動脈瘤性蛛網膜下腔出血患者血清Cav-1、FoxO3a mRNA表達水平及與預后的關系

李長寶，宋保新，沈俊巖，張云鵬

動脈瘤性蛛網膜下腔出血(aneurysmal subarachnoid hemorrhage，aSAH)是指因動脈瘤造成的腦部血管破裂，使血液進入蛛網膜下腔而引起的臨床綜合征，其病死率高達40%～50%[1-2]。因此尋找能準確評估患者預后效果的敏感生物標志物，對合理制定治療方案及改善預后意義重大。小窩蛋白(caveolave)是細胞質膜上直徑為50～100 nm的瓶型內陷結構，小窩蛋白-1(caveolin-1，Cav-1)是caveolave家族中主要功能蛋白，主要發揮細胞信號轉導、胞吞、細胞內脂質代謝等重要過程[3]。有研究表明，Cav-1在惡性腫瘤和炎性疾病中異常表達[4-5]。叉頭框蛋白O3a(forkhead box O3a，FoxO3a)是FOX基因亞家族的重要組成之一，其在調控細胞增殖、凋亡、氧化應激、自噬等生理進程中發揮著重要作用[6]。有研究證實，抑制FoxO3a磷酸化在一定程度上可改善帕金森模型大鼠的學習記憶能力[7]。目前Cav-1、FoxO3a主要集中在動物實驗上，臨床中探究二者與aSAH患者的研究鮮少，因此，本研究探討aSAH患者血清Cav-1、FoxO3a mRNA表達水平及與預后的關系，旨在為aSAH的診治提供新思路，報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2018年11月—2021年12月首都醫科大學附屬北京友誼醫院平谷醫院收治的aSAH患者128例為aSAH組，男74例，女54例，年齡28～75(56.39±6.58)歲；體質量指數(BMI)為19.04～28.61(24.13±3.42)kg/m2。另選取同期醫院健康體檢者95例為健康對照組，男54例，女41例，年齡26～75(55.47±6.46)歲；BMI為18.81～28.52(24.02±3.37)kg/m2。2組受試者性別、年齡、BMI等臨床資料比較差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。本研究經醫院倫理委員會批準(LLSP2018第97號)，受試者及家屬知情同意并簽署知情同意書。

1.2 病例選擇標準 (1)納入標準：① aSAH患者均符合“中國蛛網膜下腔出血診治指南2019”中的診斷標準[8]；②aSAH首次發病住院；③從發病至住院時間不超過48 h；④發病前腦部無外傷。(2)排除標準：①入院24 h內死亡；②患有傳染性疾病者；③合并心、肝、腎重要器官疾病及惡性腫瘤者；④臨床資料不完整及不積極配合治療者。

1.3 觀測指標與方法

1.3.1 血清Cav-1水平檢測：采集aSAH患者入院24 h內、體檢健康者體檢當日空腹靜脈血6 ml，離心留取上清液于EP管中，保存于-80℃備用。采用酶聯免疫吸附(ELISA)法檢測血清Cav-1水平，嚴格按照人Cav-1 ELISA試劑盒(武漢菲恩生物科技有限公司)說明書進行操作。

1.3.2 血清FoxO3a mRNA表達水平檢測：上述血清樣品中加入Trizol試劑(武漢菲恩生物科技有限公司)進行總RNA提取，采用RNA逆轉錄試劑盒(北京達科為生物技術有限公司)將RNA反轉錄為cDNA，進一步行qRT-PCR試驗，嚴格按照2xSYBR Green PCR Master Mix試劑盒(北京達科為生物技術有限公司)說明書進行操作，FoxO3a mRNA的內參為GAPDH。FoxO3a mRNA引物序列：上游引物5′-AAGCCAGCTACCTTCTCTTCCA-3′，下游引物5′-GTGGCTAAGTGAGTCCGAAGTGA-3′；GAPDH：上游引物5′-ATTTGGTCGTATTGGGCGCCTGGTCACC-3′，下游引物5′-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3′，引物由武漢菲恩生物科技有限公司合成。反應條件為：95 ℃預變性30 s、95℃ 5 s、60℃ 35 s，共計40個循環。FoxO3a mRNA的相對表達水平采用2-△△CT法計算。

1.3.3 術后隨訪：對aSAH患者出院后行電話、微信或門診的方式進行隨訪6個月，隨訪截止日期2022年6月30日。采用格拉斯哥預后評分(GOS)評估患者預后情況[9]，其標準為：患者死亡為1分，植物人狀態為2分，重度殘疾但有清楚的意識為3分，略微殘疾但可以正常生活為4分，恢復正常生活為5分。GOS評分≤3分納入預后不良亞組(n=41)，GOS評分>3分則納入預后良好亞組(n=87)。

2 結 果

2.1 2組血清Cav-1、FoxO3a mRNA表達水平比較 與健康對照組比較，aSAH組患者血清Cav-1表達水平顯著降低，FoxO3a mRNA表達水平顯著升高(P<0.01)，見表1。

表1 健康對照組與aSAH組血清Cav-1、FoxO3a mRNA表達水平比較

2.2 不同預后亞組血清Cav-1、FoxO3a mRNA表達水平比較 預后不良亞組患者血清Cav-1水平低于預后良好亞組，FoxO3a mRNA表達水平高于預后良好亞組(P<0.01)，見表2。

表2 不同預后aSAH患者血清Cav-1、FoxO3a mRNA表達水平比較

2.3 不同預后aSAH患者的臨床資料比較 預后不良亞組患者高血壓史、糖尿病史、改良Fisher分級Ⅲ～Ⅳ級、Hung-Hess分級Ⅲ～Ⅳ級、WFNS分級Ⅳ～Ⅴ級、動脈瘤直徑>10 mm比例均高于預后良好亞組(P<0.05)，2組其余資料比較差異無統計學意義(P>0.05)，見表3。

表3 預后良好亞組和預后不良亞組aSAH患者的臨床資料比較

2.4 多因素Logistic回歸分析影響aSAH患者預后的危險因素 以上述結果中有統計學意義的量(高血壓史、糖尿病史、改良Fisher分級、Hung-Hess分級、WFNS分級、動脈瘤直徑、Cav-1、FoxO3a mRNA)為自變量，以aSAH患者是否發生預后不良為因變量，進行多因素Logistic回歸分析，結果顯示，改良Fisher分級高、Hung-Hess分級高、血清FoxO3a mRNA水平高是aSAH患者預后不良的危險因素，血清Cav-1水平高是其保護因素(P<0.01)，見表4。

表4 多因素Logistic回歸分析影響aSAH患者預后的危險因素

2.5 血清Cav-1、FoxO3a mRNA評估aSAH患者預后的價值 繪制ROC曲線結果顯示，血清Cav-1、FoxO3a mRNA及二者聯合評估aSAH患者預后的AUC分別為0.855、0.832、0.902，二者聯合評估aSAH患者預后的效能高于單項預測(Z/P=2.121/0.034、2.623/0.009)，見表5、圖1。

圖1 血清Cav-1、FoxO3a mRNA對aSAH患者預后評估的ROC曲線

表5 血清Cav-1、FoxO3a mRNA對aSAH患者的預后評估價值

3 討 論

aSAH是嚴重危及生命安全的腦卒中類型，其發病率占腦血管疾病的12%～20%，具有極高的致死率，高達10%～25%的患者在入院前死亡[10]。血管介入和開顱夾閉是臨床上目前使用最多的手術方式，雖然醫療技術有所提高，但患者的預后情況仍不容樂觀[11-12]。目前，改良Fisher分級、Hung-Hess分級是aSAH患者預后的主要評估指標，但該方法存在一定的主觀弊端。因此，尋找敏銳有效的aSAH預后評估指標是當下研究的熱點。目前，aSAH的復雜機制尚未明晰，但有研究認為血腦屏障通透性增加、炎性反應、細胞凋亡和自噬是促進aSAH發生發展和預后不良的重要原因[13-15]。

caveolave家族有Cav-1、Cav-2、Cav-3 3種蛋白亞型，Cav-1是其中主要的蛋白成分，其基因位于第7號染色體的D7S522基因座上，在腦組織內主要于神經內皮細胞、神經膠質細胞及神經元上表達，具有調節神經炎性反應、氧化應激、血腦屏障完整性、自由基形成等功能，促進神經元突觸再生及髓鞘修復等功能[16]。Cav-1水平低的急性缺血性腦卒中患者較Cav-1水平高的患者發生腦微出血的風險升高了3倍[17]。已有研究證實，Cav-1在急性腦梗死、動脈粥樣硬化等血管疾病中扮演重要角色[18-19]。本研究發現，aSAH患者血清Cav-1表達水平較健康人降低，說明Cav-1參與aSAH病理過程。動物實驗證實，在大鼠模型前腦室內注射微小RNA-103-3p(miR-103-3p)抑制劑可增加Cav-1水平，血腦屏障通透性隨之降低且神經功能也有所改善[20]。張高嬌等[21]通過研究小鼠腦缺血再灌注損傷模型發現，Cav-1 siRNA使小鼠腦組織中Cav-1蛋白表達下降，可以明顯逆轉人參皂苷Rb1的腦保護作用，說明Cav-1蛋白介導了人參皂苷Rb1對腦缺血再灌注損傷小鼠的腦保護作用。本結果顯示，aSAH預后不良患者血清Cav-1表達水平低于預后良好患者，Cav-1水平高是aSAH患者預后的保護因素，說明Cav-1可能通過調控血管內皮細胞鈣黏蛋白、抑制活性氮類釋放及基質金屬蛋白酶活性，使密封蛋白-5重新分布，減少有害物質對血管內皮細胞的損傷，上調Cav-1水平，有助于維持血管內皮細胞間緊密連接完整性，減少血管內皮通透性，從而使血腦屏障破壞減輕，aSAH患者預后情況也相應較好[22]。

FoxO3a是叉頭框轉錄因子家族的FoxO蛋白成員，廣泛分布于人體，其可被磷酸化、乙酰化和泛素化，在調控基因表達和細胞生物學過程中發揮重要作用，包括抑制細胞增殖、促進細胞凋亡，在細胞自噬中也起著重要作用[23]。過度自噬和細胞凋亡可能是腦出血疾病的發展機制。FoxO3a對自噬基因微管相關蛋白1輕鏈3(LC3)、自噬相關蛋白12(Atg12)等存在調控作用，其在自噬激活中有重要作用。以往研究證實，FoxO3a高表達與腦出血發病有關，在腦出血動物模型中FoxO3a表達明顯上升，通過靶向抑制FoxO3a能夠對腦出血的神經功能起保護作用[24-25]。本研究發現，aSAH患者血清FoxO3a mRNA表達水平較健康人升高，且預后不良患者血清FoxO3a mRNA表達水平較預后良好患者升高，提示FoxO3a mRNA在aSAH的發生和患者術后恢復過程中發揮重要作用。FoxO3a mRNA在aSAH疾病中的可能機制為激活細胞自噬和促進細胞凋亡，從而加劇神經損傷。另有研究發現，抑制過氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPARγ)/沉默信息調節因子6(SIRT6)/FoxO3a途徑的激活可改善SAH大鼠的神經功能[26]。陸飛宇等[27]研究顯示，通過在腦出血模型大鼠側腦室注射miR-132模擬物后，大鼠神經功能有所改善，FoxO3a表達減少，且表明miR-132在腦出血模型大鼠中的保護機制可能是通過靶向FoxO3a并抑制自噬發生。本研究進一步分析發現，血清FoxO3a mRNA水平高是aSAH患者預后不良的危險因素，推測FoxO3a的表達增加，導致多種自噬基因表達增加，加重細胞自噬，從而加重神經損傷。本研究ROC曲線結果顯示，血清Cav-1、FoxO3a mRNA聯合預測aSAH患者預后的AUC為0.902，優于單一指標預測效能，說明監測血清Cav-1、FoxO3a mRNA水平變化能夠為臨床aSAH患者預后評估提供參考。本研究多因素分析還發現，改良Fisher分級高、Hung-Hess分級高是aSAH患者預后不良的危險因素，與張蘭等[28]研究結果一致。提示對于改良Fisher分級與Hung-Hess分級較高者臨床應建立高危預警機制，加強干預、重點關注以降低預后不良風險。

綜上所述，aSAH患者血清Cav-1呈低表達、FoxO3a mRNA呈高表達，二者與aSAH患者的預后情況有密切的聯系，二者聯合檢測能夠用于預后評估，對aSAH疾病的診治和預后有重大意義。但本研究仍存在一些不足，將擴大樣本量研究，進一步動態檢測血清Cav-1、FoxO3a mRNA的水平變化，為aSAH的診治提供準確的參考依據。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻聲明

李長寶：設計研究方案，實施研究過程，論文撰寫；宋保新：提出研究思路，分析試驗數據，論文審核；沈俊巖：實施研究過程，資料搜集整理，論文修改；張云鵬：進行統計學分析，課題設計