沙田柚×枳雜交群體創建與InDel標記鑒定

關鍵詞：沙田柚；枳；雜交；InDel鑒定

中圖分類號：S666.3 文獻標志碼：A 文章編號：1009-9980（2023）02-0223-07

雜交育種是選育柑橘新品種的主要途徑，而選育出優良砧木也是提高柑橘產量、品質的重要措施，砧木資源研究與利用情況是衡量一個國家柑橘產業發展狀況的重要標志[1-2]。在中國果樹生產中，95%以上砧木來源于野生資源的種子或者其無性系品系和品種[3]。目前柑橘主要的砧木類型有枳、枳橙、香橙、酸橘、紅橘、酸柚等[4-5]，同時從國外引進了施文格枳柚（Swingle citrumelo）、卡里佐（Carrizo）枳橙、特羅亞（Troyer）枳橙、蘭卜來檬（Rangpur lime）、奔騰枳橙（Benton citrange）、Rusk 枳橙等[6]，其中枳的應用歷史最久，范圍最廣，面積最大，數量最多[7]。

枳[Poncirus trifoliata （L.） Raf.]起源于我國，抗寒性強，對根結線蟲病、柑橘衰退病、流膠病等也具有較強的抗性或耐性，并且以它為砧木的柑橘表現出早結實、豐產特性，因此在中國、日本和其他許多國家（地區）被廣泛用作柑橘砧木[8-9]。枳是柑橘砧木育種中重要功能基因和抗性基因的重要來源，被廣泛用作砧木遺傳改良重要親本和抗性基因研究的主要材料。在已經報道的柑橘砧木新品種中，美國的卡里佐枳橙、US系列，西班牙的FA系列等均是以枳為雜交親本所獲得[10]。

柚類在我國柑橘產業中穩步發展，主栽品種為沙田柚、琯溪蜜柚。由于柚具單胚特性，在實生繁殖條件下，很容易發生自然種間雜交和實生變異，經過數千年來遺傳演化，我國柚類種質資源已形成龐大的群體，種群分布豐富多彩[11]。

我國主栽柚類品種主要以枳和酸柚作砧木。但枳作砧木不適合所有柚類品種，石健泉等[12]認為枳砧沙田柚具有良好的豐產性，但歐召華等[13]認為枳砧無核柚、金香柚、墊江柚葉片黃化、樹早衰、產量低、不親和。而用酸柚作為柚的砧木，植株表現大根多、根深、須根少，嫁接親和性好，適宜在土層深厚、肥沃、排水良好的土壤栽培；但酸柚砧抗寒性較枳砧差，同時由于樹型過于高大，不符合現代矮化管理理念[14]。

目前，國外使用的枳柚并非真正的柚′枳雜交后代，而是美國在1907 年通過葡萄柚′枳的雜交后代—施文格枳柚（Swingle citrumelo），其綜合性狀優于酸橙，耐寒（強于卡里佐枳橙）、耐鹽、耐旱，抗衰退病、根腐病、木質陷點病和裂皮病，抗線蟲；目前，佛羅里達州50%以上的柑橘和巴西部分地區的寬皮柑橘使用它作砧木[15]。施文格枳柚抗性雖強，但也有缺點，如用此砧的接穗生長瘦弱，在pH 8.0 以上的堿性土壤中，常出現失綠病。與其他枳的雜交種一樣，作砧木常表現出大腳現象，并且實生苗生長慢，比酸橙苗更難管理[16]。

沙田柚是我國柚類重要品種之一，具有種子多、單胚特性，常規有性雜交容易得到雜種后代[17]。筆者在本研究中采用沙田柚′枳雜交，擬篩選出具有枳優良特性如矮化、抗逆性強等，且與我國主栽柚類親和性較強的砧木品種。

InDel 標記為共顯性標記，是一種分布廣泛、密度高、變異穩定性強的分子標記，具有基因型判別簡單、快速，適合于高密度分子標記開發等優點[18]。通過雜交后代形態學觀察，并結合InDel 標記的方式，篩選出真正的雜交F1代，為我國柑橘砧木新品種選育提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料

以廣西桂林陽朔5 株15 a（年）樹齡沙田柚為母本，湖南邵陽洞口枳為父本（前期篩選出的枳優系），2018—2021 年持續開展雜交工作，待果實成熟后取種播種，得到雜交后代群體。

1.2 方法

1.2.1 采集花粉采集湖南邵陽洞口枳花粉，充分干燥，4 ℃保存備用。

1.2.2 雜交授粉由于枳開花較其他柑橘品種要早，在湖南地區枳開花時，本地沙田柚尚未進入花期，因此選擇廣西桂林的陽朔縣開展雜交試驗；摘除母本花序上未開放和已經開放的花，保留1 朵或2 朵即將開放的花，去除雄蕊，授粉后套袋，共授粉8892朵。

1.2.3 獲得果實、取種播種待果實成熟后采集果實保存，分批取種，并分類統計；同時播種50 株枳、50 株沙田柚（由于沙田柚自花不實，父本為酸柚），作為對照。

1.2.4 形態學鑒定種子形態對比。將授粉后的果實種子與枳、沙田柚（沙田柚′酸柚后代）的種子進行形態對比，將其種子分成飽滿、敗育2 種類型，分別統計計數。

葉片形態對比。將播種后的后代葉片與枳、沙田柚（沙田柚′酸柚后代）的葉片進行形態對比，將其葉片按照三出復葉、單身復葉進行分類對比[19]。

1.2.5 雜交后代群體DNA 的提取采用改良CTAB法提取子代葉片基因組DNA，用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測提取質量[20]。

1.2.6 InDel 標記引物篩選及雜交后代群體鑒定根據枳全基因組重測序數據篩選出4 對在父母本上具有多態性且便于擴增與辨別條帶的InDel 標記引物（未發表），由北京擎科生物科技有限公司合成，引物信息見表1。

2 結果與分析

2.1 授粉后種子的形態特性及發芽率

10 月底，從5 株母本沙田柚樹共采集274 個授粉果實，坐果率為3.08%；對70 個果進行取種、播種，共獲得8612 粒種子，平均每個果實123 粒種子，含飽滿、敗育2 種類型，其飽滿種子：敗育種子≈1：2.64，雜交后代單果種子數量及形態與母本沙田柚相似（圖1）。

在相同培養條件下對沙田柚、枳和授粉后的種子催芽，發現發芽率存在差異，但不顯著。枳發芽率最高，為94%；沙田柚次之，發芽率為92%；雜交種子發芽率最低，為81.33%。

2.2 雜交后代形態學鑒定

70 個雜交果實以單果播種的形式繁育雜種群體，雜種后代在幼苗期葉片發生顯著分離。其中28個雜交果實繁育群體的葉片均為三出復葉，共計551 株；42 個雜交果實繁育群體的葉片均為單身復葉，共計1279 株。三出復葉、單身復葉2 種株系在生長發育過程中葉片表型表現穩定，僅有部分三出復葉單株的少量葉片在幼苗期偶爾表現出四出復葉和五出復葉變異情況。

從三出復葉形態看，與父本枳相似，但葉片較枳大，稍長；邊緣鋸齒不如枳明顯，較圓潤；從單身復葉形態看，與母本沙田柚相似（圖2，圖3）。

2.3 雜交苗的InDel分子標記鑒定結果

用寬皮柑橘、椪柑、甜橙、金柑、枸櫞、枳、柚等不同種質的嫩葉片為實驗材料，用4 對枳InDel 引物進行篩選，其中PT-P13 無法區分枳和柚，PT-P38 無法擴增出柚特異性條帶，PT-P51 雖然能區分枳和柚，但無法區分枳和寬皮柑橘，PT-P54 能區分枳和柚，同時能區分枳和其他柑橘種質（圖4）。因此，使用PT-P54 對雜交后代群體進行鑒定，其中三出復葉所有植株均擴增出顯著的差異性條帶，單身復葉部分植株擴增出顯著的差異性條帶（圖5）。

通過InDel 分子標記鑒定出三出復葉單株共計551 株均為有性雜交后代，單身復葉單株共計147 株為有性雜交后代，目前共得到有性雜交后代698 株，雜種率為38.14%（表2）。

3 討論

從雜交坐果率看，僅為274/8892=3.1%，偏低。麥適秋等[21]通過人工授粉發現，沙田柚自花授粉坐果率僅1.99%，但人工異花授粉坐果率為22.78%～31.71%，說明沙田柚人工異花授粉可提高產量；王丹等[22]通過枳砧梁平柚、晚白柚、蘆柑、宜昌橙、三寶柑、錦橙、檸檬等材料進行雜交，發現柚類作母本時親合力最高，可能與其胚珠數在柑橘種質中最多有關。本試驗坐果率低可能與父本枳的花粉從湖南邵陽洞口運輸到廣西桂林陽朔，路途較長，造成花粉部分失活；也可能與后期保花保果不佳有關；還可能與枳與沙田柚本身的親和性有關，需進一步開展相關親和性分析。

劉繼紅等[23]認為，枳的三葉對單葉是顯性，可以用于雜種苗的鑒定，但由于大多數枳屬植株為雜合體，該方法并非完全可靠；Toxopeus[24]研究發現，柚與馬蜂柑的葉片均為單身復葉，但雜交后代約有1/3為三出復葉；美國加利福尼亞州將克里邁丁橘′枳、柚橙′枳2 個雜合組合的F₁代進行自交或相互雜交，F₂代出現部分單葉植株，而且在F₂和回交后代中都還出現具有單葉和三葉混合葉型植株[25]；均表明三出復葉可能為2 個互補的顯性基因控制；王丹等[26]發現柚雜交一年生幼苗植株性狀以及葉片性狀均有不同程度變異，說明沙田柚雜種一代可以表現出較顯著變異。這與雜交后代部分表現單身復葉，以及出現部分四出復葉、五出復葉等特異型株系結論一致。

利用InDel 分子標記技術對親本雜種苗進行鑒定時，雜種苗中同時出現雙親的特異性條帶，則為雜種苗，反之則為假雜種苗。利用這一規律可以對柑橘F₁代的親子關系進行鑒定分析，縮短育種年限。Noda 等[27]根據溫州蜜柑基因組信息開發了61 個可用于分析溫州蜜柑雜種苗基因型的InDel 標記，同時能作為溫州蜜柑品種以外的柑橘屬雜種標記；Curk等[28]采用8 個InDel 標記和96 個SNP 標記來揭示不同酸橙和檸檬種質的種間結構差異，并對酸橙和檸檬種質資源的多樣性、遺傳結構和起源進行擴展分析。筆者在本研究中根據枳全基因組重測序數據篩選出4 對在父母本上具有多態性且便于擴增與辨別條帶的InDel 標記引物（未發表），通過對不同柑橘種質鑒定對比，最終選定1 對適合沙田柚′枳雜交后代鑒定的引物，鑒定出后代中551 株三出復葉單株均為雜交后代，147 株單身復葉單株雖不具備父本枳的三出復葉特征，但仍為雜交后代；其余1132 株單身復葉單株可能為：（1）沙田柚′酸柚的雜交后代，由于沙田柚具自交不親和特性，果農用酸柚花粉授粉沙田柚，可能造成酸柚花粉混入；（2）真正沙田柚′枳的雜交后代，需增加InDel 引物的篩選，提高鑒定的精度，進行重復鑒定。

4 結論

沙田柚′枳雜交后代雖然可通過父本枳的三出復葉這一顯性遺傳性狀區別非雜交苗，但形態學鑒定有一定的局限性，單身復葉仍可能為有性雜交后代，需結合分子標記進行精準鑒定。