肝細胞癌組織中lncRNA-SOX2OT、miR-122-5p表達及與病理參數和預后的關系

李品青，徐春陽，薛晨祺，丁凱，姚煜，邱潔

肝細胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是肝癌最常見類型，2020年我國肝癌新發和死亡病例分別為41.0萬例、39.1萬例，占全球肝癌新發和死亡病例的45.3%、47.1%[1-2]。近年來早期HCC的檢出率雖有所提升，但大多數患者預后仍然較差[3]，亟需進一步了解HCC發生發展的驅動因素。研究表明，非編碼RNA參與腫瘤發生發展[4-5]。SRY盒轉錄因子2重疊轉錄本(SRY-box transcription factor 2 overlapping transcript，SOX2OT)是新近發現的一種長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)，研究報道lncRNA-SOX2OT參與鼻咽癌、胰腺癌等惡性腫瘤進展[6-7]。微小RNA-122-5p(microRNA-122-5p，miR-122-5p)是miRNA家族的一種高度保守成員，研究報道miR-122-5p參與卵巢癌、食管癌等惡性腫瘤進展[8-9]。目前關于HCC組織中lncRNA-SOX2OT、miR-122-5p表達與病理參數和預后的關系報道較少，基于此進行研究，以期為評估HCC患者進展和預后提供參考，報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2017年9月—2018年12月南京中醫藥大學附屬南京醫院/南京市第二醫院腫瘤和血管疾病介入一科收治HCC患者112例，男68例，女44例，年齡36～82(60.68±6.54)歲；腫瘤直徑：≥3 cm 64例、<3 cm 48例；Child-Pugh分級：A級38例，B級42例，C級32例；乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)：陽性68例，陰性44例；AFP：≥400 μg/L 30例、<400 μg/L 82例；分化程度：低分化22例,中高分化90例；巴塞羅那臨床肝癌(Barcelona Clinic Liver Cancer，BCLC)分期：極早期29例,早期27例,中期18例,晚期38例；淋巴結轉移24例。本研究經醫院倫理委員會批準(2017-02-45)，患者及家屬均知情同意并簽署知情同意書。

1.2 病例選擇標準 (1)納入標準：①經術后病理確診為HCC，符合“原發性肝癌規范化病理診斷指南(2015年版)”[10]診斷標準；②初診，入院前未接受抗腫瘤治療；③接受姑息性或根治性手術；④病理參數和隨訪資料完整；⑤年齡≥18歲。(2)排除標準：①合并其他部位腫瘤；②全身感染性疾病；③既往肝部手術史；④合并嚴重心、腎功能損害。

1.3 觀測指標與方法

1.3.1 lncRNA-SOX2OT、miR-122-5p表達：收集術中切除部分癌組織和距離>5 cm的癌旁組織，液氮冷凍中研磨成末，Trizol試劑盒(上海冠泰生物科技有限公司)提取組織總RNA，Nano-300微量分光光度計(杭州奧盛儀器有限公司)驗證純度、濃度合格，使用反轉錄試劑盒(日本TaKaRa Bio公司)逆轉錄合成cDNA，反轉錄體積10 μl：5×PrimeScript RT Master Mix 2.0 μl、RNA 2.0 μl、RNase Free H2O 6.0 μl；反應條件：37℃ 15 min、85℃ 5 s、4℃反應至結束后保存于-20℃冰箱中。以cDNA為模板按照SYBR?Premix Ex TaqTM試劑盒(日本TaKaRa Bio公司)進行PCR擴增，引物序列由上海新貝生物科技有限公司設計和合成：lncRNA-SOX2OT 上游 5′-GTTCATGGCCTGGACTCTCC-3′、下游5′-ATTGCTAGCCCTCACACCTC-3′，內參GAPDH 上游5′-GGTGGTCTCCTCTGACTTCAACA-3′、下游5′-CCAAATTCGTTGTCATACCAGGAAATG-3′；miR-122-5p上游5′-CCATGATTCCTTCATATTTGC-3′、下游5′-GCAAATATGAAGGAATCATGG-3′，內參U6上游5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′、下游5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。PCR反應體積20 μl：SYBR?Premix Ex Taq 10 μl、正反向引物各0.8 μl、cDNA模板2.0 μl、ROX Reference Dye (50×)0.4 μl、RNase Free H2O 6.0 μl；反應條件：95℃ 90 s、95℃ 30 s、63℃ 30 s、72℃ 15 s，循環40次后收集Ct值，2-ΔΔCt法計算組織中lncRNA-SOX2OT、miR-122-5p表達。

1.3.2 隨訪：患者出院后通過門診或電話方式隨訪3年，隨訪截至2022年1月，根據HCC組織中lncRNA-SOX2OT、miR-122-5p表達的均值分為lncRNA-SOX2OT高表達組(≥3.53，n=59)、低表達組(<3.53，n=53)，miR-122-5p高表達組(≥1.71，n=62)、低表達組(<1.71，n=50)，統計不同組別HCC患者總生存率。

2 結 果

2.1 HCC組織與癌旁組織中lncRNA-SOX2OT、miR-122-5p表達比較 HCC組織中lncRNA-SOX2OT表達量為(3.53±0.82)，高于癌旁組織的(1.72±0.36)(t=21.258，P<0.001)；miR-122-5p表達量為(1.71±0.50)，低于癌旁組織的(2.98±0.43)，差異有統計學意義(t=20.475，P<0.001)。

2.2 HCC組織中lncRNA-SOX2OT與miR-122-5p表達的相關性 Pearson相關性分析顯示，HCC組織中lncRNA-SOX2OT與miR-122-5p表達呈負相關(r=-0.771，P<0.001)。

2.3 HCC組織中lncRNA-SOX2OT、miR-122-5p表達在不同臨床/病理參數中比較 HCC組織中lncRNA-SOX2OT表達在Child-Pugh分級B～C級、BCLC分期晚期、有淋巴結轉移者中高于Child-Pugh分級A級、BCLC分期極早期～中期、無淋巴結轉移者，而miR-122-5p表達低于Child-Pugh分級A級、BCLC分期極早期～中期、無淋巴結轉移者(P均<0.05)，見表1。

表1 HCC組織中lncRNA-SOX2OT、miR-122-5p表達在不同臨床/病理參數中比較

2.4 HCC組織中lncRNA-SOX2OT、miR-122-5p表達與預后的關系 隨訪3年，112例HCC患者死亡36例，總生存率為67.86%(76/112)，無病例失訪。Kaplan-Meier生存曲線分析顯示，lncRNA-SOX2OT高表達組總生存率54.24%(32/59)，低于lncRNA-SOX2OT低表達組的83.02%(44/53)，差異有統計學意義(χ2=11.176，P<0.001)；miR-122-5p高表達組總生存率80.65%(50/62)高于miR-122-5p低表達組的52.00%(26/50)，差異均有統計學意義(χ2=10.744，P<0.001)。見圖1、2。

圖1 不同lncRNA-SOX2OT表達HCC患者Kaplan-Meier生存曲線

圖2 不同miR-122-5p表達HCC患者Kaplan-Meier生存曲線

3 討 論

HCC是起源于肝細胞的惡性腫瘤，我國超過80%的HCC患者合并有HBV感染，由于HCC起病隱匿，39.0%～53.6%的HCC患者初診處于晚期，中位生存期僅3.0～5.7個月，1年生存率僅12.0%～38.3%[11]。盡管近年來免疫檢查點抑制劑為中晚期HCC提供了新的方向，但目前基于免疫檢查點抑制劑的HCC免疫聯合多學科治療對晚期HCC的療效仍然較差[12]。還需進一步研究HCC的分子機制，對判斷HCC進展、評估預后、延長生存期具有重要意義。

HCC是多因素和多步驟的復雜過程，表觀遺傳學涉及的非編碼RNA在腫瘤發生發展中發揮重要作用[13-15]。lncRNA是一類新興的表觀遺傳學調控分子，能通過競爭性占有胞內miRNA海綿樣干涉miRNA活性，間接調控靶mRNA表達參與腫瘤發生發展[5]。lncRNA-SOX2OT位于人3號染色體26.33，由10個外顯子和2個以上的轉錄起始位點組成，這些位點表現出復雜的轉錄特征，與癌癥和干細胞相關途徑密切相關[16-17]。基于lncRNA-SOX2OT與癌癥和干細胞的復雜關系，多項研究也指出lncRNA-SOX2OT與惡性腫瘤的關系，如lncRNA-SOX2OT能海綿miR-194-5p降低SRY盒轉錄因子5抑制結直腸癌細胞增殖、遷移和侵襲[18-19]，lncRNA-SOX2OT能海綿miR-942-5p上調纖溶酶原激活物抑制劑-1促進三陰性乳腺癌細胞轉移[20]。這些研究提示lncRNA-SOX2OT在不同腫瘤中發揮不同作用。本研究結果顯示，HCC中lncRNA-SOX2OT表達上調，提示lncRNA-SOX2OT可能在HCC發生發展中發揮作用，其表達上調可能與lncRNA-SOX2OT被癌基因激活有關。進一步分析顯示，HCC中lncRNA-SOX2OT表達上調與Child-Pugh分級、BCLC分期增加和淋巴結轉移有關，提示lncRNA-SOX2OT在HCC中發揮促癌基因作用，其高表達能促進HCC進展，其機制可能與lncRNA-SOX2OT能促進HCC上皮—間質轉化有關。上皮—間質轉化能賦予HCC細胞更強的運動性和侵襲性，促進HCC細胞從原發部位逃逸，進而促進HCC侵襲和轉移[21]。Sun等[22]通過細胞侵襲試驗證實，小干擾RNA敲低lncRNA-SOX2OT能抑制HCC上皮—間質轉化，進而抑制HCC侵襲。

miRNA也是一類新興的表觀遺傳學調控分子，能通過降解或抑制蛋白質翻譯調控mRNA表達與腫瘤發生發展[6]。miR-122-5p位于人18號染色體26.31，是一個與肝損傷密切相關的miRNA，在非酒精性脂肪性肝病中，miR-122-5p能靶向叉頭框O3抑制非酒精性脂肪性肝病炎性反應和氧化應激損傷[23]。在HBV相關肝纖維化中，miR-122-5p能靶向白介素-17受體抑制HBV相關肝纖維化進展[24]。近年研究發現，miR-122-5p也參與惡性腫瘤進展，如miR-122-5p能靶向原癌基因c-Fos抑制胃癌血管生成[25]。另有研究指出，miR-122-5p DNA甲基化與結直腸癌肝轉移有關[26]。本研究結果顯示，HCC中miR-122-5p表達下調，提示miR-122-5p可能在HCC發生發展中發揮作用，其表達下調可能與miR-122-5p DNA甲基化有關。進一步分析顯示，HCC中miR-122-5p表達下調與Child-Pugh分級、BCLC分期增加和淋巴結轉移有關，提示miR-122-5p在HCC中發揮抑癌基因作用，miR-122-5p低表達能促進HCC進展，其機制可能與miR-122-5p抑制叉頭框K2(forkhead box K2，FOXK2)有關。FOXK2是一種翼—螺旋DNA結合域的轉錄因子，能在轉錄水平上調控細胞周期進程和凋亡程序促進HCC發生發展[27]。Zhao等[28]研究證實，miR-122-5p能靶向下調FOXK2抑制HCC細胞增殖、轉移。本研究通過繪制不同lncRNA-SOX2OT、miR-122-5p表達HCC患者生存曲線發現，lncRNA-SOX2OT高表達HCC患者總生存率低于lncRNA-SOX2OT低表達患者，miR-122-5p高表達HCC患者總生存率高于miR-122-5p低表達患者，說明lncRNA-SOX2OT、miR-122-5p可能成為HCC患者預后評估指標。通過相關性分析發現，HCC中lncRNA-SOX2OT與miR-122-5p表達呈負相關，提示二者可能共同參與HCC發生發展。近期Liang等[29]通過雙熒光素酶實驗也證實，上調lncRNA-SOX2OT能靶向下調miR-122-5p表達，促進HCC侵襲和轉移，進一步佐證了本研究結果。

綜上所述，HCC組織中lncRNA-SOX2OT表達上調和miR-122-5p表達下調，二者可能共同參與HCC進展，與Child-Pugh分級、BCLC分期、淋巴結轉移和預后有關。但本研究樣本量較少，隨訪時間較短，關于lncRNA-SOX2OT、miR-122-5p參與HCC的機制有待進一步研究。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻聲明

李品青：設計研究方案，實施研究過程，論文撰寫;徐春陽：提出研究思路，分析試驗數據，論文審核;薛晨祺：實施研究過程，資料搜集整理，論文修改;丁凱：進行統計學分析;姚煜：課題設計，論文撰寫；邱潔：論文審核