質量大于中性多糖的分子質量[24,40]。

表2 提取和測定方法對山藥多糖分子質量的影響Table 2 Effects of extraction and detection methods on molecular mass of yam polysaccharides
山藥多糖分子質量還受化學修飾和分離純化方法的影響。硫酸酯化修飾后,強烈的反應條件使山藥多糖降解,從而使其硫酸化多糖衍生物的分子質量由原來的66.00~68.32 ku降低到9~18 ku[11-12]。不同的純化方法可以有效分離分子質量片段不同的山藥多糖,同時在分離純化過程中,由于多糖降解,糖鏈斷裂,導致大分子多糖變成小分子多糖而被透析除去,因此,采用梯度醇沉法分離的山藥多糖,其分子質量隨乙醇體積分數的增大而減??;同樣柱層析法純化的山藥多糖,其分子質量隨NaCl洗脫液濃度的升高也減小[16,20,24]。
山藥多糖糖鏈的結構包括碳鏈構型、糖苷鍵類型、糖鏈有無分支、分支的位置等(表3),山藥多糖的主鏈主要由Glc、Man、Gal組成,其中Glc最常見,Man和Gal常在支鏈末端,側鏈通過O-2、O-3、O-6與主鏈連接,碳鏈有α和β兩種構型。不同組分的山藥多糖中,糖苷鍵的類型、糖苷構型有所差異,如懷山CYS中,組分1(CYS-1)的碳鏈有2種α構型和4種β構型,其中主鏈由1→2和1→4兩種糖苷鍵連接,而組分2(CYS-2)的碳鏈有2種α構型和3種β構型,主鏈主要是由1→2、1→4和1→6 3種糖苷鍵連接[14]。

表3 山藥多糖的糖苷及糖鏈Table 3 Glycosides and sugar chains of yam polysaccharides
山藥多糖具有抗氧化[3]、降血脂[4]、抗腫瘤[5]、抗衰老[6]和免疫調節[7]等多種生物學活性,廣泛應用于功能性食品、藥品等行業。現階段,有關山藥多糖的體外評價和動物實驗不斷被報道,對其機制的研究也逐漸深入,明確其具體的活性機制對山藥多糖的精深加工及應用具有指導意義。
氧化應激會導致機體內脂類、蛋白質、DNA、脂質膜的損壞,從而引起機體衰老。研究表明,山藥多糖具有很強的還原力,具有抗氧化和抗衰老的功效[6]。山藥多糖主要通過清除自由基來發揮其體外抗氧化的作用,同時又通過激活各種抗氧化酶、調控抗衰老基因klotho的表達、調控p53/p12信號通路而起到抗衰老的作用。
山藥多糖通過清除羥自由基、超氧陰離子自由基、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-dipheny1-2-picrythydrazyl,DPPH)自由基來提高其體外抗氧化活性[30],且其清除能力可達到VC的清除水平[3]。其中清除自由基的機理可能是山藥多糖中的羥基可以提供氫,與羥自由基結合,促進羥自由基的清除;另外多糖中可能存在親電基團,如醛或酮,會釋放出氫原子,清除超氧陰離子自由基;而對DPPH自由基的清除可能是與山藥多糖中單糖組成、糖苷鍵及構型有關[46-49]。
山藥多糖可通過上調相關抗氧化基因超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)和過氧化氫酶(catalase,CAT)的mRNA表達水平,使機體內各種氧化酶如SOD、CAT和谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)的活力顯著提高,脂質過氧化物如丙二醛(malondialdehyde,MDA)、總膽固醇(total cholesterol,TC)、甘油三酯(triglyceride,TG)的水平顯著降低,從而降低胞內自由基的數量,提高機體抗氧化應激的能力,減少氧化損傷,延緩衰老[50-52]。
山藥多糖可上調肝和腎臟中抗衰老klotho基因的表達來延緩小鼠衰老[6],klotho蛋白通過與細胞膜表面特定受體結合而啟動胞內的信號轉導過程,該信號傳遞可以抑制特定的靶酶磷酸肌醇-3激酶/蛋白激酶B(phosphatidyinositol 3-kinase/protein kinase B,PI3K/Akt)的磷酸化過程,而導致Akt的去磷酸化,去磷酸化后的Akt抑制了叉頭轉錄因子FOXO家族(FOXO1、FOXO3a、FOXO4等)的磷酸化,進而直接調控并促進錳超氧化物歧化酶(MnSOD)的表達,從而清除細胞內活性氧類物質,減輕氧化應激,延緩機體衰老[6,52]。
p53/p12信號通路在氧化應激引發細胞衰老的調節中發揮著重要作用,其中p53蛋白和p12蛋白是細胞衰老調控通路中的關鍵蛋白,當氧化應激發生時,p53蛋白活化,表達水平升高,進而激活p21蛋白,使其表達量顯著上升,引起衰老的發生[53]。對D-半乳糖誘導的衰老大鼠灌胃山藥多糖后,大鼠中衰老基因p16、p21的表達水平降低,免疫印跡檢測結果表明,山藥多糖可顯著下調大鼠肝腦中p53、p21蛋白的表達,從而下調衰老基因的表達水平[54],因此推斷山藥多糖發揮抗氧化與抗衰老主要的機制如圖1所示。

圖1 山藥多糖的抗氧化與抗衰老機制Fig. 1 Antioxidant and anti-aging mechanisms of yam polysaccharides
免疫調節活性被認為是改善老年人和癌癥患者身體防御機制的重要能力[55]。大量研究表明,山藥多糖具有免疫調節的功效[56-57]。Li Cheng等[43]研究得出,含有N-聚糖的山藥糖蛋白(30CYGP)和去糖基化的山藥糖蛋白(De-30CYGP)都具有免疫調節作用,其中兩種糖蛋白發揮免疫作用的機制可能是山藥糖蛋白激活了巨噬細胞,促進了一氧化氮(NO)的釋放而發揮其免疫調節作用,這與Chen Weixia等[58]的研究結果相似;而Huang Rong等[17]研究發現,山藥非淀粉多糖(CYP)及多糖硫酸化衍生物(SCYP)均能減輕環磷酰胺誘導的免疫抑制小鼠的免疫損傷,而SCYP在一定程度上表現出更為明顯的作用,其機制可能是CYP和SCYP通過刺激脾淋巴細胞增殖,觸發T細胞表面標志物(CD3+、CD4+、CD8+)的表達,同時使免疫損傷小鼠中CD4+/CD8+恢復,從而活化T細胞,釋放大量腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF)α和白細胞介素(interleukin,IL)1β,并刺激了血清中抗體免疫球蛋白(immunoglobulin,Ig)G和IgM的產生,激活免疫系統,增強免疫調節功能。
此外山藥多糖還可調控核因子κB(nuclear factor κB,NF-κB)信號通路激活其免疫調節活性,NF-κB是一種轉錄因子,調節與免疫和炎癥反應相關的各種基因。在未受刺激細胞的胞質中,NF-κB與NF-κB抑制蛋白(inhibitory protein of NF-κB,IκB)結合,成為一種非活性復合物形式。當細胞受到刺激時,IκB激酶(IκB kinase,IKK)復合物被激活。IKK家族催化IκB-α磷酸化并與NF-κB解離,IκB-α降解并誘導NF-κB的核異位,將NF-κB轉化為活化形式[59]。Li Min等[23]研究表明,山藥非淀粉多糖可通過激活NF-κB信號通路,從而激活RAW264.7巨噬細胞,釋放大量NO,促進IL-6和TNF-α的表達,最終發揮其免疫調節功效。山藥多糖發揮免疫調節作用主要的機制如圖2所示。

圖2 山藥多糖的免疫調節機制Fig. 2 Immunoregulatory mechanism of yam polysaccharides
山藥多糖具有降血糖、降血脂、治療糖尿病的功效[60]。山藥多糖可降低2型糖尿病大鼠體內與糖代謝相關酶活力,如己糖激酶(hexokinase,HK)、琥珀酸脫氫酶(succinate dehydrogenase,SDH)及蘋果酸脫氫酶(malate dehydrogenase,MDH)、α-葡萄糖苷酶的活力,來降低其血糖水平[18,61];此外山藥多糖也能夠通過降低大鼠體內的TC、TG和低密度脂蛋白膽固醇(low-density lipoprotein cholesterol,LDL-C)的含量,改善胰島素抵抗降低糖尿病小鼠的血糖、血脂水平[62-67],杜妍妍等[68]研究發現,低、中、高劑量的山藥多糖均能顯著降低小鼠的空腹血糖濃度和血清胰島素指標水平,并能在一定程度上改善胰島素抵抗指數,較好地發揮其降糖、降脂功效;王淑靜[61]的研究也得出類似的結論。山藥多糖改善胰島素抵抗的機制復雜,Lee等[69]在研究CYP是否會對胰島素抵抗有影響時發現,CYP在抑制由TNF-α或活性氧誘導的胰島素抵抗中發揮了重要作用,推測可能的潛在機制是山藥多糖抑制了胰島素受體底物蛋白的酪氨酸磷酸化,使胰島素受體(insulin receptor,IR)和磷酸化Akt(phospho-Akt,p-Akt)水平增加,從而增大了胰島素信號通路中Akt的活性,抑制了小鼠體內Glu濃度的升高,并降低血脂水平;而Cheng Zhenyong等[67]研究又表明,山藥多糖可通過降低LDL-C和TC的水平,抑制游離脂肪酸(free fatty acids,FFAs)的產生,隨后降低血清中瘦素和IL-1β的水平并下調內臟脂肪組織中基質金屬蛋白酶-3(matrix metalloproteinase-3,MMP-3)的表達,減少了炎癥蛋白產物,同時MMP-3活力降低又抑制了TNF-α的產生,從而改善了胰島素抵抗,起到降血脂的功效,因此推測山藥多糖改善胰島素抵抗的主要機制如圖3所示。

圖3 山藥多糖改善胰島素抵抗的機制Fig. 3 Mechanism by which yam polysaccharides improve insulin resistance
研究表明,山藥多糖具有預防肝損傷的作用[70]。對急性酒精中毒的小鼠灌胃山藥多糖溶液,可協調小鼠肝器官,調節血糖水平,降低乙醇和乙醛的質量濃度,延長醉酒耐受時間,減輕小鼠肝損傷;對D-半乳糖誘導的衰老小鼠灌胃HSY后發現,HSY能明顯改善衰老小鼠肝、腎組織器官的病理狀態,修復肝、腎的儲備能力;對環磷酰胺所致免疫低下小鼠分別灌胃中劑量和高劑量的山藥多糖后發現,小鼠脾臟指數和白細胞計數明顯改善,肝組織病理學損傷明顯減輕,山藥多糖對肝脾損傷小鼠起到良好的保護作用;對肝損傷的小鼠灌胃山藥多糖溶液后,小鼠體內血清谷丙轉氨酶和天冬氨酸轉氨酶的活力降低,MDA、NO含量及肝臟指數降低,而GSH-Px和SOD活力增大,小鼠的體質量、脾臟指數和白細胞數量得到改善,小鼠肝損傷修復[71-74]。
目前治療癌癥的方法大多數依賴于化學藥物,但長期使用化學藥物治療會導致機體免疫力下降,因此,尋找高效、低毒、低副作用的天然抗腫瘤藥物具有重要意義。研究表明,植物多糖多無毒且具有抗腫瘤活性[75-76]。趙國華等[77]研究表明,山藥多糖可促進T淋巴細胞和自然殺傷細胞的增殖分化,提高腫瘤小鼠的脾淋巴細胞和巨噬細胞中IL-2和TNF-α含量,抑制腫瘤細胞生長,誘導腫瘤細胞凋亡,發揮抗腫瘤功效,且山藥多糖的給藥劑量越高,荷瘤鼠腫瘤質量越小,對腫瘤抑制率越高。
Li Pan等[9]發現CYP及從中分離純化出的水溶性多糖(CYP-1)均能降低葡聚糖硫酸鈉(dextran sodium sulfate,DSS)誘導的結腸炎小鼠中厚壁菌門數量,增加擬桿菌門數量,從而使厚壁菌門與擬桿菌門的比例降低,緩解了腸道菌群失調,且與DSS誘導的結腸炎小鼠相比,CYP-1降低了幽門螺桿菌和未知腸桿菌科的水平,而CYP增加了鼠桿菌、玫瑰桿菌和杜氏桿菌的水平,CYP-1和CYP均改善了DSS誘導結腸炎小鼠的腸道微生物群失調,緩解了結腸炎小鼠的炎癥。
在多糖中單糖作為基本組成單元會以特定的方式形成特殊的空間構象,這個空間構象一般都是多糖發揮活性的中心,如糖醛酸能明顯影響多糖的活性[78-79]。在山藥多糖中,糖醛酸能夠清除DPPH自由基、羥自由基和超氧陰離子自由基,且清除能力隨著糖醛酸濃度的增加而提高[15,27];此外嚴靜等[10]分別用清水、亞硫酸鈉及乳酸芽孢桿菌發酵液對山藥多糖進行3種不同的護色處理,并探究其對巨噬細胞分泌IL-6水平的影響中發現,乳酸芽孢桿菌發酵液護色的山藥多糖中糖醛酸含量顯著升高,免疫活性明顯增強。
多糖的活性與其分子質量大小密切相關[80],分子質量過小,很難形成活性空間結構,分子質量越大,多糖分子的體積越大,越不利于多糖跨越細胞膜被吸收進入生物體內發揮生物學活性,分子質量分布在一個比較合理的區間由于多糖發揮其生物活性[78]。超聲波輔助提取法、冷水提取法、溫水提取法和熱水提取法提取的4種山藥多糖中,超聲波輔助提取法和冷水提取法制得的山藥多糖分子質量相對較低,表現出的抗氧化活性較強[33];同樣對于分子質量分別為132、94、36 kDa和9 kDa的4種山藥多糖(DP、LP1、LP2和LP3)中,LP3分子質量最小,但其抗氧化能力明顯高于其他組分[81],因此,分子質量相對較小的山藥多糖其抗氧化活性強。此外從同一種山藥中分離純化出的兩個多糖組分中,分子質量較大的其免疫活性相對較強[78]。
硫酸酯化修飾的原理是多糖大分子鏈上單糖分子中的羥基被硫酸基團取代,硫酸酯化對多糖的活性有提高作用[79]。如采用氯磺酸吡啶法對懷山藥堿溶性多糖(alkali polysaccharides ofDioscorea fordiiPrain et Burkill,DFPA)-I進行硫酸化修飾后,其清除超氧陰離子自由基的能力是DFPA-I的4 倍;采用濃硫酸法修飾后的山藥多糖同樣增大了對自由基的清除率[12,82]。
硫酸化修飾后的多糖SCYP可通過提高腸道中消化酶活力,促進SCYP的消化與吸收,修復環磷酰胺誘導小鼠體內的短鏈脂肪酸水平,高劑量的SCYP還可促進腸道有益菌乳酸桿菌、擬桿菌和阿克曼菌的產生,抑制變形菌與疣狀菌等有害菌的產生,改善腸道菌群的結構和組成,激活免疫活性[1]。此外取代度不同的硫酸酯化修飾對山藥多糖活性的影響也存在差異,Huang Lixin等[26]在研究山藥多糖中發現,硫酸化修飾后,山藥多糖的取代度為0.5,其免疫活性高于原山藥多糖CYP,Wang Xiaohua等[83]解釋了這一結論,由于取代度小于1的SCYP中三螺旋結構沒有被破壞,而取代度大于1的SCYP中三螺旋結構被破壞,因此取代度小于1的山藥多糖SCYP的免疫活性大于取代度大于1的SCYP或原CYP,這也說明硫酸化修飾處理后山藥多糖的生物活性與多糖中的三螺旋結構有密切關系。
糖鏈對多糖的活性起著重要作用。山藥多糖主鏈中的β-(1→3)-糖苷鍵與免疫調節作用有關,而支鏈末端連接的α-或β-連接的Manp殘基可啟動先天免疫,從而發揮免疫調節、抗炎、抗腫瘤等功效[84-85]。
李倩[16]分離純化出的3種山藥多糖組分(HSY-I、HSY-II、HSY-III)中,組分II和組分III都含有1→3類糖苷鍵,HSY-II具有一定的降糖作用,而HSY-III卻無降血糖的功效,說明僅具備1→3活性功能鍵的一級結構單元對其活性的影響不大,而多糖中的高級結構如雙螺旋、三螺旋結構對其活性具有重要影響,因此研究山藥多糖的高級結構對其活性具有重要意義[16]。
由于山藥多糖無毒性,單糖組成復雜、結構獨特且具有免疫調節、抗衰老、抗氧化、降血糖、降血脂等多種生物活性,使其在保健食品、化妝品和制藥等領域具有廣闊的應用前景。目前對山藥多糖中單糖組成及分子質量、一級結構的研究較多,而對高級結構的研究甚少,盡管山藥多糖在結構與生物活性及作用機制的研究中取得了一定的進展,但因多糖結構的復雜性、不規律性及分子質量的分散性,極大增加了山藥多糖高級結構鑒定的難度,使得山藥多糖分子結構與其生物活性之間的關系仍不明確。此外,因山藥多糖發揮其生物活性的作用機制是多途徑、多靶點、多效應的,目前雖已有大量文獻報道了山藥多糖的生物活性及作用機制,但報道的主要是抗氧化、免疫調節、降血糖的作用機制,其他活性機制還有待深入研究。
為了更加有效地開發利用山藥多糖,今后可在傳統技術的基礎上創新、完善分析方法,明確山藥多糖的高級結構,深入探究其與生物活性間的關系。對于化學修飾方面,可深入探究硫酸化修飾過程中,硫酸基團的取代位置、取代數量及與生物活性間的關系,同時在硫酸化修飾的基礎上衍生出其他化學修飾方法并探究其與硫酸化修飾的異同及對山藥多糖生物活性的影響。另外也可從分子結構及作用機制上尋找山藥多糖與其生物活性之間的作用規律,探究山藥多糖的新型活性,從而為開發相關功能產品提供理論基礎。