雞新城疫微量紅細胞凝集抑制試驗檢測結果不確定度評定

張 寧，宋善道，王書麗，李志娟

（1.河南省獸藥飼料監察所，河南 鄭州 450003；2.河南國康檢測技術有限公司）

測量不確定度，簡稱不確定度，是指根據所用到的信息，表征賦予被測量值分散性的非負參數（JJF 1059.1-2012）或表示與測量結果相關聯的參數，表征合理地賦予被測量值的分散性。其結果為表征結果的分散性，根據計算結果，其結果必然為非負數。具體而言，不確定度包括由系統影響引起的若干分量。測量結果包括估計值和測量不確定度，而不確定度反映了測量結果的可信程度。

本研究利用HI 試驗測定雞新城疫病毒（NDV）抗體，并對測量不確定度進行了評定和計算，提供了測量過程中各分量的組成和計算方法，科學評定了此方法的準確性，以期為獸醫實驗室測量不確定度評估提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 樣品 8份待檢雞血清，均來自河南省獸藥飼料監察所，均為留樣樣品。

1.1.2 試劑 PBS（0.1mol/L，pH 7.0～7.2），自配；1%雞紅細胞懸液，采自河南省獸藥飼料監察所飼養的無新城疫SPF 雞血清配制；新城疫標準抗原，購自哈爾濱國生生物科技股份有限公司，批號：20210412；新城疫標準陽性對照，購自哈爾濱國生生物科技股份有限公司，批號：20210412；新城疫標準陰性對照，購自哈爾濱國生生物科技股份有限公司，批號：20210412。

1.2 主要儀器與設備

電熱恒溫培養箱（DH-420AB），購自北京中興偉業世紀儀器有限公司；高速臺式冷凍離心機（TGL-16MC），購自湘儀離心機儀器有限公司；移液器（八通道），5～50 μL，購自大龍興創實驗儀器（北京）股份公司；移液器，10～100 μL、100～1 000 μL，購自大龍興創實驗儀器（北京）股份公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 血凝素工作液配制

血凝素凝集價測定：按照表1，對96孔微量板法布局，用PBS（0.1 mol/L，pH7.0～7.2，下同）將血凝素稀釋成不同倍數，加入與抑制試驗中血清量等量的PBS，再加入1%雞紅細胞懸液。將96 孔微量板在振搖器上搖勻，置室溫20～40 min 或置2～8℃40～60 min，當對照孔中的紅細胞呈顯著紐扣狀時判定結果。以使紅細胞完全凝集的最高稀釋度作為判定終點。

表1 96孔微量板法測定凝集價 （單位：mL）

1.3.2 血凝素工作液配制及檢測

1.3.2.1 四單位HAU血凝素的配制

如果血凝素凝集價測定結果為1：1024（舉例），4個血凝單位（即4HAU）=1024/4=256（即1：256）。取PBS 9.0 mL，加血凝素1.0 mL，即成1：10稀釋，將1：10稀釋液1.0 mL加入24.6 mLPBS中，使最終濃度為1：256。

1.3.2.2 檢測

檢查4HAU 的血凝價是否準確，應將配制的1：256 稀釋液分別以1.0 mL 的量加入PBS 1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL、5.0 mL 和6.0 mL 中，使最終稀釋度為1：2、1：3、1：4、1：5、1：6 和1：7。然后，從每一稀釋度中取0.25 mL，再加入1%雞紅細胞懸液0.25 mL，混勻。

如果用微量板，方式相同。即從每一稀釋度中取0.025 mL，加入PBS 0.025 mL，再加入1%雞紅細胞懸液0.025 mL，混勻。

將血凝板置室溫40 min 或置2～8℃60 min，如果配制的抗原液為4 HAU，則1：4 稀釋度將給出凝集終點；如果4 HAU 高于4 個單位，可能1：5 或1：6 為終點；如果較低，可能1：2或1：3為終點。應根據檢驗結果將血凝素稀釋度做適當調整，使工作液確定為4 HAU。

1.3.3 血凝抑制試驗（HI）

按照表2，對96孔微量板法布局，PBS將本血清做2倍系列稀釋，加入含4 HAU 的血凝素液，并設PBS 和血凝素對照，充分振搖后，置室溫下至少20 min 或在2～8℃下至少60 min，再加入1%雞紅細胞懸液，置室溫20～40 min 或置2～8℃40～60 min，當對照孔中的紅細胞呈顯著紐扣狀時判定結果。以使紅細胞凝集被完全抑制的血清最高稀釋度作為判定終點。

表2 96孔微量血凝抑制試驗 （單位：mL）

2 結果及分析

2.1 數學模型

式中， Xi—同一血清樣本單次檢測的新城疫抗體HI效價（log2）；

n—平行樣數量；

2.2 測量結果

對8份雞血清進行HI重復性測定，結果見表3。

表3 8份雞血清HI重復測定結果表

2.3 不確定度評定

2.3.1 測定方法重復性導致的不確定度ua

對血清樣品新城疫HI抗體效價進行8次重復測定，平均HI效價為：

實際標準差為

2.3.2 由測量儀器和測定過程導致的不確定度ub1

測定一個血清樣本需采用200 μl 移液槍進行多次操作，其中在96 孔V 型板中加入25 μl PBS 需重復操作10次，血清的稀釋需用移液器進行10 次重復操作，添加4 HAU抗原需移液槍進行10次重復操作，添加1%雞紅血球移液槍進行10次重復操作。主要考慮以下分量：200 ul移液槍經檢定合格，按照《JJG 646-2006移液器檢定規程》吸取25 μl液體，允許最大誤差為±1 μl，該量為均勻分布，包含因子k=

移液器重復帶來的不確定度ub2，取移液槍，精密量取水200 uL，稱重，重復10次，結果見表4。

表4 移液器重復10次檢測結果

稱重的標準偏差為Sm=0.7559 g，故S移=0.7559 mL。

溫度效應引入的不確定度ub3，整個實驗過程中環境溫度變化2℃，考慮其對體積的影響。

整個過程需進行40 次移液器的重復操作，所以由測量儀器和測定過程導致的不確定度ub。

2.3.3 人員讀數導致的不確定度uc

檢測人員在觀察讀數時，因受觀察時間、操作經驗以及1%紅血球溶血度等因素的影響，會產生讀數誤差。估計該差a=0.1（log2），為均勻分布，包含因子k=

2.4 合成標準不確定度

計算雞新城疫微量紅細胞凝集抑制試驗測定的合成標準不確定度。

2.5 擴展不確定度

取包含因子k=2，擴展不確定度U=k×u=0.27×2=0.54≈0.6，新城疫微量紅細胞凝集抑制試驗HI 效價為（7.0±0.6）log2，（k=2）。

3 討論

通過對構成不確定度的各分量進行詳細分析，并分析各分量在整體不確定度值中所占的比例，可直觀了解對檢測結果質量影響最大的因素，在對這些因素針對性地改進后，可以有效提高檢測質量。

本研究評估結果顯示，標準不確定度為0.27，擴展不確定度為0.6，置信水平P=95%，k=2。試驗表明，該檢測不確定度的主要來源為測定方法重復性、移液器、溫度環境、人員讀數帶來的不確定度。在樣品測量值處于陽性判定值附近時，需要考慮不確定度的存在。該方法可有效評定雞血清中雞新城疫病毒抗體檢測結果的不確定度，可為實驗室在今后的血凝抑制試驗檢測中提供參考。□