番木瓜均質胚性細胞懸浮系的建立和高效植株再生

關鍵詞：番木瓜；未成熟合子胚；胚性細胞懸浮系；體細胞胚發生；植株再生

中圖分類號：S667.9 文獻標志碼：A 文章編號：1009-9980（2023）02-0376-10

番木瓜（Carica papaya L.）是廣泛分布于全球熱帶亞熱帶區域的重要果樹，具有豐富的營養價值和藥用價值[1]，被世界衛生組織列為最有營養價值的十大水果之首[2]。隨著消費者對番木瓜認識的提高、消費者保健意識的增強以及番木瓜儲存運輸技術的發展進步，番木瓜逐漸受到廣大消費者的青睞，成為在中國農業品種結構調整和鄉村振興中發揮重要作用的經濟作物[3-4]。然而，番木瓜環斑花葉病毒?。≒apaya ringspot virus，PRSV）嚴重限制了番木瓜產業的發展，其抗病品種的培育成為產業發展的關鍵[5]。可食用番木瓜抗病資源匱乏，栽培種遺傳基礎狹窄，通過傳統的雜交育種難以培育出抗病品種[5-6]；而分子育種技術則可有效地改良品種的抗病性，對PRSV 具有高抗性的華農1 號已成功培育并在我國釋放種植[7]。

建立高效植株再生技術體系是番木瓜分子育種技術研發的基礎。前人曾較多地報道直接利用番木瓜胚性愈傷組織誘導體細胞胚發生并獲得植株再生[8-13]，但該途徑存在基因型依賴、體細胞胚發育不同步、胚根端愈傷化導致生根質量差、體細胞胚發生率和植株再生率低等問題[14]，這些限制了轉基因技術的廣泛應用?；诖?，筆者在本研究中旨在建立一種基于胚性細胞懸浮培養的高效植株再生技術體系，提高體細胞胚發生和發育的同步性及其植株再生率，以期為番木瓜大量離體快繁、細胞工程育種和分子育種提供技術支撐。

1 材料和方法

1.1 材料

以廣東省農業科學院果樹研究所番木瓜種質資源圃中紫暉品種為試驗材料，該品種具有豐產、優質且適應性強等特性[15]。定植時采用組織培養兩性株種苗，采用常規管理辦法，植株生長正常。

1.2 外植體的選擇與處理

選擇生長勢旺盛的健康植株，掛牌標記兩性花開花日期。取開花坐果后110～120 d 的果實，參照魏岳榮等[4]的方法對果實進行表面消毒，縱向切開后收集種子，分離未成熟合子胚作為外植體。

1.3 愈傷組織誘導

將外植體接種于裝有30 mL愈傷組織誘導培養基（MCI）的100 mL 錐形瓶中，在（27±1）℃下暗培養。MCI基本組成為：1/2 MS培養基+400 mg·L^-1谷氨酰胺+ 60 g·L^-1蔗糖+ 7 g·L^-1瓊脂粉，pH值5.8。為觀察2，4-二氯苯氧乙酸（2，4-Dichlorophenoxyaceticacid，2，4-D）質量濃度對愈傷組織誘導的影響，本試驗共設1、2、3、4 和5 mg·L^-1共5 個2，4-D質量濃度處理，以不添加2，4-D為對照。每個處理接種5 瓶，每瓶接種外植體7 個，3 次重復。培養60 d 后，統計愈傷組織和胚性愈傷組織誘導率。

1.4 胚性愈傷組織的增殖培養

挑選松散易碎的淺黃色胚性愈傷組織團進行繼代培養，繼代培養基為MCI基本培養基，并根據1.3胚性愈傷組織誘導率統計結果添加適宜質量濃度的2，4-D，培養條件與1.3 相同。繼代時剔除褐化、致密組織和非胚性愈傷組織，繼代周期為28～30 d。

1.5 胚性愈傷組織的液體培養、篩選和均質胚性細胞懸浮系的建立

取優質胚性愈傷組織約2 g，加入到裝有30 mL液體培養基（ML）的100 mL 錐形瓶中，在黑暗條件下，（27±1）℃、110 r ·min^-1振蕩培養。ML組成為胚性愈傷組織繼代增殖培養基成分去除瓊脂粉，pH值5.8。初次懸浮培養7 d 后，參照魏岳榮等[16]的方法對培養物進行篩選和繼代培養，濾除大顆粒愈傷組織、細胞團和體細胞胚，直至獲得細胞分散且穩定增殖的均質胚性細胞懸浮系（embryogenic cell system，ECS）。后期ECS 繼代過程中，每次取5 mL ECS 加入25 mL新鮮培養基中，繼代周期為21 d。

1.6 體細胞胚的誘導和成熟培養

取繼代培養后第10 天的ECS 5 mL，靜置后去除培養液，加入體細胞胚誘導培養基（MSI） 30 mL，MSI 組成為1/2 MS鹽+MS維生素+50 mg·L^-1肌醇+400 mg·L^-1 谷氨酰胺+30 g ·L^-1 蔗糖，pH 值5.8，110r ·min^-1振蕩培養21 d。將誘導的體細胞胚轉移至裝有20 mL體細胞胚成熟培養基（MSM）、表面鋪有一層濾紙的培養皿（直徑9.0 cm） 內，在（27±1）℃、黑暗條件下培養30～45 d，期間每15 d 更新一次培養基。MSM組成為MSI +5 g·L-1活性炭（activated carbon，AC）+4.0 g·L^-1凝膠，pH值5.8。

1.7 體細胞胚的萌發和生根培養

挑選發育正常的子葉期體細胞胚，在加有萌發培養基（MG）的培養皿（直徑9.0 cm）中萌發培養。MG基本組成為MS+30 g·L^-1蔗糖+7 g·L^-1瓊脂粉，pH值5.8。為觀察6-芐基氨基嘌呤（6-Benzylaminopurine，6-BA）、萘乙酸（1-naphthlcetic acid，NAA）和AC組合對體細胞胚萌發和生根的影響，試驗共設MG1（0.4 mg · L^-1 6-BA+0.02 mg · L^{- 1} NAA）、MG2（0.1 mg · L^-1 6-BA+0.1 mg · L^-1 NAA+5 g · L^-1AC）、MG3（0.4 mg · L^-1 6-BA+0.02 mg·L^-1 NAA+5g·L^-1 AC）、MG4（0.4 mg·L^-1 6-BA+0.2 mg·L^-1 NAA+5 g ·L^-1 AC）、MG5（0.1 mg·L^-1 NAA+5 g ·L^-1 AC）和MSM共6 個處理，在（27±1）℃、12 h/12 h 光周期條件下培養，光照度54 μmol·m^-2 · s^-1。培養21 d 后統計體細胞胚萌發率、生根率、同步萌發和生根率及愈傷化比率。

1.8 植株再生和馴化培養

挑選正常萌發和生根的體細胞胚，轉移到植株再生培養基（MR）促進地上部和根系發育。MR組成為1/2 MS+0.1 mg·L^-1 6-BA+2 mg·L^-1吲哚丁酸（3-Indolebutyric acid，IBA）+10 g·L^-1活性炭+30 mg·L^-1蔗糖+7 g ·L^{- 1} 瓊脂粉，pH 值5.8，培養條件與1.7 相同。30 d 后統計植株再生率。輕輕拔出再生小植株，移栽到含有2/3 泥炭土+1/3 蛭石（體積分數）的基質營養杯中，在溫室大棚中進行馴化培養45～60 d，當植株生長發育至15 cm后即可移植到田間生長。

1.9 統計分析

各試驗處理均設置3 次重復，使用SPSS 15.0 軟件進行數據分析。采用Duncan’s 多重比較法進行差異顯著性測驗。

2 結果與分析

2.1 外植體未成熟合子胚的分離獲取

本試驗以紫暉坐果后110～120 d 果實種子（圖1-A）的合子胚為外植體進行愈傷組織誘導。觀察發現，110～120 d 齡果實種子為未成熟種子，外層為白色肉質外種皮，內層中種皮仍為白色，尚未硬化。將種子置于超靜工作臺面的無菌濾紙中央，剝離外種皮后，以手術刀背面按壓種子中部，使內層種皮輕微破裂，然后輕輕按壓種子基部至中部，即可擠壓分離出完整的未成熟合子胚（圖1-B）。

2.2 愈傷組織誘導

接種至愈傷組織誘導培養基3 d 后，未成熟合子胚開始膨大。15 d 后，含有2，4-D的所有處理中未成熟合子胚開始愈傷組織分化，不含2，4-D的對照處理則未見愈傷組織形成。在愈傷組織誘導過程中，可觀察到淺褐色海綿狀愈傷組織（圖1-C a）、白色粉狀愈傷組織（圖1-C b）、淺黃色透明狀愈傷組織（圖1-D）和淺黃色松散易碎的胚性愈傷組織（圖1-E）。隨著培養時間的延長，部分胚性愈傷組織表面可觀察到叢狀體細胞胚（圖1-E a）的發生。

誘導培養60 d 后，統計愈傷組織和胚性愈傷組織誘導率。結果表明，1 mg·L^-1 2，4-D 處理愈傷組織誘導率為41.90%，2～5 mg·L^-1 2，4-D 處理均能誘導50%以上未成熟合子胚形成愈傷組織，其中4 mg·L^-12，4-D處理可獲得92.38%的最高愈傷組織誘導率。就胚性愈傷組織誘導率而言，4 mg·L^-1 2，4-D 處理效果最好，可達62.86%；其次為3 mg · L^-1 2，4-D 處理，兩者無顯著差異。當2，4-D 質量濃度增加至5 mg · L^{- 1} 時，胚性愈傷組織誘導率下降至38.10%（表1）。

2.3 胚性愈傷組織的增殖培養

為提高胚性愈傷組織質量，增加胚性愈傷組織數量，挑取胚性愈傷組織團，剔除褐化組織及非胚性愈傷組織，轉移至含4 mg·L^-1 2，4-D的MCI培養基中進行增殖培養。3 個繼代周期后可獲得大量松散易碎的優質胚性愈傷組織（圖1-F）。

2.4 胚性愈傷組織的液體培養、篩選和均質胚性細胞懸浮系的建立

優質胚性愈傷組織被轉移至液體培養基后，在搖床的振蕩作用下，愈傷組織團較易散開，無褐化現象。繼代過程中，使用不同孔徑的篩網濾除體積較大的愈傷組織團塊、大細胞團和已形成的體細胞胚等培養物。5 個繼代周期后，可獲得由大量單細胞和小細胞團組成的均質的胚性細胞懸浮系（圖2-A～B）。

2.5 體細胞胚的誘導和成熟培養

均質胚性細胞在液體體細胞胚誘導培養基中經1 個繼代周期（21 d）的培養后，可形成大量球形胚（圖2-C）。將球形胚轉移到含有5 g·L^-1 AC的半固體體細胞胚成熟培養基培養30～45 d（圖2-D），可逐步發育為成熟的子葉期體細胞胚（圖2-E），該過程中體細胞胚發生和發育的同步性較好。

2.6 體細胞胚的萌發和生根培養

挑選成熟的子葉期體細胞胚接種于含0.4 mg·L^-16-BA+0.02 mg·L^-1 NAA體細胞胚萌發培養基MG1中培養（圖3-A），3 d 后可見體細胞胚開始萌發，7 d后可見到萌發的綠色子葉（圖3-B），同時體細胞胚根端開始出現愈傷化。培養21 d 后，萌發的體細胞胚已具備完整的下胚軸、子葉和芽（圖3-C），萌發率97.58%，但胚根端愈傷化嚴重，愈傷化比率為95.48%，有少量生根，同步生根率為18.18%（表2），根系數量少且質量差。該途徑萌發的芽可用于增殖，但均表現出基部愈傷化（圖3-D），生根難度大。

基于此，為改善番木瓜體細胞胚的萌發和生根質量，筆者在本試驗中比較了不同質量濃度6-BA和NAA組合及AC的作用效果（表2）。結果表明，與MG1 培養基比較而言，5 g·L^-1活性炭的添加，可有效促進成熟的子葉期體細胞胚萌發和生根同步進行，同時顯著降低愈傷化程度。MG2（圖3-E）、MG3（圖3-F）、MG4（圖3-G）和MG5（圖3-H）培養基中體細胞胚的同步萌發和生根率分別為80.47%、92.62%、84.05%和66.19%，愈傷化比率分別為55.95%、33.10%、74.76%和66.43%（表2），其中含0.4 mg·L^-1 6-BA+0.02 mg·L^-1 NAA+5 g·L^-1 AC的MG3 培養基促體細胞胚萌發和生根效果最佳。綜合以上結果分析，不同質量濃度的6-BA和NAA的添加會導致萌發體細胞胚根端及根系的愈傷化，而AC的添加可顯著降低愈傷化程度。

將成熟的子葉期體細胞胚接種于含5 g·L-1活性炭的不含任何激素的MSM培養基中培養（圖3-I），3 d 后即可見到體細胞胚下胚軸膨大伸長和基部生根，5 d 后根部出現大量根毛（圖3-J），14 d 后體細胞胚萌發率為97.86%（ 圖3- K），同步生根率為88.33%，其中已萌發但未能生根的體細胞胚基部表現為輕度愈傷化，愈傷化比率為11.67%（表2）。培養21 d 后，萌發生根的體細胞胚表現為下胚軸伸長、根系伸長且數量增加，未見愈傷化比率升高情況出現（圖3-L）。

2.7 植株再生和馴化

將萌發和生根的體細胞胚移植到含0.1 mg·L^-1 6-BA+2 mg·L^-1 IBA+10 g·L^-1AC的植株再生培養基培養30 d 后，可獲得具有6～8 枚錐形小葉、根系發育良好的健康植株（圖4-A～B），植株再生率為81.36%。將上述植株輕輕拔出并清洗干凈根系附帶瓊脂，移植到透氣基質中，在前期加強保濕的情況下，經45～60 d 馴化培養，可獲得具8～10 枚真葉的種苗（圖4-C），并移植到田間進行性狀觀察。

3 討論

3.1 番木瓜未成熟合子胚的有效分離獲取及其胚性發生效果

番木瓜未成熟合子胚體積較小，長約3 mm，常規分離方法是在體視顯微鏡的輔助下進行剝離，操作難度較大，速度慢，效率低，且合子胚完整性差。筆者在本試驗中采用肉眼分離法，通過擠壓方式可有效分離獲取未成熟合子胚。該方法無需體視顯微鏡的輔助，簡單易操作，速度快，且分離的合子胚完整性好，可大大提高工作效率。

由體細胞啟動間接器官發生的過程包括胚性誘導和形態建成2 個階段，其中體細胞脫分化形成胚性愈傷組織的誘導階段非常關鍵，直接決定了后期形態建成和植株再生的成敗與效率，而胚性愈傷組織的誘導跟外植體材料密切相關。自1980 年Litz等[17]開展番木瓜體細胞胚性誘導研究以來，使用的外植體類型包括子葉[9，11，18- 19]、下胚軸[12- 13，19- 21]、葉片[18-19，22]、葉柄[22]、莖尖[11，18]、莖段[18，23]、幼根[18，23-24]、胚珠[25-26]、合子胚等[4，8-10，12，14，19，27-29]。綜合文獻結果及項目組前期研究數據（未公開發表）分析，以子葉、葉片、葉柄、莖和根為外植體時，愈傷組織誘導率可達50%～95%，但胚性愈傷組織誘導率低，體細胞胚發生能力較弱，且不同基因型材料之間差異顯著；而下胚軸、胚珠、合子胚則具有較高的胚性發生潛力，胚性愈傷組織誘導率可達到30%～77.5%，體細胞胚形成效果好，植株再生率高。被利用的合子胚可分為90～120 d 果實未成熟合子胚和成熟合子胚2 種，綜合比較而言，本試驗采用的110～120 d 的未成熟合子胚胚性誘導效果更佳，是番木瓜間接器官發生和高效植株再生的理想外植體材料。

3.2 不同質量濃度2，4-D對番木瓜未成熟合子胚胚性誘導的影響

體細胞脫分化受多種物理和化學因素的影響，其中生長素在體細胞向胚性狀態的轉變過程中起著重要作用，通過染色質修飾和激活特定轉錄因子來誘導相關基因表達[30-32]。就番木瓜胚性誘導而言，前人曾報道2，4-D是最佳化合物[8]，并在后續相關研究中被廣泛應用[9-13，27]?；诟鞣N試驗材料的基因型、外植體類型、外源植物生長調節劑組合效果等差異，2，4-D處理質量濃度介于1～10 mg·L^-1之間，胚性愈傷組織誘導效果差異顯著。其中以10 mg·L^-1 2，4-D +250 mg·L-1 Carbenicillin 處理馬來西亞番木瓜品種Eksotika 90～100 d 齡果實合子胚，胚性愈傷組織誘導率最高可達到77.5%[27]。本試驗中，以自主選育番木瓜新品種紫暉為試驗材料，利用110～120 d 齡果實的未成熟合子胚為外植體，在不添加其他植物生長調節劑的情況下，1～5 mg·L^-1 2，4-D處理均能誘導形成胚性愈傷組織，其中4 mg·L^-1 2，4-D 處理效果最佳，能誘導62.33%的外植體獲得質量良好的淺黃色、松散易碎型胚性愈傷組織。鑒于胚性誘導階段2，4-D的添加可能會導致體細胞胚異常和無性系變異的發生[17，30]，在實際應用中，不同品種和試驗體系中2，4-D處理質量濃度與無性系變異發生之間的關系仍需驗證，應根據具體試驗目的進行綜合考慮和選擇。

3.3 番木瓜均質胚性細胞懸浮系建立的作用與重要性

誘導獲得的淺黃色、松散易碎型胚性愈傷組織可在固體培養基中得到有效增殖，生長速度適中。隨著繼代時間的延長，在胚性愈傷組織表面可形成叢生狀體細胞胚。在筆者及前人的研究中，通常直接利用胚性愈傷組織進行體細胞胚的誘導和成熟培養，從而獲得植株再生，但該途徑均表現出體細胞胚發育不同步、植株再生率低的特點[4，11-12]。ECS 具有增殖率高、培養物同步的優勢[33]，本試驗經5 次繼代篩選培養后，可建立由生理狀態較一致的單細胞和小細胞團富集組成的均質ECS，體細胞胚誘導和成熟同步性好，可同時獲得大量發育成熟的子葉形體細胞胚，為后續體細胞胚的同步萌發和生根奠定了基礎。因此，均質ECS的建立成為番木瓜高效植株再生技術的關鍵。

3.4 番木瓜體細胞胚萌發和生根的同步化培養

目前番木瓜間接器官發生過程通常是先誘導成熟體細胞胚萌發，然后再誘導生根。在體細胞胚萌發過程中，往往添加6-BA、NAA等一些生長調節劑來促進萌發[8，25]。然而，目前的技術體系中最大的瓶頸在于萌發的體細胞胚胚根端極易出現愈傷化，并抑制有效根系的形成[10]。這是因為番木瓜組織培養過程中對生長素類物質極為敏感[34]，體細胞胚具有結合生長素的能力，這些生長素在隨后的分化過程中排入培養基，從而產生愈傷組織[35]。本試驗體系進一步驗證了該問題的存在，0.4 mg·L^-1 6-BA+0.02 mg·L^-1NAA組合在促進97.73%體細胞胚萌發的同時，導致95.45%的體細胞胚根端出現愈傷化，有效根系少，大大降低了植株再生率和存活率。補充添加5 g·L^-1AC則可有效促進93.33%體細胞胚萌發和生根同步進行，同時顯著降低愈傷化比率至33.37%。同時，筆者在本研究中發現，成熟的子葉期體細胞胚在含有5 g·L^-1 AC、不添加任何植物生長調節劑的體細胞胚成熟培養基中可實現同步萌發和生根，同步萌發和生根率可達88.53%，且愈傷化程度輕，愈傷化比率僅11.47%。由此可見，就番木瓜發育成熟的子葉期體細胞胚的萌發和生根而言，6-BA和NAA并非必需因素。AC對番木瓜體細胞胚萌發和生根的積極效果與在櫟樹、衛矛上的報道相似[36- 37]，這可能與AC具有吸附發育組織釋放的生長素類物質和次級代謝產物的作用密切相關[38-40]。

4 結論

以紫暉110～120 d 未成熟合子胚為外植體，最佳的胚性愈傷組織誘導培養基為1/2 MS 培養基+4 mg · L^-1 2，4-D+400 mg·L^-1谷氨酰胺+ 60 g ·L^-1蔗糖。經5 次繼代篩選培養后，可建立由生理狀態較一致的單細胞和小細胞團富集組成的均質ECS。最優體細胞胚發生方案為ECS 經液體培養方式誘導球形胚形成，在含1/2 MS鹽+MS維生素+50 mg·L^-1肌醇+400 mg·L^{- 1} 谷氨酰胺+30 g ·L^{- 1} 蔗糖+5 g ·L^{- 1}AC的培養基中促進體細胞胚的成熟及后續的同步萌發和生根，可有效緩解胚根端愈傷化現象。