中西藥聯合應用對銅綠假單胞菌抗菌作用的研究進展①

(桂林醫學院第二附屬醫院中心實驗室，廣西 桂林 541199)

銅綠假單胞菌是一種常見的院內感染條件致病菌。近年來，由于抗生素的不規范使用等原因，造成銅綠假單胞菌的耐藥現象越來越嚴重，多重耐藥和泛耐藥菌株的不斷出現，給臨床治療工作帶來了極大的困難。

我國中草藥資源豐富，使用歷史悠久，具有相對可靠的使用安全性。由于清熱解毒類中草藥成分特殊、復雜，抗菌作用和機制原理不單一，所以很少發現其耐藥性，但存在抑菌作用有限、抑菌效果不穩定、抑菌機制不清楚等問題。中西藥的使用各有優缺點，而中西藥物合用則可以優勢互補，所以中草藥和抗生素的聯合應用具有廣闊的研究空間和開發前景。

1 銅綠假單胞菌的耐藥機制

1.1 基因突變改變通道蛋白和外膜通透性

Pa菌株細胞膜上的通道蛋白相對較少，孔徑狹窄，通透性差，多數抗菌物質難以進入菌體，使其天然對多種抗生素耐藥。oprD2 是細胞膜上容許亞胺培南通過的通道蛋白。oprD2 編碼基因的缺失突變，改變通道蛋白結構，使 Pa 對亞胺培南耐藥[1]。

1.2 菌株酶類改變抗生素活性結構

耐藥Pa菌株能通過編碼多種水解酶類和修飾性酶類而破壞或修改抗生素的活性結構，從而實現耐藥。相關酶類的編碼基因可由 Pa基因組攜帶，也可通過質粒或整合子獲得。耐藥 Pa 菌株通過編碼多種β-內酰胺酶基因而對多種β-內酰胺類抗生素耐藥，當前被編碼的β-內酰胺酶類基因主要有以下幾種。①頭孢菌素酶(AmpC)基因：位于所有的 Pa 菌株染色體上，低水平表達，在β-內酰胺類抗生素的誘導下，表達水平激增[2]；其他多種類型的 AmpC 酶也可由質粒編碼，實現對大多數β-內酰胺類抗生素的天然耐藥[3]。②超廣譜β-內酰胺酶(extend-spectrum β-lactamases， ESBLs)基因：部分耐藥Pa 菌株可由基因組編碼，也可由質粒編碼，水解青霉素類、窄譜和超廣譜頭孢菌素[4]。③金屬β-內酰胺酶基因(metallo-β-lactamases， MBL)：MBL依賴金屬離子發揮活性，編碼基因可由耐藥菌株染色體攜帶，也可由質粒、轉座子和整合子攜帶，可對碳青霉烯類抗生素、大部分β-內酰胺類抗生素和β-內酰胺酶抑制劑類抗生素耐藥。MBL 類型多樣，是多重耐藥耐藥 Pa 菌株出現的原因之一[5-6]。耐藥Pa菌株編碼的修飾性酶類主要是氨基糖苷類修飾酶，耐藥Pa菌株通過編碼氨基糖苷乙酰轉移酶(aminoglycoside acetyltransferase， AAC)、氨基糖苷磷酸轉移酶(aminoglycoside phosphate transferase， APH)和氨基糖苷核苷轉移酶(aminoglycoside nucleoside transferase， ANT)對進入菌內的氨基糖苷類抗生素進行修飾，使其失活。AME(aminoglycoside modifying enzymes， AME)編碼基因廣泛存在于質粒、轉座子和整合子都元件中，可在細菌種內和種間傳播[7]。

1.3 基因突變或編碼酶類改變藥物作用靶位

細菌細胞膜上的青霉素結合蛋白(penicillin binding protein， PBPs)參與細胞壁肽聚糖的合成，也是β-內酰胺類抗生素的作用靶位。β-內酰胺類抗生素與 PBP 結合，使細胞壁合成受阻，進而使細菌死亡。Pa菌株的 PBP 基因發生基因突變，改變 PBP 蛋白結構，降低或消除其與β-內酰胺類抗生素的親和力，使其對該類抗生素耐藥。拓撲異構酶的相關基因突變也可以改變拓撲異構酶結構，使 Pa 菌株對喹諾酮類抗生素耐藥[8-9]。

1.4 過度表達外排泵相關基因

外排泵是位于Pa菌株細胞膜上的質子泵，能夠選擇性地把進入菌體內部的抗生素排出。一個外排泵一般由3種蛋白質組成。①膜外通道蛋白：形成通道門，用于排出藥物。②通道蛋白：連接膜內、外蛋白，形成通道。③膜內蛋白：識別藥物，并把它轉運出菌體。這3種蛋白質共同作用發揮外排作用。目前已經發現 13 種外排系統，不同的外排的外排泵系統，識別和外排的抗生素底物有一定的特異性[10-12]。

1.5 形成生物被膜

生物被膜(biofilm)是細菌及其分泌的胞外多糖和胞外蛋白組成的混合物，使其覆蓋在物體或機體腔道表面，形成膜狀結構。生物膜是細菌耐藥的機制復雜。生物膜里的藻酸鹽多糖能夠抵御抗菌藥物的滲透，使抗菌藥物難以接觸菌體。生物膜含有的多種酶類也能夠使多種抗生素失活，使 Pa菌株對相應抗生素耐藥[13]。

1.6 整合子

整合子是一種類似于質粒、轉座子的可移動遺傳單位。在Pa菌株耐藥基因的獲得和轉移中發揮重要作用。同質粒不同，整合子能通過攜帶的位點特異性重組系統，使整合酶從周圍環境中捕獲耐藥基因盒，并把它們組裝在一起，形成巨大的耐藥基因多基因座，使細菌具有多重耐藥性，并在細菌種內和種間傳播、擴散[14]。

2 中草藥對銅綠假單胞菌的抑制作用

抗生素大量使用之前，中草藥資源，特別是清熱解毒類中草藥在抗感染治療中曾發揮重要作用。耐藥菌大量出現，抗生素不斷面臨新挑戰，提醒科研人員使用現代科學方法篩選、 驗證傳統藥用植物的抗菌效果，嘗試尋找新型抗生素。臨床感染中，革蘭陽性的金黃色葡萄球菌和革蘭陰性的大腸埃希菌最為常見，銅綠假單胞菌耐藥現象普遍。在藥用植物抑菌作用的篩選和驗證中，它們是最常用的實驗對象。

綜合前人研究[15-22]，在傳統藥用植物中，至少在黃連、黃芩、黃柏、夏枯草、連翹、金銀花、大黃、苦參、虎杖和薄荷等 50 多種中藥中發現對銅綠假單胞菌的抑菌作用。雖然很多中草藥對銅綠假單胞菌有抑菌作用，但中草藥對銅綠假單胞菌的抑制作用還存在很多缺陷，主要表現在以下兩個方面。

(1)中草藥成分復雜，抗菌機制不單一。研究中，一種藥材抑菌作用的有無對研究人員的實驗方法和使用菌株有明顯的依賴性。①實驗方法依賴性：藥材有效成分的萃取，通常有水煎法和醇提法，研究中出現水煎法提取物有效、醇提法提取物有效、水煎法和醇提法的提取物均有效、兩種方法的提取物均無效等4 種情況。乙醇提取法中，不同的乙醇濃度也會影響提取物的有效性，K-B法或和稀釋法的實驗結果會出現不一致。②實驗菌株的依賴性：在不同的研究中，當實驗菌株較少時，同種藥材用同種方法萃取有效成分，在不同的實驗中，有效性截然不同。當實驗菌株數量較多時，抑菌效果從完全無效到效果明顯，效果跨度很大。以上現象都顯示對不同的實驗菌株，某一藥材的具體有效成分和作用靶點及作用機制可能不盡相同，這可能是造成抑菌效果不穩定，抑菌機制不清楚的原因。

(2)中草藥有效成分含量低，血藥濃度難以達到。同現有抗生素相比，有效成分的有效性往往偏低，這造成抑菌效果相對有限。根據有效抑菌濃度，結合人體體液含量和提取方法濃縮比例，推算達到有效血藥濃度時，所需的中藥原藥量往往較大，在臨床上難以實現[15]。

3 中藥和抗生素的聯合應用對銅綠假單胞菌的抗菌作用

銅綠假單胞菌的耐藥現象愈發嚴重以及中草藥抗菌效果相對有限等問題促使人們考慮二者的聯合使用，以達到優勢互補作用。徐海瑛等[23]發現雙黃連口服液聯用慶大霉素對金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌藥敏結果均呈相加作用；王淋荊等[24]的研究發現黃芩、金銀花和夏枯草可以通過促進外排泵基因表達而使環丙沙星對銅綠假單胞菌有拮抗作用，穿心蓮和五倍子也能促使慶大霉素對銅綠假單胞菌表現出拮抗作用；胡芳等[25]將雙黃連粉針與青霉素等多種抗生素聯用作用于非耐藥菌，使雙黃連對細菌的MIC 下降了。抗生素的 MIC 下降，說明中西藥聯合應用對銅綠假單胞菌有明顯的協同抑菌作用。

由于細菌基因型和中藥成分的多樣性，使得中草藥和抗生素的聯合應用效果在不同的細菌感染中，甚至在同種細菌不同菌株的感染中呈現的相互作用類型也不一致。中草藥和抗生素的聯用機制尚需很多更深層次的研究，而尋找能對細菌共有靶點起拮抗作用的有效成分非常必要，是保證中草藥抑菌效果穩定性的基礎。

中藥和抗生素的協同抑菌作用，以及耐藥菌株經中藥處理后能恢復對相應抗生素的敏感性，表明中藥在某種程度上具有逆轉耐藥菌抗性的能力。其逆轉細菌耐藥性機制有以下幾點。①消除耐藥質粒：耐藥質粒通常攜帶多種耐藥基因，賦予了細菌多重耐藥性，可以在細菌種內和種間穿梭，也可以被物理方法、化學試劑生物學手段從細菌內部清除。據研究，黃連、白花丹、白頭翁、黃芩、金銀花、大黃、馬齒莧、車前子、黃白等都有不同程度的質粒消除作用[26-27]。②抑制耐藥相關基因表達：蔣文捷等研究證明，黃芩提取物可以降低 16SrRNA 甲基化酶 mRNA 轉錄，提高耐藥菌對抗菌藥物的敏感性[28]；穿心蓮內酯對 PA 外排泵 MexAB-OprM 轉錄表達具有抑制作用， 可扭轉 PA 的部分耐藥性[29]。③降低耐藥相關酶活性：高潔等研究發現芪歸銀方能減慢β-內酰胺酶水解速率，提示芪歸銀方可能是通過抑制銅綠假單胞菌的β-內酰胺酶的水解活性實現逆轉其對亞胺培南的耐藥性，雙黃連注射液在體外對β-內酰胺酶存在抑制作用[30]。這顯示中草藥可能通過抑制相關酶活性在一定程度非徹底地實現耐藥性逆轉。④抑制生物膜合成：董必英等發現黃芩苷能破壞銅綠假單胞菌已形成的生物膜，與頭孢哌酮-舒巴坦鈉聯用時能顯著増強其對銅綠假單胞菌生物被膜的殺菌作用[31]。

4 結語

由于抗生素的濫用，使得細菌的耐藥現象越來越嚴重，特別是耐碳青霉烯銅綠假單胞菌的耐藥性現已成為臨床上亟需解決的難題，它常導致臨床治療困難。當前中草藥的藥用價值是亟待深入研究和開發的寶貴資源。不少種類的中草藥，特別是清熱解毒類中藥在臨床具有明顯的抗炎和清熱解毒效果，應列為優先研究和開發對象。 黃芩、雙黃連不但對銅綠假單胞菌有抑菌作用，對金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌都有一定的抑菌作用。黃芩、雙黃連與頭孢哌酮-舒巴坦鈉聯用對銅綠假單胞菌的抑菌效果目前尚未見報道，本研究擬將黃芩、雙黃連與頭孢哌酮-舒巴坦鈉等藥物聯用將為臨床治療耐藥菌和開發新的抗耐藥菌藥物提供實驗參考，同時為臨床治療銅綠假單胞菌引起的感染提供實驗證據，具有一定的理論指導意義和臨床應用價值。