基于SSR熒光標記構建板栗品種（系）核心種質群

關鍵詞：板栗；品種；SSR；遺傳多樣性；核心種質

中圖分類號：S664.2 文獻標志碼：A 文章編號：1009-9980（2023）02-0230-12

隨著中國種業創新力度的不斷加大，人們對各類種質資源的保護和利用愈發重視，但是植物資源相當豐富，且植株普遍高大，全部保存成本會很高。因此，構建植物資源核心種質，是一種有效解決該問題的方法。核心種質的概念最早由Frankel 等[1]提出，即采用一定的方法選取最少的種質資源數量以最大程度地代表該類種質資源的遺傳多樣性。核心種質的構建主要有兩種途徑，分別是基于表型性狀和基于分子標記基因型數據的構建方法。基于表型性狀構建核心種質極易受環境的影響，因此誤差較大，且需要對多種性狀進行分析，工作量巨大。分子標記技術以信息量大、效率高、不受環境影響等特點[2]，尤其是迅速發展的SSR標記具有穩定好、多態性高、共顯性遺傳、操作簡便等優點[3]，已逐漸成為構建核心種質的主要方法。目前，SSR 分子標記技術已經成功應用到多種作物的核心種質構建中，對資源保護和創新利用以及新品種的選育發揮了重要作用。如在蔬菜中，崔竣杰等[4]根據表型和SSR 標記構建了苦瓜的核心種質；李金龍等[5]利用SSR 分子標記技術研究甜蕎種質資源的群體結構，進而構建甜蕎的初級核心種質庫；吳茵[6]在利用SRAP分子標記構建辣椒初級核心種質的基礎上，利用SSR 分子標記壓縮初級核心種質進而構建了最終的核心種質；果樹中魯敏等[7]采用位點優先取樣策略對收集的102 份自然種質構建核心種質；李冬波等[8]利用SSR分子標記對廣西荔枝種質資源進行遺傳多樣性分析并構建核心種質，從而對資源保護發揮了重要作用；鄒梁峰[9]基于表型性狀和SSR 分子標記構建了毛花獼猴桃的核心種質，從而對中國廣泛分布的這種特有的種質資源進行了很好的保護利用。劉娟等[10-11]分別基于表型性狀和ISSR 分子標記構建了野杏和南疆杏資源的核心種質，花卉中陳明堃等[12]統計建蘭的表型并利用SSR 標記篩選了核心種質，能夠最大程度代表原始種質的遺傳多樣性。此外，林木中的杉木[13]、毛白楊[14]、刺槐[15]、核桃[16]、白蠟[17]、楸樹[18]等都構建了核心種質，對于資源保護和創新利用有重要作用。

板栗（Castanea mollissima Bl.）為殼斗科栗屬植物，果實味道鮮美，具有很高的營養價值和藥用價值[19]，早在6000 年前，古人就已經食用野生板栗[20]。中國板栗資源豐富，可分為華北、長江流域、西南、東南、西北與東北6 個品種群[21]，現階段約有300 個栽培品種（系）。同時，隨著自然變異和人工選擇，市場上逐漸出現新品種，同時淘汰一些過時的品種。因此，如果不及時發現和保護，就會造成優異種質資源的遺失和浪費，從而對今后資源的創新利用造成困難。所以，構建中國板栗品種的核心種質，對其保護和利用具有重要的意義。前人對板栗品種核心種質的構建僅在某一地區或所采集的板栗品種資源不夠全面[22-23]，不足以代表全國板栗品種資源的遺傳多樣性。筆者以國家板栗資源圃和江蘇良種繁育基地收集的342 個品種（系）資源為材料，應用熒光SSR 分子標記技術獲取片段信息，基于分層取樣法、模擬退火算法和隨機搜索算法構建全國板栗品種核心種質，從而為今后板栗新品種的創制、品種的種質鑒定和保存利用提供理論基礎。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

試驗材料為從山東省泰安市國家板栗資源圃和位于江蘇板栗良種繁殖基地搜集的共342 個板栗品種，它們原生地分布在16 個省份。資源圃位于當地的丘陵山地地區，降水量較大，土壤適合板栗生長和栽培。

1.2 試驗方法

1.2.1 DNA提取 板栗葉片DNA提取采用美基生物公司生產的廣譜植物DNA 提取試劑盒。采用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA完整度，用超微量分光光度計測定DNA濃度和純度，將合格的DNA保存在-20 ℃冰箱中。

1.2.2 熒光毛細管電泳SSR-PCR 擴增 SSR 引物采用本實驗室之前所篩選得到的21 對高多態SSR標記進行PCR擴增[22]。PCR擴增采用20 μL反應體系：其中包含1 μL模板DNA（20～50 ng· μL-1），10 μL2×Taq PCR Master Mixes（Takara， DaLian China），0.1 μL 正向引物（10 μmol · L- 1），0.3 μL 反向引物（10 μmol·L-1），0.2 μL 熒光標記（FAM，HEX，ROX）的M13引物（10 μmol·L-1）（中國天津，擎科）和9.4 μLddH2O。反應程序為：94 ℃預變性3 min，94 ℃變性30 s，56 ℃ 退火30 s，72 ℃延伸30 s，35 個循環，最后72 ℃ 延伸10 min，10 ℃ 保存（BIO- RAD PCRThermal Cycler T100， USA）。

將3 對熒光SSR引物的PCR擴增產物合并在一起，然后使用ABI 3730XL DNA 測序儀（AppliedBiosystems， Foster City， CA， USA）通過毛細管電泳分析混合物中片段位置信息，并使用Gene Marker V2.2.0 軟件（Soft Genetics LLC， State College， PA，USA）讀取等位位點具體的片段大小信息。

1.2.3 數據分析 按照PowerMarker V3.25[24]軟件要求的格式，在Excel 表格中將讀取的SSR 原始“bp值型”數據轉換成powermarker 格式，缺失的數據賦值為“0”，并利用該軟件及GenAlEx6.51[25-26]計算遺傳多樣性指標參數，包括等位基因數量（Na）、有效等位基因數（Ne）、觀測雜合度（Ho）、期望雜合度（He）、多態信息含量（PIC）。

1.2.4 核心種質的構建 （1）基于分層取樣法篩選核心種質。基于最大等位基因數原則，根據聚類圖采用逐步聚類留樣，每一輪聚類，隨機去除最低分類水平上兩個個體中的一個，剩下的一個入選提取比例，第二輪提取比例為從上次提取的樣品中聚類篩選，從而形成八個提取比例（100%、83.33%、66.67%、46.49%、31.58%、20.76%、13.74%、8.77%），并計算這8 個提取比例的等位位點數量。

（2）基于模擬退火算法篩選核心種質。為構建合適的核心種質，再通過基于最大等位基因數（SAAN）的模擬退火算法來篩選和構建中國板栗品種的核心種質。在Power Marker v3.25 軟件中建立一個梯度樣本抓取數量方案來計算所選的不同容量的樣品所保留的等位位點的數量，從而確定最終篩選的核心種質樣品數量。為保證盡可能的保留等位位點數，采用5，10，15，20，25，30，35，40，45，55，60，65，70，75，80，85，90，95，100，105，110，115，120，125，130，135，140，145，150，155，160，165，170，175，180，185，190，195，200，205，210，215，220，225，230，235，240，245，250，255，260，265，270，275，280，285，290，295，300，305，310，315，320，325，330，335，340的梯度抓取方案來計算不同取樣數量的等位位點數，從而確定等位位點最大時的抓取數量。

（3）基于隨機搜索算法篩選核心種質。基于最大等位基因數（RS， AN， AN）的隨機搜索算法來構建板栗品種的核心種質。該方法同樣利用上述基于模擬退火算法的梯度抓取方案，比較不同取樣數量的等位位點數量，從而確定抓取數量。

將上述3 種策略所獲得的取樣數量、等位位點數量等進行比較以確定最終的取樣數量，進而來評估出3 種核心種質構建策略中的最優策略。

最后通過Prism 軟件[27]對核心種質和原始種質之間的Na、Ne、Ho、He 和PIC 值進行T 檢驗，從而驗證所構建的核心種質的準確性、科學性和可靠性。

2 結果與分析

2.1 原始板栗品種（系）種質聚類分析

對所有資源進行遺傳多樣性分析，結果表明342 份板栗品種資源共有212 個等位位點，平均每對引物所保留的等位基因數（Na）為10.095，有效等位基因數（Ne）為3.488，觀測雜合度為0.596，期望雜合度為0.658，多態信息含量為0.642。同時基于UPGMA方法進行聚類分析，結果如圖1 所示。全部資源可以劃分為3 個組，藍色部分大多為北方品種，但混有31 份南方品種；紅色部分大多為南方品種，但混有39 份北方品種；紫色部分共有42 份品種，其中大部分為山東資源，占78.57%，在地理位置上正好也為南北兩大類群的交匯地帶。由此推測，全部資源大致分為南北兩個群體，但也存在較多的混雜，南北方板栗品種存在較多基因交流，山東地區為南北品種類群的混交地帶。群體結構分析進一步證明，全部板栗資源大致分為兩部分，但存在較多混雜。群體結構中混雜系數大于0.8 被認為存在較多基因交流，如北方品種群中混入的南方品種Y140 系數大于0.8，因此會聚類到北方品種群中，表明該品種存在頻繁的基因交流。

2.2 核心種質構建與評價

2.2.1 構建必選種質庫 種質資源庫對于育種和基因挖掘具有重要作用。如圖2 所示，根據板栗品種獨特的成熟期、枝條長度和彎曲度、刺蓬色澤等，從全部資源中挑選出8 個具有特殊性狀的品種作為必選品種，而這些資源會在未來育種和遺傳研究等方面發揮重要作用。其中，早熟型品種有京暑紅、燕山早豐；短枝型品種有短枝1 號、短枝3 號和超短枝2號；垂枝型品種有垂枝2 號；雄花不育型品種有無花；紅刺型品種有山東紅栗。

2.2.2 核心種質構建 為了確定最合適的核心種質構建策略以及取樣數量，筆者基于最大等位基因數，利用分層抽樣法、模擬退火算法和隨機搜索算法3種方法構建最優核心種質（圖3）。

利用分層抽樣策略，通過逐步聚類取樣形成了8 個取樣比例為100%、83.33%、66.67%、46.49%、31.58%、20.76%、13.74%、8.77%，并計算每個取樣比例下的等位位點數量分別為212、207、202、196、185、179、163、152。隨著取樣比例的升高，所保留的等位位點數量也逐漸增多，當取樣比例達到100%時，等位位點數量達到最大為212。

RS，AN，AN為利用基于等位位點數量的隨機搜索算法來構建核心種質。以5 為梯度計算等位位點數量，結果表明，等位位點數量呈現波浪變化，當取樣數量達到325 份時所保留的等位位點數量達到最大值212。

SA，AN，AN為利用基于等位位點數量的模擬退火算法來構建核心種質。結果表明當以5 為梯度計算等位位點數量時，隨著取樣數量的增加等位位點數量也逐漸升高。當取樣數量達到85 份資源時，所保留的等位位點數達到最大值212，并且隨著取樣數量繼續增加時，等位位點數量趨于平穩，不再升高或降低。

綜上所述，通過對3 種方法在不同取樣數量時的等位位點數比較分析，結果表明SA，AN，AN策略為構建核心種質的最優策略，且當種質資源數量達到85 份時能夠代表全部資源的等位基因數，即所保留的等位位點數為212。

2.2.3 核心種質評價及遺傳多樣性分析 為了驗證這85 份核心種質資源的合理性、可靠性及科學性，首先，筆者對核心種質在全部資源的分布情況進行主坐標分析（PCoA）以及對核心種質進行群體結構分析。如圖4 所示，Pop2 部分為核心種質，Pop1 部分為篩選之后的剩余種質，主坐標1 和2 分別解釋了位點信息數據中34.36%和15.71%的變異，初步顯示核心種質在全部種質資源中較為均勻的分布，從而表明所篩選結果的合理性。群體結構分析表明，85個核心種質資源與全部種質資源資源相同，大致分為兩部分。

隨后筆者對所篩選的核心種質和原始種質之間的遺傳多樣性參數進行分析。如表1 所示，原始種質共342 份，核心種質共85 份，保留率為24.85%；核心種質的等位位點數量和原始種質的等位位點數相同，保留率為100%；等位基因數（Na）、有效等位基因數（Ne）、觀測雜合度（Ho）、期望雜合度（He）、多態信息含量（PIC）的保留率分別為86.32%、85.46%、98.15%、90.12%和100.79%。

對核心種質和原始種質的遺傳多樣性參數進行T 檢驗，結果顯示所構建的核心種質各遺傳多樣性參數與原始種質之間沒有顯著差異，且其原生地涵蓋11 個省份，其他省份樣品較少，分析中沒有入選，表明所構建的85 個核心種質資源能夠很好地保存原始種質資源的遺傳多樣性（表2）。

3 討論

3.1 板栗品種遺傳多樣性分析

基于SSR 標記研究種群遺傳多樣性已成為最方便快捷的方法，前人[28-33]均利用SSR 技術研究種群遺傳多樣性。而關于板栗遺傳多樣性的研究也已有報道。張馨方等[34]利用SSR 分子標記技術對279份板栗資源進行遺傳多樣性分析，平均每對引物檢測到3.38 個等位位點，有效等位基因數為1.53，聚類結果表明群體間遺傳關系和地理來源有一定聯系。此外，江錫兵等[35]、張馨方等[36]均采用SSR標記對部分地區板栗資源進行遺傳多樣性分析。筆者對全國板栗品種資源進行廣泛收集，并且基于SSR 熒光分子標記技術對其進行遺傳多樣性分析，總等位位點為212 個，平均每對引物檢測到的等位基因數為10.095，有效等位基因數為3.488，明顯高于前人的研究結果。因此，筆者在本研究中的21 對SSR分子標記能夠反映出板栗品種的遺傳多樣性。此外，對342 份板栗品種資源進行聚類分析，結果表明中國板栗品種資源大致分為南北兩個群體。但是存在大部分南北混雜品種，對于其混雜原因還有待進一步研究分析。另外，選取聚類分析中得到的南北方板栗品種的含水量、可溶性糖含量、直鏈淀粉含量、支鏈淀粉含量、總淀粉含量等19 個表型性狀進行差異顯著性分析，結果顯示，南北方板栗品種的可溶性糖含量、直鏈淀粉含量、支鏈淀粉含量、刺苞厚、堅果厚、堅果寬呈顯著性差異；總苞質量、苞質量、刺苞寬、刺苞高、苞肉厚、單粒質量呈極顯著差異；含水量、總淀粉含量、出實率等其他指標無顯著差異。此外，上述指標中除了直鏈淀粉含量、出實率和果形指數外，其余南方品種的表型指標值均大于北方品種，如含水量、可溶性糖含量、單粒質量等指標值，推測可能與南北方的環境差異有關。通過表型分析，進一步證明板栗品種（系）大致分為南北兩個群體。

3.2 板栗品種核心種質構建分析

種質資源的收集和保存對物種的遺傳多樣性保護和育種具有重要作用，但是一個物種的種質資源往往比較豐富，不方便進行遺傳育種研究[12]。因此，選擇一定方法構建核心種質對深入挖掘優異種質資源，提高資源利用價值和效率具有重要意義[1]。構建策略的選擇是核心種質的重點，不同的取樣策略對核心種質樣品的選擇具有直接的影響。此外，等位基因的數量是多樣性的反映[37]，保留更多的等位基因對育種有重要作用[38]。李金龍等[5]基于聚類和表型，構建了甜蕎530 份種質；李洪果等[39]基于等位基因最大化原則構建了杜仲189 份種質；王春梅等[40]、陳天青等[41]、何建文等[42]都用了一種方法構建了玉米、小麥、辣椒等的核心種質。因此，為了使核心種質更具有代表性和可靠性，筆者在本研究中采用3 種方法進行核心種質構建，同時比較3 種方法所保留的等位位點數量，進而篩選出最少的種質資源以最大程度地代表原始種質的遺傳多樣性。

中國板栗品種豐富，資源眾多，不易保存，因此構建核心種質尤為重要。前人對于板栗核心種質也有研究，如張馨方等[23]采用多次聚類的方法構建了燕山板栗的核心種質，不足以代表全國范圍內的板栗品種資源；Nie 等[22]基于最大遺傳多樣性的模擬退火算法構建了45份板栗品種的核心種質，但是只運用一種取樣策略且研究的樣品較少，具有局限性。因此亟需構建涵蓋全國板栗品種資源遺傳多樣性的核心種質。

筆者通過SA，AN，AN、RS，AN，AN和分層抽樣3 種方法構建核心種質，最終選擇SA，AN，AN作為最優策略并且構建的85 份資源約占原始種質庫的24.85%，能夠充分代表原始種質的遺傳多樣性，符合前人關于核心種質取樣比例在5%～40%的研究結論[43]。基于等位基因數的模擬退火算法相比另外兩種構建策略而言，能夠以最少的資源代表整個原始種群的遺傳多樣性，且能夠更好地保存資源。隨著市場的需要及科技的發展，會不斷出現新的優異板栗品種資源，因此構建核心種質是一個動態的過程，在今后的研究中需要不斷完善核心種質。

4 結論

筆者在本研究中基于SSR 分子標記，揭示了南北方板栗品種（系）存在較多基因交流，同時利用SA，AN，AN、RS，AN，AN和分層抽樣3 種策略構建核心種質，確定基于等位基因數的模擬退火算法為最優取樣策略，最終構建85 份核心種質。