外周血濾泡輔助性T細胞表達與哮喘患者病情的相關性＊

蔡丹磊 倪凱華 韓毓 黃中偉 董巖松

WHO將支氣管哮喘定義為四大頑疾之一，也是現今全球公認的健康問題。由于支氣管哮喘患病較高，加之該疾病的臨床癥狀也十分典型，對患者的生活質量影響較大[1]。支氣管哮喘是一種慢性氣道炎癥性疾病，既往的研究表明，該疾病的發生與多種炎癥細胞和炎癥介質參與息息相關，其臨床表現為氣道高反應性、可逆性氣流受阻及氣道炎癥細胞浸潤[2]。輔助性T細胞1（Th1）、輔助性T細胞2（Th2）、輔助性T細胞17（Th17）、調節性T細胞（Treg）等CD4+T細胞在支氣管哮喘中的發病作用已有較多的學者進行報道研究[3-5]，但是由于支氣管哮喘的發病機制較為復雜，用各個細胞的比例失衡并不能很好地解釋。國外的兩位學者幾乎同時報道了一種定位于淋巴濾泡、具有輔助B細胞功能、表型為CXCR5+CD40L+ICOS+T細胞亞群，稱為濾泡輔助性T細胞（Tfh）[6-7]。與既往的研究不同，該學者認為Tfh細胞是不同于Th1、Th2、Treg、Th17的一個新的T細胞亞群。而目前尚無哮喘中Tfh細胞的作用及機制方面的研究報道。基于此，本次研究著重探討哮喘患者外周血濾泡輔助性T細胞表達調控機制，現將研究結果報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

回顧性分析南通大學附屬醫院2020年10月-2021年3月收治的哮喘患者42例，納入標準：（1）符合哮喘臨床診斷標準；（2）7 d內未應用糖皮質激素或其他免疫抑制劑治療；（3）7 d內無急性感染，無其他慢性病史；（4）患者知情同意。排除標準：（1）拒絕參加；（2）合并嚴重的器質性病變；（3）惡性腫瘤；（4）依從性差。根據疾病嚴重程度，分為急性發作組（n=23）、緩解組（n=19）；另選取同期在本院體檢的健康人群30例作為對照組。對照組中男15例，女15例；年齡7～45歲，平均（25.95±2.44）歲。急性發作組中，男11例，女12例；年齡9～48歲，平均（25.91±2.41）歲。緩解組中，男9例，女10例；年齡8～48歲，平均（25.64±2.81）歲。三組的一般資料比較，差異無統計學意義（P>0.05）。本次研究獲得本院醫學倫理會批準。

1.2 方法

1.2.1 采用流式細胞術分析Tfh細胞的分化數量所有患者均于清晨采集空腹靜脈血，肝素鋰抗凝處理后，將100 μl的全血置于15 ml的離心管中，分別加入：10 μl PE-CD278、10 μl FITC-CD4、5 μl PerCP-cyTM-5.5-CXC R5流式抗體，避光孵育半小時后，加入1 ml xBECKMAN Optil-yse C，輕輕混勻后避光15 min。使用離心機進行離心處理（3 000 r/min，5 min），棄上清后收集細胞，細胞使用2 ml磷酸緩沖鹽溶液（PBS）進行洗滌，隨后再次離心（1 000 r/min，5 min），棄上清后收集細胞。隨后根據適合體積的PBS重懸，調整細胞濃度，再次離心處理（1 000 r/min，5 min）。所有試劑均購于BD公司。

1.2.2 外周血中Tfh胞內細胞因子合成水平 采用流式細胞術激活細胞后分別對Tfh細胞膜表面分子CD4和CXCR5及胞內特征性細胞因子白細胞介素-4（IL-4）和白細胞介素-21（IL-21）進行熒光染色，采用流式細胞術分析Tfh細胞內IL-4和IL-21的合成水平，嚴格按試劑盒說明書進行操作。

1.3 統計學處理

本次試驗采用SPSS 22.0統計分析軟件，計量資料以（±s）表示，采用t檢驗，計數資料以率（%）表示，采用χ2檢驗，相關性分析采用Spearman相關性，P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 三組外周血濾泡輔助性T細胞表達水平對比

對照組的CD4+ICOS+、CD4+CXCR5+表達水平高于急性發作組、緩解組，CD4+ICOS+CXCR5+表達水平及IL-4、IL-21水平低于急性發作組、緩解組，差異均有統計學意義（P<0.05）；急性發作組的CD4+ICOS+CXCR5+表達水平及IL-4、IL-21水平高于緩解組，CD4+ICOS+、CD4+CXCR5+表達水平低于緩解組，差異均有統計學意義（P<0.05），見表1。

表1 三組外周血濾泡輔助性T細胞表達水平對比（±s）

表1 三組外周血濾泡輔助性T細胞表達水平對比（±s）

*與對照組比較，P<0.05；#與急性發作組比較，P<0.05。

組別 CD4+ICOS+ CD4+CXCR5+ CD4+ICOS+CXCR5+ IL-4（ng/L） IL-21（ng/L）對照組（n=30） 10.84±1.22 3.59±0.31 4.07±0.52 55.45±5.42 15.49±1.94急性發作組（n=23） 7.39±0.91* 1.49±0.46* 12.29±1.22* 188.92±23.55* 18.39±2.31*緩解組（n=19） 8.49±0.16*# 2.14±0.75*# 6.49±0.34*# 128.93±15.55*# 16.94±1.33*#F值 92.120 132.060 126.164 466.406 14.687 P值 <0.05 <0.05 <0.05 <0.05 <0.05

2.2 外周血濾泡輔助性T細胞表達水平與哮喘病情的相關性分析

Spearman相關性分析顯示，CD4+ICOS+、CD4+CXCR5+與哮喘病情存在負相關關系，CD4+ICOS+CXCR5+、IL-4、IL-21表達水平與哮喘病情存在正相關關系（P<0.05），見表2。

表2 外周血濾泡輔助性T細胞表達水平與哮喘病情的相關性對比

3 討論

數據報道指出，近20年以來，青少年的支氣管哮喘的發病率不斷上升，約有40%的青少年患有哮喘[8-10]。有研究指出，發達國家兒童的患病率為10%～30%[11-13]。我國哮喘發病率相對發達國家低，但是隨著我國經濟水平的不斷發展、環境問題的加劇，我國支氣管哮喘患病率較10年前約增高1倍，且呈現年輕化趨勢。哮喘的發生與多種炎癥因子的共同參與有關，現今多數研究認為，T淋巴細胞、肥大細胞、嗜酸性粒細胞、氣道上皮細胞和免疫球蛋白E（IgE）、免疫球蛋白G（IgG）等介導了支氣管哮喘的發生與發展[14-16]。在免疫學角度，支氣管哮喘的發生與機體自身接觸過敏原而引發的超敏反應有關，其主要表現為IgE介導的變態反應。當機體再次接觸過敏原時，IgE交聯導致肥大細胞和嗜酸性粒細胞脫顆粒釋放炎性介質引起氣道的高反應性，進而引起哮喘發作[17]。哮喘不僅會對人們的身體健康造成影響，還會加重人們的生活負擔及精神壓力。臨床上對于哮喘尚無根治方法，針對此，加強對哮喘疾病發病機制的研究十分重要。

目前，多數學者均認為，哮喘的發生與免疫功能紊亂有關，也是導致哮喘發生的重要機制之一[18]。也有學者認為，哮喘的發生與氣道炎癥有關[19]。有學者的研究認為，Th1、Th2細胞通過分泌IL-4及γ-干擾素（IFN-γ）從而刺激B細胞增殖與類別轉換重組（CSR），從而產生免疫球蛋白，促進哮喘疾病的發生[20]。既往認為，Th2是輔助B細胞的主要輔助性T細胞，Tfh細胞是最近新發現的一種輔助性T細胞，在轉錄因子B細胞淋巴因子-6的調控下，輔助性T淋巴（Th）細胞可分化為Tfh細胞，該細胞能夠持續表達CXCR5，自分泌方式分泌IL-21。Tfh細胞比例失衡或功能失調參與了多種疾病的發生。Tfh細胞在自身免疫性疾病中的發生機制已經得到了廣大學者的研究支持[21]。系統性紅斑狼瘡患者的Tfh細胞異常增多，這與患者自身靶器官受損、自身抗體失衡的嚴重程度有關[22-23]。

結合本次研究結果：對照組的CD4+ICOS+、CD4+CXCR5+表達水平高于急性發作組、緩解組，CD4+ICOS+CXCR5+表達水平及IL-4、IL-21水平低于急性發作組、緩解組，差異均有統計學意義（P<0.05）；急性發作組的CD4+ICOS+CXCR5+表達水平及IL-4、IL-21水平高于緩解組，CD4+ICOS+、CD4+CXCR5+表達水平低于緩解組，差異均有統計學意義（P<0.05）。分析認為，多種細胞及分泌均參與了IgE水平的調控，而哮喘患者IgE水平的高低與疾病息息相關，IgE上升，促進疾病的發展，也有學者的研究證實了這一觀點[24]。細胞因子微環境失衡也可能導致哮喘患者體內IgE水平的提升，而IL-4調節CD4+T細胞向Th2分化，從而促進B細胞分化，促進免疫球蛋白向IgE轉化，促進哮喘的發生。Spearman相關性分析顯示，CD4+ICOS+、CD4+CXCR5+、CD4+ICOS+CXCR5+表 達 水 平 的 高低、IL-4、IL-21水平與哮喘病情存在顯著相關性（P<0.05）。分析認為，哮喘患者存在Th2細胞比例失衡，外周血分泌IL-4的T細胞比例也存在失衡，進而導致哮喘患者的免疫應答偏移，發揮協同作用，進一步促進哮喘疾病的發生與發展[25]。

綜上所述，外周血濾泡輔助性T細胞可能參與了哮喘疾病的發生與發展，外周血濾泡輔助性T細胞表達水平與IL-4、IL-21水平高低可以作為哮喘疾病的評估與診斷指標之一。