平痤乳膏制備工藝的優化及其內外合治藥效學考察

張欣榮，胡等慧

（1.河北省中醫院藥劑科 河北 石家莊 050011；2.北京中醫藥大學 北京 102488）

痤瘡是一種慢性炎性皮膚病，是世界上最普遍的十大疾病，其發病率具有地域性、年齡性、種族性等特點。因其發生部位多集中于面部、背部等體表位置，極其影響美觀，不僅對患者的身體造成不適，而且對患者的心理會產生很大影響[1-3]。本次將河北省中醫院的臨床制劑“平痤膏”進一步研發，制備得到平痤乳膏制劑，以便于更好服務于臨床。“平痤”由玫瑰、丹參、茵陳、甘草等藥味組成，作為臨床制劑時，起初是將藥材細粉與凡士林均勻混合制得凡士林膏，該膏雖具有一定療效，但其具有藥效成分溶出不完全，衛生不達標及穩定性差等問題，為了更好地發揮該制劑的療效，在此基礎上將其制備成“平痤凝膠”，雖然一定程度改善了上述缺點，但在臨床使用過程中存在保濕性差等問題。因此本課題在前兩種制劑研究的基礎上進一步改良制成平痤乳膏，并基于中醫基礎理論中的“內治治本，外治治標”及“標本兼治”的原則，將平痤乳膏在外用涂抹的同時，口服載藥粉膠囊，達到標本同治，內外合治的目的，以期為該臨床制劑在痤瘡方面的應用提供新的給藥途徑和理論依據。

1 材料和方法

1.1 儀器設備：C P 2 2 5 D和B S 2 1 0 S型電子天平（Sartorius,Germany）；KQ-5200DE型數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；HH-S8雙列八孔水浴鍋（邢臺德闊機械廠）；粉碎機（永康市鉑歐五金制品有限公司，型號：800Y）、藥篩（德立DOLO，型號：DL-248）、脫毛器（Riwa/雷瓦，型號：RF-770A）酶標儀。

1.2 材料試劑：平痤凡士林膏（自制）、平痤乳膏（自制）；平痤凝膠（自制）；痤瘡軟膏（百花醫藥集團股份有限公司，批號271256）；睪酮酶聯免疫分析試劑盒（北京圣科隆生物科技有限公司，批號L180226658）；雌二醇酶聯免疫分析試劑盒（北京圣科隆生物科技有限公司，批號L180226659）；中性福爾馬林固定液（10%，上海源葉生物科技有限公司）；生理鹽水溶液（自制）。

1.3 動物：S P F級昆明種小鼠，雄性[5周齡，體重（20±5）g，合格證號SCXK9（京）2016-0002，購于北京斯貝福實驗動物科技有限公司]。

1.4 方法

1.4.1 凡士林膏的制備：按處方量，稱取各中藥材適量，打粉，過100篩；取凡士林適量60℃加熱融化，按藥材粉與凡士林2:1原則，將上述兩者攪拌混合均勻，即得載藥凡士林膏[4-5]。

1.4.2 平痤凝膠的制備

1.4.2.1 中藥提取濃縮液的制備：中藥粉末過80目篩，加8倍量90%乙醇，冷浸72 h，過濾；藥渣加6倍量90%乙醇冷浸兩次，每次48 h，過濾。合并3次濾液，回收乙醇得中藥提取濃縮液。

1.4.2.2 平痤凝膠的制備：稱取一定量的羥丙基甲基纖維素使其濃度為5%，放置4℃充分溶脹，于24 h后取出，依次加入處方量丙二醇及促透劑、中藥提取濃縮液，邊加邊攪拌，至均勻狀態，即得平痤凝膠。

1.4.2.3 Box-Behnken響應面法實驗設計：本實驗在前期預實驗和單因素考察的基礎上，選取對乳膏成品影響較大的三個因素：水相與油相的組成比A、乳化溫度B和乳化劑的用量C作為自變量，以成品的穩定性、均勻性、外觀狀態、涂布性能、粘稠度為綜合評價指標，以百分制為得分標準，各指標均占20分。考察各因素對乳膏制備工藝的影響，每個因素選取低、中、高3個水平，設計因素見表1。

表1 設計實驗因素與水平

1.4.3 不同制劑的藥效學研究

1.4.3.1 實驗動物分組及給藥：36只小鼠依隨機數字表分為6組，即空白對照組、陽性對照組、凡士林膏組、平痤凝膠組、平痤乳膏組、內外合治組。空白對照組不給藥，陽性對照組涂抹痤瘡軟膏（主要成分為硫磺和大黃），凡士林膏組、平痤凝膠組、平痤乳膏組涂抹相應制劑，內外合治組外涂平痤乳膏+內服載平痤乳膏藥粉膠囊，其中內服載平痤乳膏藥粉膠囊根據小鼠與人體劑量折算為每只小鼠每天每公斤體重0.4 g，將其制備成混懸液多次服用。

1.4.3.2 對小鼠性激素水平的影響[6]

1.4.3.2.1 血清樣品采集及檢測：各組小鼠連續涂抹給藥10 d，第11天摘眼球取血，制備血清。使用ELISA法檢測，得標準品光密度值，采用SAS軟件進行邏輯回歸分析，得回歸方程。酶標儀測定各組血清樣品的吸光度值，將其代入回歸方程中，計算相應樣品中睪酮（T）、雌二醇（E2）的含量，并計算T/E2比值。

1.4.3.2.2 皮脂腺斑組織結構[7]：皮脂腺斑是雄激素依賴性器官，包含有毛囊、大量皮脂腺及黑素團塊等重要結構，可用于判斷藥物抗雄激素及抗皮脂腺增生的情況。本部分取“1.4.3.2.1”項下小鼠脫頸椎處死，剔除小鼠腹部的被毛，摘取下側腹部皮脂腺斑組織放入8～10倍體積的中性福爾馬林組織固定液中，HE染色切片觀察。

1.4.3.3 小鼠耳腫脹抗炎實驗[8]：每組小鼠連續10 d于同一時間點涂抹給藥，在第10天給藥45 min之后，每只小鼠右耳正反兩面各涂抹0.01 ml二甲苯溶液，左耳不做任何處理。造模45 min后處死小鼠，用同一打孔器分別在兩耳的相同部位打下相同大小的圓片，根據圓片重量的差值計算每只小鼠的腫脹程度，腫脹度計算公式：腫脹度（mg）=致炎后的小鼠耳廓重量-致炎前的小鼠耳廓重量；腫脹抑制率（%）=（空白對照組平均耳腫脹度-給藥組平均耳腫脹度）/空白對照組平均耳腫脹度×100%。

2 結果

2.1 平痤乳膏工藝優化結果：由表2可知，最優乳膏制備工藝水相與油相比為3:2，乳化溫度為80℃，乳化劑用量為2 g。

表2 Box-Behnken響應面法優選制備工藝實驗設計及其結果

2.2 模型擬合：采用Design-Expert對上面數據進行分析，以Y對三個自變量A、B、C進行模型擬合，并根據相關系數（R2）等對擬合模型進行評價，通過比較各擬合方程的擬合度，得到二次多項式回歸方程Y=86.40+1.38A+1.38B+1.75C-4.50AB-0.25AC-3.75BC+3.80A2-14.70B2+1.05C2，R2=0.9901，P＜0.01，F=77.55，表明模型具有極顯著差異性；失擬項P=0.3220＞0.05，失擬項不顯著，說明該模型擬合度和可信度均有效，試驗誤差小，可以用此模型對平痤乳膏的制備工藝進行分析和預測。此外，由F檢驗可知三個因素對綜合評價的影響以C乳化劑用量最為顯著，且AB、BC交互作用顯著。見表3。

表3 方差分析結果

2.3 響應面優化分析：根據擬合方程，通過Design-Expert V8.0.6.1軟件繪制綜合評分隨因素變化的等高線圖和響應面圖。由圖1～2可以看出，當乳化溫度一定時，在一定范圍內，油相與水相的比與綜合評分成正相關，綜合評分隨著油相與水相的比例增大而增大；由圖3～4可以看出，油水相比一定時，乳化劑用量與綜合評分成正相關，綜合評分隨著乳化劑用量的增多而增大；由圖5～6可以看出，乳化溫度對綜合評分的影響成拋物線，隨乳化溫度的增高綜合評分呈先增大后降低的趨勢，當乳化溫度接近于80℃時，綜合評分最高。

圖1 A-B等高線圖

圖2 A-B響應面圖

圖3 A-C等高線圖

圖5 B-C等高線圖

圖4 A-C響應面圖

圖6 B-C響應面圖

2.4 優化結果：根據回歸模型分析可知，制備平痤乳膏的最優條件為：水相比油相3:2、乳化溫度77.66℃和乳化劑用量2.0 g。根據優化結果并考慮工業生產的實際操作可行性，各因素值均取整值，即油相與水相比3:2、乳化溫度80℃和乳化劑用量2.0 g。

2.5 平痤乳膏對小鼠性激素含量的影響：使用ELISA法檢測，橫坐標選用標準品的濃度，縱坐標選用光密度OD值，據此進行邏輯回歸分析，使用統計軟件SAS對T及E2回歸曲線進行擬合，擬合方程如下：

各組小鼠的睪酮及雌二醇含量如圖7所示。各組小鼠血清中T/E2值均無任何統計學意義，與空白對照組相比，各組小鼠血清中T值除凡士林膏組以及平痤凝膠組外均顯著降低（P＜0.01）、E2值除凡士林膏組外同樣顯著降低（P＜0.01），說明凡士林膏組降低小鼠體內的T與E2水平療效很差。與陽性對照組相比，內外合治組、平痤乳膏組、平痤凝膠組小鼠血清中T值與E2值降低不明顯，療效等同，凡士林膏組略有升高，療效較差。由以上結果可知，內外合治組、陽性對照組、平痤乳膏組和平痤凝膠均能不同程度地調節小鼠體內的激素水平，而凡士林膏組調節能力很差，各組制劑調節能力由高到低依次為內外合治組＞平痤乳膏及陽性對照組＞平痤凝膠組＞凡士林膏組。

2.6 平痤乳膏對小鼠皮脂腺斑顯微結構的影響：如圖8所示，空白對照組的小鼠皮脂腺體積較大，部分開口于毛囊，結構完整。與空白對照組相比，陽性對照組小鼠皮脂腺體積略變小，排列緊密；與陽性對照組相比，凡士林膏組、平痤凝膠組、平痤乳膏組三組變化不大，但內外合治組體積變小，且排列較緊密，說明內外合治組抑制皮脂腺增長的能力強于平痤乳膏組、平痤凝膠組以及凡士林膏組。由以上結果可知，內外合治組能明顯地使皮脂腺腺體萎縮，控制皮脂的分泌，且效果優于陽性對照組。

圖8 各組小鼠皮脂腺斑纖維結構（100×）

2.7 小鼠耳腫脹抗炎實驗：小鼠耳腫脹實驗結果如表4所示。與空白對照組相比，各組耳廓腫脹程度均明顯減輕，其中陽性對照組、平痤乳膏以及內外合治組療效顯著（P＜0.01），凡士林膏組、平痤凝膠組療效較差，差異無統計學意義（P＞0.05）。說明除凡士林膏組和平痤凝膠組外，其余各組均可抑制小鼠耳腫脹。與陽性對照組相比，平痤乳膏組以及內外合治組小鼠耳腫脹明顯減輕（P＜0.01），療效最佳；平痤凝膠組無差異，療效等同，凡士林膏組耳腫脹明顯重于陽性對照組，療效最差。由以上結果可知內外合治組、平痤乳膏組以及平痤凝膠組均具有一定的抗炎作用，能夠在一定程度上抑制小鼠的耳腫脹，且內外合治組療效最佳、其次為平痤乳膏組、最后為平痤凝膠組。

表4 二甲苯致小鼠耳腫脹抗炎實驗結果 （±s）

表4 二甲苯致小鼠耳腫脹抗炎實驗結果 （±s）

注：**表示與空白對照組比較，P＜0.01，##表示與陽性對照組比較，P＜0.01。

組別 耳廓腫脹度/mg 腫脹抑制率/%空白對照組 13.37±0.91 -陽性對照組 10.54±0.65** 21.17凡士林膏組 12.92±0.92## 3.38平痤凝膠組 12.50±0.99 6.49平痤乳膏組 10.46±0.51**## 21.78內外合治組 9.97±1.16**## 25.43

3 討論

本文所考察的劑型為乳膏，在實際應用中發現，外用油包水（W/O）型軟膏劑相較于水包油（O/W）型乳膏劑不易揮發、失水，因此作用時間更持久，且能夠在皮膚表層覆蓋一層油脂膜，增強皮膚的水合作用，易于有效成分經皮遞送，故最終制備W/O的乳膏，在保護中藥有效成分揮發的同時更好的發揮藥理作用。在W/O乳膏劑制備工藝的過程中，由響應面結果可知，隨著乳化劑用量的增加，乳劑的綜合評分也增加，但在實際操作過程中，在保證乳劑穩定性的前提下，乳化劑的用量應越少越好。通常在O/W的乳膏中，乳化劑的用量大約為0.5%～10%[8]，本實驗乳化劑用量為2 g即可保證穩定性，故最終選用乳化劑的用量為2 g。

平痤凡士林乳膏是臨床制劑，由藥材細粉與凡士林混勻所得，雖然可以與凡士林大量混合，但藥材中有效成分不能有效地從藥材粉末中溶出，透皮性能不佳，影響有效成分發揮作用，且皮膚適應性差；平痤凝膠雖然通過提取中藥材，促進有效成分以分子狀態存在，但保濕性能差，涂抹于皮膚表面后，由于羥丙基甲基纖維素的自身性質，使得藥物釋放緩慢，相較于平痤凡士林膏藥效雖明顯增強，但也不及乳膏；平痤乳膏是在前期研究基礎上制備新制劑，相比較前兩者而言，平痤乳膏不僅有效成分提取后便于發揮作用，保濕性能好，而且易于涂抹和清洗、皮膚適應性和滲透性好、生物利用度高，在臨床上具有更好的療效。除此之外，本文基于中醫理論“內外兼治”的指導原則，選用內外同治法，采用外用中藥乳膏加口服載藥粉末膠囊給藥，其中載藥膠囊內服從中醫整體理念出發，通過活血化瘀、清熱解毒，達到治本目的；乳膏外涂從中醫局部理論出發，使藥物在局部受損部位快速起效，發揮消腫止痛的作用，達到治標目的。結果顯示，平痤內外合治組療效最佳，優于單純外用給藥各組，符合中醫理論中內外合治可增效的特點，在對癥治療的同時，追朔病原，發揮標本同治之功效。