不同生態型杜梨對缺鐵脅迫的生理響應及耐缺鐵性評價

關鍵詞：杜梨；生理響應；砧木；缺鐵脅迫

中圖分類號：S661.2 文獻標志碼：A 文章編號：1009-9980（2023）02-0262-12

鐵是植物生長發育必需的微量元素，參與了植物的光合作用、呼吸作用等代謝過程[1]。缺鐵直接引起植物葉片黃化，梨在生長期因缺鐵引起的黃化病在中國新疆、渭北、四川盆地、黃河故道[2-4]等梨樹種植區是常見的。目前雖然通過土壤施肥、枝干注射、葉片噴施鐵肥及噴施激素[5-6]等方法提高土壤中有效鐵含量和樹體中鐵的移動性，可以在一定程度上矯正果樹缺鐵失綠問題，但是不能從根本上解決植物的缺鐵問題[7]。有研究表明，砧木影響嫁接品種對鐵元素的吸收與利用[8]，選育鐵高效的砧木，可以提高品種對鐵的吸收利用效率[9-10]。中國是世界梨屬植物重要的起源中心[11-12]，有豐富的梨砧木資源，其中杜梨（Pyrus betulifolia）抗寒、抗旱、耐鹽堿、適應性強[13-16]，廣泛分布于中國華北、西北、東北南部等地，常被用作梨的砧木。前期的研究發現，不同生態型的杜梨對鐵的吸收能力不同。因此，筆者在本試驗中通過研究杜梨缺鐵生理響應的差異性，對不同生態型的杜梨進行耐缺鐵性評價，篩選對缺鐵耐性強的杜梨類型，為選育鐵高效砧木、解決梨樹缺鐵問題提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 試驗材料及處理

參試杜梨種子分別采自山東省臨沂市臨沭縣、甘肅省慶陽市寧縣和河南省洛陽市欒川縣三處具有代表性的野生杜梨群體，每處種源地采種的杜梨群體均大于30 株，混合采種后用于以下試驗。為了表述方便，依據產地分別用SD（山東杜梨）、GD（甘肅杜梨）和HD（河南杜梨）表示。選擇大小一致飽滿的種子，經滅菌處理后置于墊有濕紗布的培養皿中，置于4 ℃的條件下催芽。種子露白后進行穴盤播種，穴盤營養土體積比為草炭∶珍珠巖＝4∶1。

選取高度一致、10 枚真葉的幼苗移栽到高純度石英砂作基質的穴盤中，穴盤尺寸為56 cm×32 cm×16 cm（28 孔）。石英砂粒徑組成：＞2 mm 的占1%，＞1～2 mm占9%，＞0.5～1.0 mm占20%，＜0.5 mm占70%[17]。完全營養液緩苗2 周后用于試驗處理。完全營養液參照Ma等[18]的方法配置。試驗設0、20、40 μmol·L-1 FeNa-EDTA 3 個供鐵濃度處理，每個處理有不同生態型杜梨幼苗各84 株，每個重復28 株，共3個重復，處理期間每隔5 d 澆灌1 次營養液，每次每穴澆灌50 mL。初始營養液的pH用NaOH或HCl調至（6.0±0.1）。處理60 d后進行指標測定。試驗在人工氣候室進行，溫度為22～27 ℃，相對濕度為65%～85%，光照度為8000～10 000 lx，光照時間為14 h。

1.2 葉片黃化指數分級及其統計

根據葉片黃化程度，將葉片的黃化級值分為5個等級[19]：

0 級，完全沒有發生黃化。

1 級，葉片邊緣輕微黃化，黃化不超過1/2。

2 級，葉片脈間黃化加重，黃化不超過3/4。

3 級，葉片脈間失綠，全葉黃化。

4 級，葉片嚴重失綠甚至白化，葉邊緣焦枯，嚴重的全葉焦枯（圖1）。

取每株新葉（莖端的3 枚完全展開葉片），確定其黃化級數，按以下公式計算每個單株黃化指數：黃化指數/%=[Σ（黃化級值×相應黃化級值葉片數）（/ 總葉片數×4）×100]。取平均值作為該生態型杜梨的黃化指數，反映其黃化程度。

1.3 葉綠素含量的測定

采用手持SPAD-502 葉綠素儀（Konica Minolta，日本）對梨幼苗相同部位的新葉進行測定。

1.4 生長指標的測定

植物干質量的測定：鮮樣稱質量后在烘箱中105 ℃殺青20～30 min，然后在85 ℃恒溫烘干至恒質量，用電子天平（萬分之一）稱量質量（g）。根冠比值=根干質量（/ 莖干質量+葉干質量）。

1.5 根際酸化能力的測定

參照殷文娟等[20]的方法并加以改進，將營養液初始pH調為6.00，把不同處理的梨幼苗放進50 mL營養液中，24 h 后測定根際溶液pH，以營養液pH變化來衡量根系酸化能力。

1.6 凈光合速率的測定

使用CIRAS-3便攜式光合儀（PP Systems，美國）進行測定。在晴朗上午10：00—11：00測量植株新葉的凈光合速率（Pn），使用熒光葉室，光質為紅藍光，光照度設定為200 μmol·m-2·s-1，CO2濃度380～450 μL·L-1，葉片溫度（25±1）℃，氣體流速300 mL·min-1，空氣濕度65%～85%[21]。

1.7 根系Fe3＋還原酶活性的測定

參照許良政等[22]的方法進行測定，設Fe（Ⅱ ）-聯吡啶的摩爾吸收系數為8 650 mol·L-1 ·cm-1，反應時間（t）為2 h，比色波長為523.3 nm。按下列公式計算還原酶活性：還原酶活性（μmol · g- 1 · 2 h- 1）=（8650×106）（/ FW×OD）。

1.8 根系表面積和根尖數的測定

將整株幼苗根系洗凈后，使用根系掃描儀（EpsonPerfection V800 photo）掃描之后，用根系分析軟件（WinRHIZO 2007 版）對根體積及總根尖數進行測定分析。

1.9 全鐵和活性鐵含量及根系全鐵和活性鐵積累量的測定

全鐵和活性鐵含量均使用ICP- OES（Opti-ma8000，美國）進行測定。全鐵含量測定前處理：稱取1.00 g 干樣置三角瓶中，加優級純硝酸10 mL和高氯酸2 mL，于180 ℃消解至1 mL 左右停止加熱。加入10 mL超純水，沸騰3～5 min，超純水定容50 mL后上機測定。活性鐵含量測定前處理：參考黃宏文[23]的方法，略有改動：將鮮樣烘干磨成粉末，稱取1.00 g，放入具塞試管，加入10 mL的0.1 mol·L-1稀鹽酸連續振蕩12 h 浸提后過濾，上機測定。根系全鐵或活性鐵積累量（mg· plant-1）=根系干質量×根系全鐵或活性鐵含量。

1.10 氮元素和其他礦質元素含量測定

樣品于105 ℃殺青30 min，80 ℃烘干至恒質量，粉碎過0.25 mm篩后，采用凱氏定氮法[24]進行測定。其他礦質元素含量測定方法同全鐵含量測定。

1.11 數據處理

用Microsoft Excel 處理數據，Graph pad prism6軟件作圖，DPS 軟件在p ＜ 0.05 的水平上計算最小顯著性差異（LSD）值。

2 結果與分析

2.1 缺鐵對不同生態型杜梨幼苗生長的影響

缺鐵明顯影響了杜梨幼苗的生長，受影響的程度隨著缺鐵程度的增加而增加，但不同生態型的杜梨幼苗生長受影響的程度不同。山東杜梨（SD）本身生長勢比其他兩個生態型的杜梨強，缺鐵對其株高的影響最大。由表1可以看出，SD株高40 μmol·L^-1處理顯著大于20 μmol·L^-1處理，顯著大于0 μmol·L^-1處理；而甘肅杜梨（GD）株高40 μmol ·L^-1處理顯著高于0 μmol·L^-1處理，但二者與20 μmol·L^-1處理無顯著差異；河南杜梨（HD）株高是3 種杜梨中最矮的，雖然也受到缺鐵的影響，但影響最小，處理間差異不顯著。植株干質量（根和冠）測定結果與株高相似，也隨著缺鐵程度的增加而顯著下降。正常干質量較大的SD 受到缺鐵影響的程度顯著高于GD和HD。由根冠比可以看出，除HD 在供鐵濃度為20 μmol·L^-1時差異不顯著外，均表現了對地上部的影響大于地下部。同一生態型杜梨幼苗的莖粗在不同處理間差異不顯著。說明生長期內的株高、干質量可能是表征杜梨植株缺鐵生長狀態的良好指標。從缺鐵影響生長情況看，不同生態型的杜梨生長勢不同，生長量大的受影響大。因此，3 種不同生態型的杜梨SD 受到的影響最大，HD 最小，GD居中。

2.2 缺鐵對不同生態型杜梨幼苗葉片黃化及光合性能的影響

葉片黃化程度隨著供鐵濃度的降低而增加（圖2-A）。由圖2-B可以看出，供鐵濃度為40 μmol·L-1時，不同生態型杜梨的葉色有一定的差異，SD顯著高于HD，說明生長量大的SD可能需要更多的鐵來滿足正常生長需要；當供鐵濃度降低時，GD 的葉片黃化指數顯著高于（20 μmol ·L-1處理）或類似于（0 μmol·L-1處理）SD，二者顯著高于HD。綜合生長量因素分析，GD更易表現缺鐵黃化。

由圖3-A可以看出，隨著供鐵濃度的降低，3 種杜梨幼苗的新葉相對葉綠素含量（SPAD值）與葉片黃化指數變化相似，均呈現下降趨勢。在2 個缺鐵處理中，HD的SPAD值均顯著高于其他2 種杜梨。隨著供鐵濃度降低，SPAD 值以GD 下降幅度最大（38.8%），SD次之（30.5%），HD最小（29.2%）。由圖3-B可以看出，缺鐵導致凈光合速率急劇下降，各處理中SD 均顯著低于HD。但GD的下降幅度最大，SD 次之，HD 最小。凈光合速率的變化表現了與SPAD值變化的一致性。僅從葉片相對葉綠素含量和凈光合速率對缺鐵脅迫的響應看，GD對缺鐵最為敏感，SD次之，而HD敏感性較低。

2.3 缺鐵對不同生態型杜梨幼苗根系生長的影響

根尖是植物吸收礦質營養最活躍的部位，根尖數和根表面積的大小體現了根的吸收能力的強弱。由圖4-A可以看出，隨著供鐵濃度降低，根尖數顯著增加。在供鐵濃度為40 μmol·L^-1時，SD根尖數顯著大于GD和HD，且GD和HD沒有顯著差異。當供鐵濃度降為20 μmol·L^-1時，SD和HD的根尖數均顯著增加，GD無顯著性變化。當供鐵濃度降到0 μmol·L^-1時，GD 和HD 顯著增加，但此時SD 和HD 的根尖數顯著大于GD，SD 和HD 之間無顯著差異。與40 μmol·L^-1相比，HD的根尖數增加32.4%，GD增加23.5%，SD增加29.1%，由圖4-B可以看出，缺鐵處理也使3種杜梨根表面積顯著增加，供鐵濃度0 μmol·L^-1與40 μmol·L^-1相比，HD的根表面積增加49.6%，GD增加24.1%，SD增加37.7%，表明HD在缺鐵脅迫下根系生長能力最強，SD次之，GD最弱。

2.4 缺鐵對不同生態型杜梨幼苗根際酸化能力和Fe3+還原酶活性的影響

植物根系在吸收鐵時，首先會酸化根際環境，將土壤中Fe3+變為可溶性Fe²⁺，同時通過Fe³⁺還原酶將Fe³⁺還原為Fe²⁺進行吸收。因此植物根際酸化能力越強和Fe3+還原酶活性越高，越有利于對Fe³⁺的吸收。由圖5-A可見，隨著供鐵濃度的降低，3 種杜梨幼苗的根際pH值逐漸降低，酸化能力逐漸增強。在供鐵濃度為40 μmol·L^-1時，3種杜梨的根際pH值沒有顯著差異。隨著供鐵濃度的降低，3種杜梨的根際酸化能力均顯著增加，其中，在供鐵濃度為0 μmol·L^{- 1}時，GD的根際pH 值顯著高于HD，與SD 差異不明顯。說明GD的根際酸化能力最弱，可能是其更不耐受缺鐵的原因之一。為了解根系酸化能力與Fe³⁺還原酶活性的關系，進一步分析了不同處理Fe3+還原酶活性變化，結果如圖5-B所示。當供鐵濃度為40 μmol·L^-1時，3 種杜梨之間無顯著差異，隨著鐵濃度的降低，3 種杜梨幼苗的Fe³⁺還原酶活性均顯著提高。當供鐵濃度為20 μmol·L^-1時，HD的Fe³⁺還原酶活性顯著大于SD 和GD，后二者之間無顯著差異。當供鐵濃度為0 μmol·L^-1時，HD的Fe³⁺還原酶活性顯著大于GD，但與SD差異不顯著。與供鐵濃度為40 μmol·L^-1時相比，根系Fe³⁺還原酶活性提高程度為HD＞SD＞GD，與根際酸化能力表現了一致的變化。

2.5 缺鐵對不同生態型杜梨幼苗各器官活性鐵和全鐵含量及分布的影響

鐵在杜梨幼苗的根中含量最高，其次是老葉，莖和新葉相近。缺鐵導致杜梨幼苗各器官的鐵含量不均衡下降，尤以根、莖和新葉下降明顯。如圖6 所示，在供鐵濃度為40 μmol ·L^-1時，根中的全鐵含量HD 顯著高于SD 和GD，后二者之間無顯著差異。隨著供鐵濃度的降低，3 種杜梨根中的全鐵含量均顯著下降，以GD下降幅度最大。根中活性鐵含量表現了類似的變化趨勢。GD莖中的全鐵和活性鐵的含量顯著低于其他2 種杜梨，HD高于SD。老葉中的全鐵含量在供鐵濃度為40 μmol·L-1時，3 種杜梨無顯著差異，當供鐵濃度降低到20 μmol·L^-1時，HD和GD無顯著變化，SD 老葉中的全鐵含量顯著降低，0 μmol ·L^{- 1} 時，3 種杜梨均進一步顯著降低，HD含量高于SD 和GD，后二者無顯著差異。活性鐵含量僅在0 μmol?L-1時，HD顯著高于SD，但二者與GD差異不顯著，其他兩個處理3 種杜梨間差異不顯著。新葉在鐵濃度為40 μmol·L^-1時，SD全鐵含量顯著低于HD和GD，當供鐵濃度降低到20 μmol·L^-1時，HD下降不明顯，SD 和GD均顯著下降，當供鐵濃度降低到0 μmol·L^-1時，3 種杜梨都較前一個處理表現了顯著下降。但活性鐵在2 個缺鐵處理中，3 種杜梨都隨供鐵濃度下降而顯著下降，GD下降幅度最大。說明3 種生態型杜梨根對鐵的吸收、貯備和輸出能力不同，缺鐵導致的新葉中活性鐵含量變化與根中相似。

總體上，缺鐵引起根和新葉中活性鐵的下降幅度大于全鐵，3 種杜梨中，以GD下降幅度最大，其次SD，HD最小。

由于杜梨用作砧木時根系可作為一個功能的整體，為此，以單株根系為單位計算了缺鐵對不同生態型杜梨幼苗根系全鐵和活性鐵積累量的影響。如圖7 所示，在不同供鐵濃度下，SD和HD的單株根系全

鐵與活性鐵積累量均顯著大于GD，在供鐵濃度為0 μmol·L-1時，SD的根系全鐵積累量顯著大于D，而SD的根系活性鐵積累量與HD無顯著差異。

2.6 缺鐵對不同生態型杜梨幼苗各器官氮、磷、鉀元素含量和分布的影響

缺鐵引起杜梨幼苗各器官氮含量下降（圖8-A～D）。根、老葉和新葉中氮元素含量受缺鐵影響程度依次為：GD＞HD＞SD，莖中氮元素含量受缺鐵的影響程度依次為：GD＞SD＞HD，由此可以看出GD氮元素含量受缺鐵的影響最大。由圖8-E～H可以看出，缺鐵對根中磷元素含量變化影響較小，除GD在供鐵濃度為0 μmol·L-1時P元素含量呈現顯著下降外，SD 和HD無顯著變化。3 種杜梨莖中磷元素含量受缺鐵影響程度依次為：GD＞HD＞SD，老葉依次為：GD＞SD＞HD。新葉中SD 在供鐵濃度為20 μmol·L-1時磷元素含量顯著下降，而GD和HD無顯著變化。由圖8-I～L 可以看出，鉀元素含量受缺鐵影響程度根中以GD最大，SD次之，HD變化不顯著。但隨著供鐵濃度降低，莖、老葉和新葉中鉀元素含量表現了不同程度的增加，老葉中的增加幅度為SD＞GD＞HD，新葉中為GD＞SD，HD無顯著變化。在供鐵濃度由40 μmol ·L- 1降低為20 μmol ·L- 1時，HD老葉中鉀元素含量無顯著變化，受缺鐵影響程度最小，供鐵濃度由20 μmol·L-1降低為0 μmol·L-1時，3 種杜梨老葉中鉀元素含量均無顯著變化。總體來看，缺鐵對不同生態型的杜梨各器官中氮磷鉀元素含量和分布影響是不同的，其中，缺鐵對GD的影響最大，SD次之，HD最小。

3 討論

鐵元素作為光合磷酸化和氧化磷酸化中鐵硫蛋白的重要組成元素，參與了植物的光合和呼吸作用等代謝過程，對植物的生長發育起著重要的作用[25-26]。結果表明，缺鐵會導致杜梨幼苗的株高、莖粗和干質量下降，其中地上部干質量下降幅度大于根部，說明缺鐵對地上部生長的影響大于地下部，本身生長量越大，受影響的程度越大，并與缺鐵引起的葉綠素含量和凈光合速率下降表現相一致。有研究結果表明地下部與地上部生長狀態可能與生長素和細胞分裂素的合成與分布有關[27-28]，但這與缺鐵之間的聯系還不明確。根尖是根系吸收養分最活躍的部位，植物在缺鐵條件下通過增加根尖數和根表面積來提高獲取鐵元素的效率[29]。本研究表明隨著供鐵濃度降低，3 種不同生態型的杜梨根尖數和根表面積均顯著增大，其中HD根系生長能力最強，GD最弱，表現與各處理葉片黃化程度相一致。3 種不同生態型杜梨之間的生長量不同，HD與GD的生長量相近，SD的生長量最大，根中全鐵和活性鐵積累量最高，因此SD表現不耐缺鐵的部分原因可能與其生長量大、需要更多的鐵元素有關。當SD用作為砧木時，對接穗的鐵營養供應能力可能并不一定低于HD，所以還需進一步通過砧木嫁接試驗來評價其在新的嫁接復合體中對鐵元素的吸收和向上供應的能力。

一般情況下，土壤中鐵元素主要以生物有效性低的Fe³⁺形式存在，尤其是在較高的pH和碳酸鹽含量的土壤中，鐵的溶解度嚴重降低[30]，杜梨作為雙子葉植物，主要運用策略Ⅰ[31]來進行鐵元素的轉運吸收。因此在吸收環境中的鐵元素時，首先通過根尖分泌質子和有機酸，利用Fe^3＋還原酶將Fe³⁺還原成Fe²⁺，然后轉運到地上部[32-33]。當出現缺鐵逆境時，根際酸化能力和Fe^3＋還原酶活性等生理響應程度可作為衡量植物耐缺鐵能力的重要依據[34]，在根際酸化能力和Fe^3＋還原酶活性，HD表現最強，這也可能是相同條件下黃化程度輕的原因之一。活性鐵和全鐵含量可以直接反映樹體對缺鐵響應能力的大小[35-36]，缺鐵會引起根、莖、葉各器官中的活性鐵和全鐵含量不均衡的降低，筆者在本研究中發現HD根和莖的全鐵含量和活性鐵含量均要顯著高于SD和GD，表明HD對鐵的吸收和運輸能力均強于SD 和GD。綜合考慮，3 種不同生態型的杜梨對鐵缺乏的生理響應能力為HD＞SD＞GD。

植株缺鐵時，還會影響氮、磷、鉀和其他礦質元素的吸收[37-39]，氮素是果樹必需的大量營養元素之一，果樹缺氮會造成葉片失綠，凈光合能力下降，影響果實質量和產量[40]，本研究結果表明杜梨幼苗各器官的氮、鐵元素含量具有協同作用，氮元素含量會隨著活性鐵和全鐵含量的下降而下降，其中SD 根部的氮吸收和葉的氮代謝利用能力及HD莖的氮運輸能力受缺鐵影響較小。磷與碳水化合物和脂肪蛋白質的合成、轉運有關，缺磷影響地上部的生長，導致葉片疏小，葉色褐黃至紫色[41]。筆者在本研究中發現缺鐵會降低植株對磷元素的吸收，進而加重缺鐵對植株的不利影響，磷元素含量受缺鐵影響最大的是SD，GD次之，HD最小。鉀元素參與了植物體內多種酶的活化及滲透調節[42-43]，缺鐵會引起杜梨莖和葉中鉀元素含量出現不同程度的增加，這種現象在番茄中也有類似的報道[44]，但不同生態型的杜梨各組織器官受影響的程度不同，因此，鐵和其他礦質營養元素之間協同作用的差異可能也是其耐缺鐵性不同的原因之一。

4 結論

不同生態型杜梨缺鐵脅迫生理響應及耐缺鐵性存在較大差異，缺鐵條件下甘肅杜梨的葉片黃化程度最高，山東杜梨次之，河南杜梨最低，缺鐵使葉片凈光合能力下降程度最大的是甘肅杜梨，河南杜梨的根際酸化能力和Fe³⁺還原酶活性最高，根系生長能力最強，活性鐵和全鐵含量最高，對氮、磷、鉀元素的吸收影響最小，根部活性鐵和全鐵積累量以山東杜梨最高，不同生態型杜梨對缺鐵脅迫生理響應敏感性不同，綜合不同生態型杜梨本身生長勢及對缺鐵的響應，認為河南杜梨和山東杜梨的耐缺鐵性優于甘肅杜梨。