中醫藥干預治療椎間盤退行性變基因學研究進展

張立存 趙繼榮 徐兵 陳祁青 趙寧 馬同 張天龍 蔡毅 李瑋農 楊濤

(1甘肅中醫藥大學，甘肅 蘭州 700030 ；2甘肅省中醫院)

伴隨老齡化人口的不斷增加，人們生活質量的不斷提升，一些退變性疾患如脊柱、骨關節退變的防治成為臨床骨科研究的熱點〔1〕。椎間盤退行性變(IDD)是多種因素綜合影響的結果，其發病機制極其復雜，現有相關研究認為椎間盤組織脫水、細胞外基質降解、蛋白多糖含量下降、膠原類型轉變及纖維環外層破裂等為IDD發生發展的主要原因〔2〕。臨床上IDD是造成頸肩腰腿痛主要因素之一，有研究指出全球約80%的人一生經受腰腿痛折磨，嚴重影響患者的生活質量，給家庭和社會造成了極大的負擔〔3，4〕。早期觀點認為IDD是由于隨著年齡增大椎間盤衰老引發，然而近年來IDD的發病多呈現年輕化的趨勢〔5〕。因此，明確IDD的發病機制并尋求科學有效的治療手段是當前的主要研究方向?；诨蚨鄳B性研究基礎發現，大量IDD的椎間盤組織中存在著眾多基因的表達異常〔6〕。因此，IDD的發生發展可能與多種基因異常表達關系密切，且IDD的發生發展可能通過基因表達異常而誘導椎間盤細胞內信號通路和靶點發生特異性改變。中醫藥可直接或間接參與IDD的部分相關基因水平表達，抑制或激活相關基因表達從而達到延緩或加速IDD的發生發展。故從相關基因表達入手研究IDD的發病機制并利用中醫藥進行早期干預。

1 退變纖維環差異基因表達相關研究

纖維環是構成椎間盤的重要結構之一，在維持脊柱生物力學穩定、負重等方面具有重要作用。Gruber等〔7〕利用激光捕獲顯微切割術對椎間盤突出癥受試患者纖維環細胞進行了獲取并對相關基因表達做了研究，結果顯示有47個差異性表達基因，與正常組相比，有 13個上調基因，19個下調基因，變性過程中受到顯著調節的基因包括細胞衰老、缺氧等相關基因。其中生長停滯特異(GAS)1基因和賴氨酰氧化酶樣(LOXL)2基因兩種基因的表達上調最顯著。GAS-1是一種主要參與細胞融合和生長抑制過程的多效性膜蛋白，能夠誘導細胞增殖、停滯和凋亡，在年齡較大的小鼠骨骼肌干細胞中呈現高表達〔8，9〕。LOXL2是賴氨酰氧化酶(LOX)基因家族的成員，是一種能夠通過催化肽基賴氨酸氧化為氨基己二酸半醛來啟動膠原蛋白和彈性蛋白交聯反應的細胞外銅依賴性酶，在衰老退化的鼠膽管上皮細胞中呈現高表達〔10，11〕。由此表明GAS1和LOXL2可能是椎間盤纖維環細胞退變的特異表達基因。Kazezian等〔12〕分析人體退化纖維環細胞，發現238個差異表達基因中有17種表達顯著，其中10個上調基因，7個下調基因，差異表達基因涉及細胞增殖和炎癥應答相關基因，四肽重復蛋白(IFIT)3和胰島素樣生長因子結合蛋白(IGFBP)3是明顯上調的兩種基因。 IGFBP3和IFIT3可以促進細胞凋亡和抑制細胞增殖，參與炎性細胞因子干擾素α信號傳導途徑從而使得纖維環發生退化〔13〕。葉冬平等〔14〕通過逆轉錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR)技術檢測人正常和退變纖維環細胞相關基因表達，結果顯示退變纖維環細胞中轉化生長因子(TGF)-β、白細胞介素(IL)-1、血小板源性生長因子(PDGF)和IGF-1mRNA表達量降低，堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)、金屬蛋白酶組織抑制劑(TIMP)-1、骨形態發生蛋白(BMP)-14和膠原Ⅰ型(COL1)A1 mRNA表達升量高，表皮生長因子(EGF)mRNA在正常纖維環細胞表達陰性，而在退變纖維環細胞中有表達。上述研究表明纖維環退變涉及多種基因的參與，因此針對纖維環退變相關性基因逐個擊破，有的放矢，才能從根本上防止纖維環退變。

2 退變髓核差異基因表達相關研究

髓核組織處于椎間盤的中心位置，其細胞變性及活性下降是IDD發生的主要原因，髓核組織的退變往往是IDD的開端〔15〕。在相關動物模型試驗研究中，Hideki等〔16〕通過建立大鼠髓核細胞饑餓模型，檢測發現差異表達的基因高達2 922個，其中表達顯著的有影響細胞周期進程的生長阻滯和DNA損傷基因(Gadd)45和Tp53相關基因，p27Kip1，p21Cip1蛋白表達也有所上調。p27Kip1和p21Cip1屬于細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑(CKIs)家族成員，主要在養分受限的細胞中高表達，其上調可以妨礙細胞周期，使細胞DNA更容易受到損傷〔17〕。Minogue等〔18〕通過定量實時聚合酶鏈反應(qRT-PCR)在分離的牛髓核細胞上發現了許多差異表達基因單元并和正常人髓核細胞及退化的髓核細胞進行比較，發現11個基因〔突觸小體相關蛋白25 kD(SNAP-25)、細胞角蛋白(KRT)8、 KRT18、 KRT19、鈣黏著蛋白(CDH)-2、骨涎蛋白(IBSP)、多功能蛋白聚糖基因(VCAN)、腱調蛋白 (TNMD)、腦富含膜附著信號蛋白(BASP)1、叉頭框F1基因(FOXF1)、腓骨蛋白(FBLN)1〕在人正常髓核細胞中也存在差異表達，但不顯著，4個基因(SNAP25，KRT8，KRT18和CDH2)的表達在人退變髓核細胞顯著下調。盡管該實驗存在種間差異，但是這種基因表達特征將有益于組織工程研究。Shao等〔19〕使用qRT-PCR技術檢測鈣化髓核的差異表達基因，檢測結果發現了132個差異表達基因，其中上調基因129個，下調基因3個。顯著上調基因中前6個為硬化蛋白(SOST)，多聚IgA和IgM的連接鏈，防御素α4(DEFA4)，人分泌型卷曲蛋白(SFRP)4，蛋白酶(PRTN)3和組織蛋白酶(CTS)G，其中SOST和SFRP4的上調與Wnt信號通路的抑制相關。該研究證明了椎間盤鈣化可能與Wnt通路異常和炎癥相關因子高表達相關。Leung等〔20〕通過研究BMP在人體髓核細胞中的作用并比較BMP-7與BMP-2對髓核細胞表型和功能活性的影響，發現在退化的髓核細胞中BMP表達比非退化細胞中整體弱，相比于BMP-2、BMP-7可以誘發絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)和環磷腺苷效應元件結合蛋白(CREB)1使得退變髓核細胞中高表達的EP300基因發生變化，另外還可以抑制纖維化基因的表達進而延緩髓核退變。這一發現表明BMP在分子層面防治IDD意義重大。Wan等〔21〕采用基因芯片分析技術研究人髓核中長鏈非編碼RNA(lncRNA)的表達，結果發現116個差異表達lncRNA，其中上調67個，下調49個，該研究還發現參與細胞凋亡調控的Fas相關蛋白因子(FAF)1在退變的髓核組織中高表達。

3 退變軟骨終板差異基因表達相關研究

椎間盤作為人體最大無血管組織，其營養來源主要依靠上下軟骨終板擴散相鄰椎骨血管內物質，有研究發現封閉終板營養途徑會導致IDD的發生〔22〕。因此軟骨終板的退變會使椎間盤唯一的營養通道被阻斷同時代謝物質在椎間盤內積聚從而加速IDD的發生發展。低氧狀態是造成軟骨終板退變的重要因素，Yao等〔23〕在生理缺氧的微環境中培養并分析了人體軟骨終板間充質干細胞，發現448個差異表達基因，其中上調330個，下調118個，與正常氧組相比，低氧組IL-1受體相關激酶(IRAK)3和補體因子(CF)D顯著上調。相反，3個基因(轉鐵蛋白受體，磷酸甘油酸突變酶2和鈣蛋白酶6)的表達顯著低于正常氧組。表明缺氧狀態炎癥相關因子基因高表達是軟骨終板退變的主要原因。Xiao等〔24〕在人體退變的軟骨終板細胞中發現環狀RNA-0058097(circRNA-0058097)高表達，進一步研究其機制得出 circRNA-0058097是一種對機械張力敏感的非編碼RNA，其可以靶向miR365a5p來上調組蛋白脫乙?；?HDAC)4基因表達，從而促進終板軟骨細胞變性。HDAC4是組蛋白脫乙酰基酶家族的成員，它可以通過調節核小體的結構和抑制轉錄因子的活性來控制細胞增殖和分化，是軟骨細胞分化和變性的重要調節劑〔25〕。這項研究表明circRNA-0058097-miR365a5p-HDAC4調節途徑在機械張力誘導的終板軟骨細胞變性中起重要作用。Zhang等〔26〕證實了變性軟骨終板中細胞數量和蛋白聚糖減少，退變軟骨終板中基質金屬蛋白酶(MMP)-3、MMP-9、TIMP-3、IL-1α和IL-1β的mRNA表達顯著升高。軟骨終板的主要成分是Ⅱ型膠原和蛋白聚糖，有研究表明MMP的過表達會促使軟骨終板中Ⅱ型膠原和蛋白聚糖的降解，IL-1又可以刺激MMP表達〔27〕。由此可以認為MMP-3、MMP-9、TIMP-3、IL-1α和IL-1β可能在軟骨終板變性過程中發揮作用。此外，Marfia 等〔28〕發現在退變軟骨終板細胞中骨橋蛋白(OPN)的基因表達顯著增加(超過400倍)。OPN涉及骨基質鈣化和細胞外基質破壞，該研究證明了OPN的異常表達在IDD的病理生理過程中起關鍵作用。以上相關研究的結論及成果對明確軟骨終板退變差異表達基因意義重大，對揭示IDD的機制同樣具有重要的作用。

4 中醫藥干預對IDD相關基因表達的影響研究

整體審查和辨證論治是中醫藥治療退變性疾患最根本特征。中醫學認為IDD的發病主要以肝腎虧虛為內因，風寒濕痹為外因，氣滯血瘀為病理基礎，故治療指導思想以補益肝腎、祛風除濕、行氣活血為主〔29〕。Trinh等〔30〕認為中醫藥治療IDD疾患療效確切。中醫藥治療IDD疾患相關分子研究已取得了一定成就。

4.1中藥藥物對IDD相關基因表達的影響 防治IDD的中藥及復方大都以補肝腎，強筋骨類為主。董晤訊〔31〕研究發現，淫羊藿苷可以明顯降低髓核細胞中炎性因子IL-1β、IL-6的表達，同時上調細胞外基質Aggrecan和Ⅱ型膠原蛋白(CoL-Ⅱ)表達水平從而減輕IDD。杜仲為骨傷科常用藥，常用于脊柱疾患的治療。Yang等〔32〕研究發現杜仲可以改善人體椎間盤髓核細胞中IL-1和腫瘤壞死因子(TNF)誘導的細胞外基質降解。進一步研究其作用機制后發現杜仲通過調節miR140-CREB1軸改變MMP-3，血小板反應蛋白解整合素金屬肽酶(ADAMTS)5和CoL-Ⅱ的表達，IL-1和TNF刺激可抑制miR140的表達，而杜仲可激活miR140的表達同時抑制IL-1和TNF等炎性因子相關基因的表達，miR140的高表達使得MMP-3和ADAMTS5蛋白表達下調同時增加CoL-Ⅱ含量來保護髓核細胞。Zhou等〔33〕發現烏頭有效成分Karacoline可通過抑制NF-κB途徑降低IDD中MMP-14的表達，同時增加CoL-Ⅱ和蛋白聚糖的表達。何堅等〔34〕發現葛根素可以上調IL-1β誘導的椎間盤纖維環細胞中抗凋亡因子B細胞淋巴瘤(Bcl)-2，下調促凋亡因子半胱氨酸蛋白酶(caspase)-3蛋白的表達來抑制纖維環細胞的凋亡。川芎嗪可通過降低終板軟骨細胞中CoL-Ⅰ，堿性磷酸酶(ALP)，Runt相關轉錄因子(Runx)2和TGF-β1 mRNA的表達來減輕軟骨終板退變〔35〕。除了單味中藥，中藥復方對IDD療效亦佳，Zhu等〔36〕發現補腎活血方可以通過Wnt/β-catenin通路上調miR-483-3p和GSK3B的表達，抑制miR-23c和CTNNB1表達，從而調節退變椎間盤中髓核細胞增殖、細胞外基質重塑和調控終板軟骨細胞來延緩IDD。另外，白榮飛〔37〕的研究表明補腎壯督方可上調Bcl-2的表達，下調caspase-3的表達，從而延緩IDD。六味地黃丸治療IDD的相關分子研究中表明其能上調IDD模型中糖胺多糖含量、透明質酸含量、硫酸軟骨素/硫酸角質素比例，增加IDD模型中CoL-Ⅱ mRNA的表達，降低CoL-Ⅰ mRNA的表達，從而在一定程度上減緩IDD〔38〕。

4.2中醫非藥物療法對IDD相關基因表達的影響 除中草藥外，針灸、推拿按摩、針刀等均是中醫治療疾病的特色手段。楊宗保等〔39〕研究發現通過電針IDD模型兔環跳穴可降低其髓核細胞中炎性因子前列腺素(PG)E2、磷脂酶(PL)A2和IL-1α的表達。林元杰〔40〕通過針刺IDD大鼠模型腎俞、大腸俞、環跳、陽陵泉發現其可通過脊髓Janus激酶(JAK)2-信號傳導及轉錄激活因子(STAT)3信號通路下調p-JAK2、p-STAT3蛋白含量的表達來延緩IDD。佟思琪等〔41〕探討電針夾脊穴對IDD兔模型椎間盤組織中終板軟骨細胞水通道蛋白(AQP)1和3基因表達的影響發現其通過上調蛋白激酶(PK)A-環磷腺苷反應元件結合蛋白(CREB)通路的表達水平，繼而增加AQP1、3 mRNA的轉錄，促進椎間盤 AQP1、3 蛋白的表達來延緩IDD。王偉軍〔42〕通過手法按摩與MMPs抑制劑治療IDD進行了比對研究，結果表明中醫手法在抑制IDD相關基因Col-1a、MMP-3表達，增加椎間盤保護性基因Col-2a、TIMP-1的表達與MMPs抑制劑四環素作用相當，而中醫手法按摩在上調穩定細胞外基質延緩IDD相關基因Aggrecan、轉化生長因了(TGF)-β1、VDR的表達量較四環素更明顯。可見中醫按摩手法對調節IDD相關基因的表達延緩IDD的治療效果比四環素更顯著。此外，有研究表明痛點揉撥推拿手法可使IDD患者的IL-1β表達水平顯著降低達到抑制炎癥反應的作用〔43〕。Sun等〔44〕研究結果表明針刀治療通過調節細胞外基質的膠原蛋白含量，增加CoL-Ⅰ的產生和減少CoL-Ⅱ生成，同時改進椎間盤超微結構來抑制IDD。

綜上，中醫藥防治脊柱退變性疾患經過上千年的傳承與發展，在認識和治療脊柱退變性疾患方面有著豐富的理論基礎和實踐經驗，隨著中醫藥基礎研究、基因蛋白組學、基因芯片等現代科技的蓬勃發展，對IDD的發病機制研究從生物分子學、基因表達水平相關方面創造了新的研究平臺，也為中醫藥精準靶向防治IDD的研究提供了理論依據，支撐中醫藥防治IDD相關疾病不斷取得突破，造福廣大患者。但中醫藥治療IDD疾患的分子生物學研究大都局限于基礎實驗研究，具體試驗方法設計或多或少存在缺陷、調控過程和級聯方式仍未具體有效闡明、相關信號通路研究不夠深入。目前仍需要大樣本，多中心的隨機對照實驗提供更科學、更準確、更客觀的依據進行佐證。因此，借助現代科學技術深入研究中醫藥靶向治療IDD及相關疾患的相關研究將是今后努力方向之一。