免疫分析技術(shù)在農(nóng)藥殘留快速檢測(cè)中的應(yīng)用及研究進(jìn)展

唐 牧 邵 丹

（新疆石河子市疾病預(yù)防控制中心，新疆 石河子 832000）

農(nóng)作物中的農(nóng)藥殘留會(huì)直接通過食物進(jìn)入到人體內(nèi)，在環(huán)境中殘留的農(nóng)藥會(huì)被動(dòng)地被植物吸附，然后通過食物鏈漸漸地進(jìn)入到人體內(nèi)。長期的農(nóng)藥殘留會(huì)對(duì)人體健康帶來負(fù)面影響，甚至直接破壞生態(tài)環(huán)境，影響到我國的出口經(jīng)濟(jì)，對(duì)中國社會(huì)發(fā)展也會(huì)造成巨大損失。為此，當(dāng)前利用免疫分析技術(shù)對(duì)農(nóng)藥殘留快速進(jìn)行檢測(cè)，能夠幫助我國社會(huì)提高發(fā)展的整體速度。

1.免疫分析技術(shù)中抗原和抗體

在選擇免疫分析技術(shù)時(shí)，首先要考慮到是抗原和抗體的制備技術(shù)。免疫分析技術(shù)一直以來都是以抗原、抗體的特異性結(jié)合作為基礎(chǔ)，抗原、抗體的制備質(zhì)量可謂是免疫分析過程中的關(guān)鍵和基礎(chǔ)步驟。

1.1 抗原的制備

在進(jìn)行抗原制備過程中，其主要是由于農(nóng)藥小分子與大分子物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)。通過反應(yīng)才能夠激發(fā)動(dòng)物產(chǎn)生抗體的產(chǎn)生，進(jìn)而測(cè)量農(nóng)藥。但是在進(jìn)行農(nóng)藥小分子測(cè)量過程中，需要確保小分子能夠與大分子物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)，具有活性基團(tuán)，只有該基團(tuán)能夠始終保持著待測(cè)量物品的空間構(gòu)型和電子分布半抗原，才能夠確保在實(shí)際進(jìn)行反應(yīng)過程中，反應(yīng)質(zhì)量得到提升。在這個(gè)過程中需要考慮到理想的半抗原大多數(shù)情況下具備待測(cè)動(dòng)物的結(jié)構(gòu)特征。特別是待測(cè)動(dòng)物的立體化學(xué)特征，而另外一方面理想半抗原與載體蛋白進(jìn)行連接之后，能夠保證半抗原特征結(jié)構(gòu)最大限度地被免疫活性細(xì)胞識(shí)別和結(jié)合，同時(shí)也能夠展現(xiàn)出抗原決定簇，更可以根據(jù)不同農(nóng)藥的實(shí)際需求，制備更加具有預(yù)期性和親和性的抗體。包被原免疫原結(jié)構(gòu)會(huì)對(duì)免疫分析特征性和靈敏性產(chǎn)生一定的影響，為此，在進(jìn)行抗原的制備過程中，應(yīng)做到針對(duì)一種分析目標(biāo)，最好使用不同的半抗原以及不同的免疫檢測(cè)方法進(jìn)行檢測(cè)，能夠提高檢測(cè)效果，同時(shí)也可以實(shí)現(xiàn)與載體蛋白的偶聯(lián)，減少在免疫分析過程中存在的誤差。做到橋與長臂的抗體與包被原的特異性結(jié)合，提高結(jié)合的質(zhì)量并且增強(qiáng)免疫分析技術(shù)的特異性以及靈敏性。

1.2 抗體的制備

在抗體的制備過程中則需要考慮到不同階段，分別是多克隆抗體階段、單克隆抗體階段以及基因工程抗體階段。

分析多克隆抗體階段時(shí)，應(yīng)考慮到多克隆抗體階段，主要是來源于免疫動(dòng)物直接產(chǎn)生的，這是免疫分析過程中最簡單并且應(yīng)用時(shí)間長的一種抗體制備方法。單克隆抗體在進(jìn)行制備的過程中，其主要利用的是免疫小鼠的脾細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行融合，能夠篩選出穩(wěn)定分泌目標(biāo)物抗體的細(xì)胞株，并且通過該細(xì)胞中進(jìn)行開發(fā)。多克隆抗體和單克隆抗體相比較而言，單克隆抗體具有的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)在于可以無限量地去生產(chǎn)抗體，而多克隆抗體在使用過程中即便是針對(duì)同一只動(dòng)物，由于采血的批次不同，動(dòng)物中的抗血清存在著明顯的差異性。根據(jù)近幾年世界各地對(duì)于農(nóng)藥殘留快速檢測(cè)分析報(bào)告中進(jìn)行分析，可以能發(fā)現(xiàn)單克隆抗體所占比例在逐年增加，但是無論是選擇多克隆抗體的制備方式或是單克隆抗體的制備方式，其均存在著一個(gè)問題，就是所需要消耗的制備時(shí)間較長，并且費(fèi)用較高，基因工程抗體工程應(yīng)用的方式是利用DNA技術(shù)對(duì)其進(jìn)行重組，通過基因突變以此來改造某一種抗體的基因序列編碼，在自然界中可以制造出更多原本在自然界中不存在的蛋白質(zhì)分子，通過重組抗體技術(shù)，例如噬菌體的顯示發(fā)展，能夠?qū)崿F(xiàn)克隆生產(chǎn)抗體一目標(biāo)，而這些片段本身具有完整的抗體功能，并且能夠在生長繁殖迅速的大腸桿菌中進(jìn)行表達(dá)，其直接縮短了制備抗體所需要消耗的時(shí)間。利在當(dāng)前的基因抗體工程應(yīng)用過程中最常見的抗體片段包括了。Scfv、fab與完整的LgG分子相比較而言，Scfv、fab片段本身的特異性更高，而重組抗體的存在不僅僅加速了不依賴于動(dòng)物抗體的發(fā)展，同時(shí)在農(nóng)藥材料分析領(lǐng)域發(fā)展速度越來越快，并且得到良好的應(yīng)用以及分析效果。

2.免疫分析技術(shù)在農(nóng)藥殘留快速檢測(cè)中的應(yīng)用

2.1 化學(xué)發(fā)光免疫分析方法

在分析化學(xué)發(fā)光免疫分析方法時(shí)發(fā)現(xiàn)，其主要包括了以下兩種不同的方式：

2.1.1 化學(xué)發(fā)光免疫分析法

化學(xué)發(fā)光免疫分析也稱CLIA法，其主要的原理是利用在抗體或者是抗原上進(jìn)行標(biāo)記化學(xué)發(fā)光劑，進(jìn)而形成的特異性免疫反應(yīng)。在后續(xù)進(jìn)行農(nóng)藥檢測(cè)的過程中，其主要是通過獲取已經(jīng)完成標(biāo)記的分子，對(duì)其進(jìn)行化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，并分析在整個(gè)反應(yīng)的過程中，所展現(xiàn)的化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度，根據(jù)強(qiáng)度推斷在本次樣品中被標(biāo)記抗體或者是抗原本身的含量。在實(shí)際檢測(cè)的過程中，能發(fā)現(xiàn)其中包括的、常用的化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物為以下幾種分別是：魯米諾、異魯米諾以及其衍生物、氨丁基乙基異魯米諾、氨己基乙基異魯米諾、鄰苯三酚和吖啶酯類等等。

2.1.2 化學(xué)發(fā)光免疫分析法的優(yōu)、缺點(diǎn)

在使用化學(xué)發(fā)光免疫分析法時(shí)，發(fā)現(xiàn)該方法具有以下幾種不同的優(yōu)點(diǎn)，分別是：第一，使用這種方式其檢測(cè)的結(jié)果具有極強(qiáng)的準(zhǔn)確性并且整體的精密度高，檢測(cè)結(jié)果可以和放射免疫分析法即RIA相媲美；第二，化學(xué)發(fā)光免疫分析法靈敏度高，在使用的過程中，其反應(yīng)速度較快，甚至超越RIA分析法；第三，整體消耗的檢測(cè)時(shí)間較短；第四，在實(shí)驗(yàn)反應(yīng)的過程中，所有使用的試劑均處于無毒性，并且整體的性質(zhì)十分地穩(wěn)定；第五，本次實(shí)驗(yàn)的過程中，可以在短時(shí)間內(nèi)實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化測(cè)定；第六，該方法的適用性廣。但是化學(xué)發(fā)光免疫分析法也存在一定的缺點(diǎn)，其中包括了以下幾點(diǎn)：第一，抗原或者是抗體在被標(biāo)記過發(fā)光物質(zhì)后，會(huì)直接改變?cè)撐矬w的免疫反應(yīng)性能，并且使用該發(fā)光劑進(jìn)行標(biāo)記的過程中，其標(biāo)記率重現(xiàn)性較差。

2.1.3 化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫分析法

化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫分析法是基于傳統(tǒng)的酶聯(lián)免疫分析進(jìn)行改進(jìn)的一種方式，在傳統(tǒng)的檢測(cè)過程中，其酶的活性一般情況下是通過熒光法或催化光度法進(jìn)行檢測(cè)。但是隨著時(shí)代的不斷發(fā)展，近幾年我國科學(xué)發(fā)展速度越來越快，人們開始選擇利用化學(xué)發(fā)光反應(yīng)法來檢測(cè)酶的活性。從標(biāo)記免疫測(cè)定方式進(jìn)行分析，能發(fā)現(xiàn)在選擇化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫分析法即CLEIA，該方法本身屬于酶免疫的測(cè)定范疇，在檢測(cè)的工程中，其限低至10-17 mol／L，并且靈敏度較高，優(yōu)于傳統(tǒng)的放射免疫分析法。化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫分析法與傳統(tǒng)的酶聯(lián)免疫分析相比，使用CLEIA法進(jìn)行化學(xué)發(fā)光檢測(cè)酶活性其并不是通過熒光法或催化光度法測(cè)定，能提高檢測(cè)的整體效果和質(zhì)量。除此之外，在檢測(cè)的過程中，某些特殊的金屬配合物可催化魯米諾進(jìn)行化學(xué)發(fā)光反應(yīng)。外國學(xué)者M(jìn)uhammad等人曾利用Co（Ⅱ）和Fe（Ⅱ）的配合物代替酶作為抗原（或者是抗體）的標(biāo)記物，以此實(shí)現(xiàn)化學(xué)發(fā)光免疫分析，最終獲得了成功。

2.1.4 化學(xué)發(fā)光免疫分析方法的發(fā)展趨勢(shì)

近幾年，我國的社會(huì)發(fā)展速度越來越快，其中化學(xué)發(fā)光免疫分析方法的發(fā)展速度同樣加快，由于這種檢測(cè)方式本身具有極強(qiáng)的優(yōu)勢(shì)。為此，在食品安全等各個(gè)不同的領(lǐng)域取得了廣泛的應(yīng)用優(yōu)勢(shì)，但是這種方法在應(yīng)用過程中并不是完全沒有缺點(diǎn)的，其中包括了以下幾點(diǎn)：第一，選擇該方式時(shí)，所使用的儀器體積較大；第二，在使用的過程中，樣品本身的基質(zhì)對(duì)方法的應(yīng)用效果干擾大；第三，測(cè)定的小分子物質(zhì)精密度較低。為了進(jìn)一步發(fā)展該技術(shù)，需要明確其后續(xù)的研究方式，其中包括了以下幾點(diǎn)：第一，改變儀器的大小，盡可能讓儀器向著微型便捷化發(fā)展；第二，在樣品處理之前，需要提高處理技術(shù)，使得處理技術(shù)達(dá)到更加高效，可以直接降低基質(zhì)的干擾，增強(qiáng)該方法使用過程中的穩(wěn)定性；第三，不斷提高檢測(cè)過程中的整體效率，促進(jìn)CLIA技術(shù)向著多組分檢測(cè)方向進(jìn)行發(fā)展。

2.2 熒光免疫分析

2.2.1 熒光免疫分析技術(shù)的原理

熒光免疫分析是當(dāng)前進(jìn)行農(nóng)藥殘留檢測(cè)過程中常見的檢測(cè)方法之一，這是由于熒光具有敏感可測(cè)性，能夠與抗原、抗體進(jìn)行免疫反應(yīng)，并且能夠?qū)崿F(xiàn)高特異性有機(jī)結(jié)合，在抗體上標(biāo)記熒光素作為跟蹤器來標(biāo)記抗體、抗原以及抗分子本身具有極強(qiáng)的合成性，能夠提高檢測(cè)的整體質(zhì)量。當(dāng)抗體抗原或抗反應(yīng)結(jié)合物被熒光底物進(jìn)行照射時(shí)，無論是藍(lán)光或是紫光，照射底物都會(huì)存在吸收光照，進(jìn)而轉(zhuǎn)化成為激發(fā)態(tài)。激發(fā)態(tài)是一種不穩(wěn)定的狀態(tài)，其又會(huì)重回基態(tài)，而利用電磁輻射所釋放出的一系列被吸收的光能會(huì)在這一階段發(fā)出熒光信號(hào)，進(jìn)而根據(jù)熒光的強(qiáng)度檢測(cè)出農(nóng)藥的濃度曲線，被推斷出該待測(cè)樣品中所含有的農(nóng)藥殘留量。

2.2.2 常見的熒光標(biāo)記物類型

在使用熒光免疫分析技術(shù)時(shí)，需要了解到常見的熒光標(biāo)記物類型有哪些，其中包括了以下幾種：第一，香豆素類標(biāo)記物。這一種標(biāo)記物在使用的過程中，原理是利用底物標(biāo)記的熒光酶聯(lián)合免疫反應(yīng)。在當(dāng)前這一標(biāo)記物使用得十分廣泛，而其中最為典型的香豆素類標(biāo)記物為傘形酮。第二，熒光素標(biāo)記物。熒光素標(biāo)記物在使用的過程中，其優(yōu)勢(shì)在于本身具有非常高的熒光量子產(chǎn)率，以及在進(jìn)行反應(yīng)過程中摩爾吸光系數(shù)較高，屬于常見的熒光標(biāo)記物，但是這一種標(biāo)記物在使用的過程中存在著一個(gè)明顯的缺點(diǎn)，就是熒光素的熒光發(fā)射光譜會(huì)直接與膽紅素重疊，如果該檢測(cè)物品中存在大量的膽紅素，會(huì)對(duì)免疫反應(yīng)產(chǎn)生極為嚴(yán)重的干擾。

2.2.3 均相熒光免疫分析

均相熒光免疫分析是指在抗體、抗原反應(yīng)結(jié)束之后，對(duì)已經(jīng)結(jié)合和沒有結(jié)合的標(biāo)記物，并不需要進(jìn)行分離，可以直接進(jìn)行測(cè)量，例如通過熒光的吸收，激發(fā)，淬滅等特性獲得實(shí)驗(yàn)結(jié)果。當(dāng)前均相熒光免疫分析技術(shù)使用的頻率較高，而其中典型的分析方法如下：第一，利用熒光猝滅免疫分析，其中熒光素標(biāo)記的抗原可以用作跟蹤試劑，其中特異性抗體和被分析物與跟蹤試劑結(jié)合后，并不會(huì)對(duì)跟蹤器的熒光帶來負(fù)面影響。在免疫反應(yīng)結(jié)束之后加入熒光素抗體能夠在第一時(shí)間內(nèi)將游離太與試劑進(jìn)行結(jié)合，在結(jié)合后則會(huì)實(shí)現(xiàn)熒光淬滅空間。但是由于空間阻礙會(huì)導(dǎo)致抗體結(jié)合過程中的跟蹤劑無法完全結(jié)合熒光素抗體。為此，在使用這種方法時(shí)，熒光會(huì)隨樣品濃度增加而減弱，如果不考慮熒光猝滅的效率，在使用這一種方法時(shí)，其熒光信號(hào)會(huì)受到實(shí)際樣品中固有的熒光干擾，整個(gè)過程中樣品的檢測(cè)和校驗(yàn)顯得尤為重要。第二，熒光激發(fā)共振能量的免疫分析。

2.2.4 熒光免疫分析技術(shù)的發(fā)展前景

近幾年熒光免疫分析技術(shù)發(fā)展速度迅速，其有效地彌補(bǔ)了傳統(tǒng)免疫分析法中存在的靈敏度較差或是在定量時(shí)相對(duì)困難等一系列問題，但是熒光免疫分析技術(shù)在使用過程中也存在著一定的不足。例如，部分免疫過程其標(biāo)記材料的信號(hào)強(qiáng)度和穩(wěn)定性等有待改善。為此，為了進(jìn)一步地提高熒光免疫分析技術(shù)的使用質(zhì)量，需要做到以下幾點(diǎn)：第一，不斷地創(chuàng)新，并且發(fā)現(xiàn)更多新型的、成本相對(duì)較低的標(biāo)記材料。第二，在拿到樣品后，需要對(duì)樣品進(jìn)行前處理，提高藥品前處理技術(shù)，并且降低干擾機(jī)制，提高運(yùn)用過程中的準(zhǔn)確性。第三，提高檢測(cè)時(shí)的整體效率，能夠促進(jìn)熒光免疫分析技術(shù)，并且實(shí)現(xiàn)多組分的檢測(cè)發(fā)展。第四，對(duì)熒光檢測(cè)分析儀器進(jìn)行改善，實(shí)現(xiàn)智能化發(fā)展，進(jìn)一步提高檢測(cè)過程以及檢測(cè)質(zhì)量，最終實(shí)現(xiàn)檢測(cè)結(jié)果讀取的智能化。

3.免疫分析技術(shù)在農(nóng)藥殘留快速檢測(cè)中的研究展望

3.1 研究中存在的缺陷

在近幾年的發(fā)展過程中，針對(duì)農(nóng)藥殘留快速檢測(cè)這一工作內(nèi)容，免疫分析技術(shù)已經(jīng)成為極為重要的手段之一。但是免疫分析技術(shù)無論是在開發(fā)或是應(yīng)用過程中都受到了一定的限制，這是由于在使用免疫分析技術(shù)時(shí)，其開發(fā)周期相對(duì)較長，并不是所有的農(nóng)藥分子都可以在當(dāng)前選擇免疫分析技術(shù)對(duì)其進(jìn)行應(yīng)用，部分沒有特征結(jié)構(gòu)的農(nóng)藥分子無法根據(jù)其農(nóng)藥狀態(tài)設(shè)計(jì)半抗原，并且由于抗體本身存在的特異性，往往會(huì)出現(xiàn)假陽性的分析結(jié)果，直接誤導(dǎo)檢測(cè)人員，導(dǎo)致檢測(cè)質(zhì)量無法得到提升這一現(xiàn)象屢見不鮮。

3.2 研究方向

針對(duì)免疫分析存在的一系列缺點(diǎn)和不足，需要對(duì)免疫分析的未來發(fā)展方向進(jìn)行探討，其中包括了以下幾點(diǎn)：第一，利用基因重組或者是基因突變的方法，能夠有效地實(shí)現(xiàn)抗體改造，并且更好地對(duì)其載體進(jìn)行溝通和建設(shè)，采用DNA免疫、細(xì)胞免疫等手段，能夠制備出更多具有極強(qiáng)親和力的抗體，逐步增加了免疫分析技術(shù)的整體質(zhì)量，同時(shí)也能夠縮短在整個(gè)免疫過程中所需要消耗的時(shí)間。第二，在多殘留分析方面。有很多學(xué)者提出有部分小分子物質(zhì)在進(jìn)行免疫分析過程中，其存在交叉反應(yīng)。為此，需要利用其反應(yīng)過程中的分析物，以其代謝物的多殘留進(jìn)行分析，提高分析的整體效果，有效地解決免疫分析中多殘留或者是由于反應(yīng)物相同而導(dǎo)致的分析錯(cuò)誤這一問題。利用蛋白芯片技術(shù)，但是蛋白芯片技術(shù)在我國食品分析中應(yīng)用的時(shí)間相對(duì)較晚，近幾年才漸漸地展現(xiàn)出其應(yīng)用價(jià)值，具有極為良好的分析前景。

4.結(jié)語

綜上所述，免疫分析技術(shù)能夠幫助我國進(jìn)一步地進(jìn)行農(nóng)藥檢測(cè)，同時(shí)提高農(nóng)藥檢測(cè)的整體質(zhì)量，為我國經(jīng)濟(jì)發(fā)展、社會(huì)發(fā)展帶來了極為正面的影響，