基于Aβ生成、聚集機制研究中藥防治阿爾茨海默病的進展

于臻 王凱 徐家淳 孫偉明 張琳琳

(1天津市中醫藥研究院附屬醫院，天津 300120；2天津中醫藥大學；3天津中醫藥大學第二附屬醫院)

阿爾茨海默病(AD)是最常見的與年齡相關的神經退行性疾病，以進行性記憶減退為主要臨床癥狀，是癡呆的最常見類型〔1〕。AD病理上主要表現為β淀粉樣蛋白(Aβ)過度沉積形成老年斑、tau蛋白異常磷酸化形成神經元纖維纏結和進行性的神經元突觸缺失〔2〕，其中Aβ在腦內異常增多聚集產生神經毒性是AD的始動與中心環節〔3〕，并可增強tau病理變化〔4〕，誘導細胞凋亡、氧化應激、炎癥反應、葡萄糖及能量代謝障礙等一系列病理過程〔5〕，造成突觸功能障礙、神經元丟失導致AD認知障礙〔6〕，且這一病理改變在AD臨床癥狀出現前15～20年就已開始〔7〕。因此，減少Aβ生成和聚集，進而減輕Aβ的神經毒性作用是AD防治的重要方面。AD屬祖國醫學“癡呆”“健忘”等病癥范疇〔8〕，中醫藥方法多樣，具有多途徑、多靶點的獨特優勢，已得到越來越多的關注。針對AD至今尚無有效的防治手段，本文將Aβ生成、聚集機制及近年來中藥靶向于此的相關實驗研究進展進行綜述。

1 Aβ生成

Aβ來源于神經元中淀粉樣前體蛋白(APP)，由APP基因編碼產生，廣泛存在于全身組織細胞的一種跨膜蛋白，包括一段較長的細胞外N端和一段較短的細胞內C端，主要有2種代謝方式〔9〕：①非淀粉樣代謝途徑，新生的APP通過反式高爾基體網絡(TGN)進入細胞表面，首先經其上α-分泌酶剪切形成可溶性的N端片段(sAPPα)分泌到細胞外，sAPPα具有神經保護作用〔10〕；細胞內的C端片段(αCTF)經過γ-分泌酶分解成可溶性的短肽鏈和APP蛋白細胞片段。②淀粉樣代謝途徑：APP首先經β-分泌酶(BACE)1剪切形成可溶性的N端片段(sAPPβ)分泌到細胞外；細胞內C端片段(βCTF)經γ-分泌酶剪切后可生成大量含有36～43個氨基酸殘基的Aβ單體，分子量為4 kD左右，人體內約90%為含有40個氨基酸的Aβ40，其次是比Aβ40在C端多出2個氨基酸的Aβ42片段〔11〕。這2種代謝方式是相互競爭的〔12〕，因此增加α-分泌酶的表達可相應的減少APP進入淀粉樣代謝途徑生成Aβ。而γ-分泌酶由早老素(PS)1和2基因參與編碼產生，主要包括4個亞基，水解底物眾多，故抑制γ-分泌酶的藥物常因影響Notch等重要信號通路的正常生理功能而產生多種嚴重的不良反應〔13〕。BACE1在腦內神經元中高表達，研究顯示〔14〕，在散發型AD和AD源性輕度認知功能障礙(MCI)患者的大腦或腦脊液中BACE1的表達或活性明顯高于正常對照，所以常通過抑制BACE1的表達活性減少Aβ的生成〔15〕。

在淀粉樣代謝途徑中，APP經內吞作用進入胞質內，形成內體，在內體中被BACE1和γ-分泌酶連續切割產生Aβ單體，隨后可通過胞吐釋放到細胞外。其中Vps10p家族中分揀蛋白相關受體1(SorLA)作為APP的分選受體，可介導其與逆向轉運體Retromer復合物結合由內體逆向轉運至TGN中，并延長其在TGN內的停留時間〔9〕，使APP重新回到細胞膜上參與非淀粉樣代謝，以降低APP進入淀粉樣代謝途徑的概率〔16〕。同時SorLA還可直接引導新生成的Aβ進入溶酶體中降解〔17〕，從而減少Aβ的釋放和沉積。由上可見，Aβ的生成與APP及α、β、γ各分泌酶均密切相關，促進APP的逆轉運，抑制其被水解為Aβ單體，也是減少Aβ生成的關鍵環節。

2 Aβ聚集

APP剪切后形成的Aβ單體并不具有毒性〔18〕，Aβ聚集后方產生神經毒性。Aβ因其自身結構的原因，經過翻譯后修飾很容易自聚集形成寡聚體、原纖維至成熟穩定的纖維聚集體，使Aβ的結構由α螺旋向β折疊轉換，并最終在神經元外沉積形成老年斑(SPs)〔19〕。Aβ蛋白主要分為親水性較強的N端區域和疏水性較強的C端區域兩部分，是一種典型的兩親性多肽，其中C端中的序列Lys16-Phe20是聚集的核心區域，也是聚集體中β-sheet結構的主要組成部分〔20〕，而N端基本不參與該結構的形成〔21〕，Aβ42因在C端多出幾個氨基酸使其更易于聚集，不僅聚集的速度更快，其聚集體的毒性也更強〔22〕。翻譯剪切后的Aβ蛋白，在特定條件下會進行翻譯后修飾，對Aβ的錯誤聚集產生一定影響，如磷酸化和焦谷氨酸化修飾都會增強Aβ聚集成寡聚體和纖維體〔23〕，并與AD的病程發展具有一定的相關性〔24〕，或可成為AD發病過程中不同時期的診斷標志物〔25〕。

Aβ的聚集過程非常復雜，受多種因素影響〔26〕，聚集動力學上將這個過程常描述為一個典型的S形曲線，認為Aβ呈“成核生長”機制，Aβ單體先經過一定的構象轉化聚集形成寡聚體、原纖維，并逐漸形成“聚集核”，此時為延滯期；當聚集達到一定程度后進入伸長期，在“聚集核”的催化下，快速聚集生長，形成成熟的纖維聚集體，達到穩定平臺期。其中，可溶性的Aβ寡聚體神經毒性最強〔27〕，因其與細胞膜有很強的相互作用，并能和多種受體結合，比SPs沉積更與認知能力變化具有相關性，被認為是造成AD病理的可能“元兇”〔28〕，包括二聚體、三聚體、Aβ56(56 kD)、Aβ來源可溶性配體(35～60 kD)、球聚體(38～48 kD)及環狀原纖維 (APFs)〔29〕。

3 中藥對AD中Aβ生成和聚集的調控作用

3.1減少Aβ生成 針對上述Aβ生成過程中的各關鍵靶點，中藥復方益腎化濁方在快速老化小鼠(SAMP8)和AD模型大鼠上進行干預，發現其可通過下調APP、PS1基因的表達〔30〕，上調α-分泌酶和sAPPα的表達水平〔31〕，進而減少海馬區Aβ含量〔32〕，保護海馬神經元和突觸，從而在行為學上顯著改善模型鼠的學習記憶能力〔33〕。古代名方地黃引子〔34〕正符合AD腎精虧虛為本痰瘀阻竅為標的病機特點，故可用于AD的防治中，其對于Aβ生成也具有一定的干預作用，采用免疫組化法探索其作用機制發現該復方通過顯著下調β-APP和BACE1，減少淀粉樣代謝途徑，實現顯著降低AD模型大鼠腦內Aβ的表達水平。湖北中醫藥大學團隊〔35〕依據AD本虛標實的特點，由“五補丸”(《太平惠民和劑局方》)化裁創制固本健腦液，用黨參、枸杞子分別顧護先后天之本，酸棗仁、茯苓合山楂以奏健腦之效，從APP加工及轉運過程探討其對Aβ生成的影響，發現該方可通過上調AD模型大鼠SorLA mRNA和蛋白及逆轉運復合體的表達，降低海馬中Aβ42的水平，進而改善AD模型的學習記憶能力。養血清腦方〔36〕由黃連解毒湯加減化裁而來，內含黃連、黃芩、黃柏、丹參、延胡索、鉤藤6種中草藥，可通過降低3XTg-AD 和5XFAD兩種轉基因小鼠的APP及其C端片段的表達，降低Aβ的生成及負荷，顯著改善兩種小鼠的記憶和認知功能。北京宣武醫院團隊運用慢性腦低灌注的體內外模型研究遠志湯及其有效成分遠志皂苷元和β-細辛腦〔37〕治療老年人認知功能障礙的具體機制，發現該方及活性成分在體外可通過降低APP分泌酶BACE1和PS1的表達水平，降低Aβ40和Aβ42的含量，提高神經元的存活率，進而降低體內大鼠模型中Aβ的聚集。

中藥單體也可減少細胞和動物模型中Aβ的生成，如石菖蒲的主要成分之一β-細辛腦〔38〕在PC12細胞AD模型中可通過降低APP、PS1、BACE1蛋白的表達水平，抑制體外Aβ的表達；補腎中藥女貞子的有效成分齊墩果酸〔39〕可顯著下調SAMP8小鼠海馬組織中APP、PS1基因的表達水平，抑制Aβ的形成，保護神經元形態；β-谷甾醇〔40〕具有神經保護作用，可通過降低APP/PS1雙轉基因小鼠腦中BACE1的表達減少Aβ生成，改善小鼠空間學習和識別記憶障礙，提示其可能在一定程度上預防AD；用酶聯免疫吸附試驗(ELISA)和Western印跡直接檢測羌活中的提取物羌活呋喃考馬林〔41〕干預HEK-APPswe293T細胞后Aβ的水平，發現其呈劑量依賴性抑制Aβ的分泌和產生，體內實驗也顯示其能顯著降低APP/PS1小鼠海馬和皮層中Aβ的含量，改善AD模型的認知功能；同樣，傳統天然化合物枸杞多糖〔42〕也可降低APP/PS1轉基因小鼠Aβ的水平，體外實驗采用神經元細胞SK-N-SH和AD細胞模型HEK293/APPswe中進行驗證，結果一致，提示其可顯著減少Aβ的生成，且不影響細胞活力；丹參酮ⅡA磺酸鈉〔43〕干預Aβ誘導的SH-SY5Y細胞，ELISA和Western印跡檢測結果顯示其可降低Aβ水平，ELISA和反轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)提示其可能通過提高α分泌酶活性及降低BACE1活性調控Aβ的產生，從而減輕Aβ對細胞的損傷，發揮神經保護作用。

3.2抑制Aβ聚集 中藥復方養血清腦方〔44〕從Aβ自聚集及其介導的細胞毒性角度進行了系統研究，采用生物化學、生物物理和基于細胞的方法發現，該方明顯減少了Aβ42的纖維形成，并改變其β-sheet構象，表明其可抑制淀粉樣蛋白的一級成核作用，在Aβ損傷的SH-SY5Y細胞模型中，大劑量的養血清腦方可減弱約60%的Aβ誘導的細胞毒性，同時有效改善細胞畸形，從而通過Aβ42的毒性聚集發揮神經保護作用，顯示出防治AD的潛力。韓國研究由薏苡仁、龍眼、桔梗、菖蒲、酸棗仁、五味子、遠志等14味中草藥共64 g組成的調胃升清湯復方〔45〕，通過體外硫黃素(Th)T實驗和體內5XFAD小鼠模型4G8、ThS組織化學分析均表明該復方具有顯著抗Aβ聚集的作用，補中益氣湯體內研究也顯示其可增強抑制Aβ聚集〔46〕。

但目前更多的是發現很多中藥小分子可抑制Aβ聚集所引起的神經細胞毒性，并據此進行藥物的設計合成與開發研制，其中以姜黃素〔47〕、白藜蘆醇〔48〕、阿魏酸〔49〕等為代表的化學小分子抑制劑，主要針對Aβ自聚集過程中的特征結構β-片層的形成，從而有效調節其聚集。此外，還有以天然產物表兒茶素(EGCG)〔50〕和蘇木中主要活性成分巴西木素〔51〕等為代表的化合物，可通過有效打散Aβ聚集體的方式緩解其聚集造成的神經毒性。采用ThT進行熒光光譜分析及原子力顯微鏡觀察金銀花中提取純化的果膠多糖LFA03-a發現〔52〕，LFA03-a呈劑量依賴性抑制Aβ42的聚集并抑制其寡聚體和纖維的形成，同時LFA03-a可輕度誘導分化PC12細胞，促進神經纖維的生成，提示果膠LFA03-a可能是防治AD的一潛在靶向藥物。另一些研究也利用體外ThT實驗進行觀察，如山楂的乙醇提取物〔53〕對Aβ聚集的影響發現，該提取物對Aβ纖維的形成呈濃度依賴性，并能引發纖維的分解，阻斷Aβ誘導的神經元死亡；酸棗仁中主要活性成分黃酮類化合物斯皮諾素〔54〕不僅可抑制Aβ1-42的聚集，體外細胞實驗也顯示其可通過影響APP過程減少Aβ1-42的產生。燈盞生脈膠囊主要活性成分黃芩苷〔55〕體內干預APP/PS1小鼠發現其緩解該AD小鼠認知功能障礙的作用與黃芩苷上調其皮層低毒性的淀粉樣斑塊、下調高毒性的Aβ42和Aβ40水平有關，體外通過生化分析證實其可加速Aβ42單體轉化為高分子量聚集體，并通過微量熱泳法測定其與Aβ單體的結合，利用計算對接模型預測了其與Aβ纖維的結合區域，提示其在AD防治中具有潛在臨床應用價值。

綜上，中藥減少Aβ生成機制的體內外實驗多圍繞調控APP及其代謝過程中的3個分泌酶的相關表達進行，并采用ELISA、Western印跡、RT-PCR、免疫組化、免疫熒光等方法予以檢測，以期從根源上降低Aβ產生、預防AD；而中藥抑制Aβ聚集的研究較復雜，多是在體外進行觀測，因涉及蛋白構象等轉變，常采用ThT動力學、圓二色譜、原子力顯微鏡或透射電鏡、固態核磁等技術手段進行，且多以中藥單體研究為主，關注環節相對單一。Aβ的生成和聚集所致神經毒性并不是孤立存在，兩者呈鏈式級聯反應緊密相連，而中藥的多靶點特性常使其作用于多個環節發揮效力。因此，研究中藥復方在Aβ生成與聚集過程中的調控作用，對于闡釋中藥復方作用機制及防治AD均具有重要意義。