阪崎克羅諾桿菌ESA_01393基因缺失及對表型的影響

李 萍，宗文月，杜欣軍，王 碩

(1.食品營養與安全國家重點實驗室，天津科技大學食品科學與工程學院，天津 300457；2.天津市食品科學與健康重點實驗室，南開大學醫學院，天津 300071)

阪崎克羅諾桿菌(Cronobacter sakazakii)是一種無芽孢、有周生鞭毛、能運動、兼性厭氧的革蘭氏陰性桿菌[1]，是一類能夠在人和動物腸道內生存的機會致病菌，能夠引起新生兒腦膜炎和壞死性小腸結腸炎[2].相關研究[3]表明，阪崎克羅諾桿菌是引起嚴重感染的機會病原體，尤其是在嬰兒、老年人和免疫功能低下的人中.出生體質量小于2.5kg的嬰兒和出生不足 28d的新生兒有更高的感染風險[4].阪崎克羅諾桿菌主要存在于嬰幼兒配方奶粉及其他嬰幼兒食品中[5]，新生兒感染后的死亡率高達 80%[6]，幸存者往往患有嚴重的、不可逆轉的神經系統疾病.阪崎克羅諾桿菌在嬰幼兒配方奶粉中的存活能力強，對嬰幼兒的危害較大，引起了大眾的廣泛關注.

許多環境損傷和內源性過程可導致 DNA損傷，對細胞生存構成直接威脅.在大多數細菌中，DNA損傷通過應急反應(SOS反應)的轉錄調控過程進行處理[7-8].在大腸桿菌(Escherichia coli)中，SOS反應是細胞遇到DNA損傷因子后被誘導的一種由40多個基因組成的調控機制，其中許多基因參與了 DNA損傷的耐受和修復，如 recA、lexA、umuDC、recN、sulA、polB、uvrA、uvrB 和 uvrD[9-12].這個過程受 SOS調節因子LexA和RecA的控制.SOS反應通路是一種可誘導的 DNA損傷修復系統[13].在沒有 DNA損傷的情況下，LexA阻止SOS基因的轉錄[14].當DNA損傷時，重組蛋白 RecA在單鏈 DNA上形成核微絲.RecA核蛋白絲激活 LexA自身蛋白水解，SOS反應基因的轉錄被打開[8,14].除了兩個關鍵的 SOS反應調節因子 LexA和 RecA，其他一些壓力源和壓力反應也可以控制 SOS反應的因素[15].細菌暴露于DNA損傷劑以及其他環境和細胞內因素，這些因素會在宿主內的許多部位觸發SOS反應[16].

與NCBI中大腸桿菌的yebG基因(DNA損傷誘導蛋白)序列的比對結果表明，阪崎克羅諾桿菌中的ESA_01393基因序列覆蓋度為 67%，相似度為 68%.操縱子融合表明，在大腸桿菌中 yebG基因的表達受SOS反應調節因子 LexA和 RecA的調控[9,17].Uranga等[18]研究發現，yebG基因是SOS反應調控的一部分，在 DNA受到損傷后被高度誘導.絲裂霉素C處理大腸桿菌后，會誘導 yebG 基因的表達[17].因此，編碼 DNA損傷誘導蛋白的 yebG基因被鑒定為大腸桿菌的一種新的 SOS反應調控基因[17]，但基因的功能尚不清楚.為了進一步研究阪崎克羅諾桿菌中的 ESA_01393基因的功能，本研究在阪崎克羅諾桿菌 ATCCBAA-894中進行了基因敲除，并對其運動能力、生物膜形成能力、耐干燥能力以及 DNA損傷修復能力進行了評估，為后續阪崎克羅諾桿菌的致病性及耐干燥機制研究奠定基礎.

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質粒

阪崎克羅諾桿菌(Cronobacter sakazakii)ATCC BAA-894保存在本實驗室的－80℃冰箱中.質粒pCVD442、質粒 pACYC184、大腸桿菌(Escherichia coli)S17-1λpir和大腸桿菌 DH5α由本實驗室保存.質粒 pCVD442-Q-H和質粒 pACYC184-ESA_01393為本研究構建(表1).

表1 本實驗所用菌株和質粒Tab.1 Bacteria strains and plasmids used in this study

1.1.2 試劑與儀器

細菌基因組DNA提取試劑盒、PCR產物純化試劑盒、膠回收試劑盒及質粒提取試劑盒，Omega Bio-Tek公司；KOD酶、Taq酶和dNTP mix(10mmol/L)，寶生物工程(大連)有限公司；氯霉素，上海麥克林生化科技有限公司；氨芐青霉素，BBI生命科學有限公司；限制性內切酶，美國 NEB公司；D2000DNA marker、1kb plus DNA marker、2×Taq PCR master mix和上樣緩沖液，北京康為世紀生物科技有限公司；T4連接酶，賽默飛世爾科技公司；LB培養基，北京索萊寶科技有限公司；平板計數培養基(PCA計數培養基)，青島海博技術有限公司；其他試劑均為國產分析純試劑.

PCR儀、電泳儀和凝膠成像儀，伯樂生命醫學產品(上海)有限公司；Sunrise-Basic型酶標儀，帝肯奧地利有限責任公司；超微量分光光度計，德國Berthold公司；3-30K型臺式高速冷凍離心機，德國Sigma公司.

1.2 實驗方法

1.2.1 PCR引物設計

使用NCBI找到ESA_01393基因(GenBank號為WP_004386660.1)，選取其上下游同源臂各700bp的相應序列，使用Premier 5設計ESA_01393基因上下游同源臂的引物ESA_01393-Q F/ESA_01393-Q R和ESA_01393-H F/ESA_01393-H R，并且分別在上下游同源臂引物的 5′端加入相應的酶切位點.ESA_01393 1-F/ESA_01393 1-R和ESA_01393 2-F/ESA_01393 2-R為基因敲除驗證的引物，分別位于 ESA_01393基因上和 ESA_01393基因的兩端各 700bp處.cpESA_01393 F/cpESA_01393 R為基因回補的引物，位于 ESA_01393基因上，并且在引物的 5′端加入相應的酶切位點.引物序列見表2.

表2 引物序列Tab.2 Sequences of primers

1.2.2 基因敲除及回補株的構建

采用 Ji等[19]的方法并稍作改動，對 C.sakazakii ATCC BAA-894野生型(WT)進行基因突變.使用ESA_01393-Q F/ESA_01393-Q R和ESA_01393-H F/ESA_01393-H R兩對引物從 WT的全基因組序列中擴增出待敲除基因的上下游片段(表2).將上下游片段克隆到 pCVD442自殺載體中，產生重組載體pCVD442-Q-H.將重組載體轉化到大腸桿菌 S17-1λpir感受態中，通過電轉化構建ΔESA_01393突變株.

使用 cpESA_01393F和 cpESA_01393R兩個引物構建了含有 ESA_01393編碼序列及其啟動子的互補質粒 pACYC184-ESA_01393.將互補質?？寺≈力SA_01393突變株中，獲得攜帶ESA_01393基因的回補株cpESA_01393.回補株引入的酶切位點分別為HindⅢ和BamHⅠ.

1.2.3 生長曲線的測定

根據文獻[20]的方法測定細菌的生長曲線.將菌株 WT、ΔESA_01393和 cpESA_01393進行過夜培養，菌液以 1：100比例轉接至新鮮的 LB液體培養基中，37℃、200r/min培養 14h.從轉接開始，每隔1h取樣，測定 600nm 處的吸光度(A600)直至平穩期，必要時稀釋一定倍數.用 LB液體培養基作為空白對照，繪制生長曲線.每個樣本重復3次.

1.2.4 運動性的測定

通過測定細菌軟瓊脂的遷移直徑(0.3%)對運動性進行評估[21].將菌株 WT、ΔESA_01393和cpESA_01393分別接種于無菌的LB培養基中，37℃過夜培養.分別取 10μL菌液置于軟瓊脂運動板(含0.3%瓊脂的 LB 瓊脂培養基)上，30℃培養 16h，觀察菌落大小，每個樣本重復3次.

1.2.5 生物膜形成能力的測定

用結晶紫染色法測定阪崎克羅諾桿菌生物膜的形成能力[22].取吸光度介于 0.6～0.8之間的菌株WT、ΔESA_01393和 cpESA_01393的菌液制備懸浮液.每孔加入100μL懸浮液，37℃孵育48～72h；加入 200μL 99%甲醇固定生物膜，15min后棄去上清液.在室溫下風干后，用 200μL 1%結晶紫染料染色30min，用無菌水洗滌3次；加入200μL 95%乙醇進行脫色.以培養基為陰性對照.使用Sunrise-Basic酶標儀測定570nm處吸光度，每個樣本重復3次.

1.2.6 耐干燥性的測定

參照Farrow等[23]的方法并稍加改動進行細菌干燥耐受性的評估.將菌株 WT、ΔESA_01393和cpESA_01393培養至對數期，獲得懸浮液.為了記錄初始細胞數，將每種細菌懸浮液的10μL樣品用PBS緩沖液稀釋至 100μL，然后連續稀釋并接種至 PCA計數培養基上，37℃培養過夜，計數，此時為干燥前的菌落數.吸取200μL的菌液置于96孔板中，然后將 96孔板放在無菌干燥器里，再將干燥器置于溫度42℃、相對濕度45%的培養箱恒溫恒濕培養，進行耐干燥性實驗評估，時間為 6d.為了確定菌體干燥后的死亡率，將 100μL的 PBS置于每個干燥的樣品上，在室溫下孵育 5min，將菌體吹吸重懸后進行梯度稀釋.使用PBS進行連續稀釋并接種到PCA計數培養基上，37℃培養過夜，計數.每個樣本重復3次.

1.2.7 紫外線照射

根據 Oh等[24]的方法并稍加改動，評估紫外線(UV)照射后菌體的死亡率.菌株 WT、ΔESA_01393和 cpESA_01393培養至 A600＝0.6～0.8，然后將菌液分別放置在培養皿里，使用紫外燈進行照射.將分別照射了5min、10min和15min的3種菌株用生理鹽水進行梯度稀釋，涂布至 PCA固體培養基中，37℃培養箱培養后計數，每個樣本重復3次.

1.2.8 絲裂霉素C處理

根據 Oh等[24]的方法并稍加改動，評估絲裂霉素 C處理后菌體的死亡率.菌株 WT、ΔESA_01393和 cpESA_01393培養至 A600＝0.6～0.8，然后將 3種菌株的菌液分別置于離心管中，加入 0.1%的絲裂霉素 C，30℃培養箱培養.將分別培養了 10min、20min和30min的3種菌株用生理鹽水進行梯度稀釋，涂布至 PCA固體培養基中，37℃培養箱培養后計數，每個樣本重復3次.

1.3 統計學分析

統計學分析采用 SPSS 16.0統計軟件進行Student’s t檢驗.用 GraphPad Prism 簡單單向 t-test檢驗或多重比較，*和**分別表示組間具有顯著性差異(P＜0.05)和極顯著差異(P＜0.01).

2 結果與分析

2.1 基因敲除結果的驗證

利用同源重組技術構建了突變株ΔESA_01393及其回補株 cpESA_01393.ΔESA_01393和 cpESA_01393菌株通過 PCR驗證和測序驗證.分別以 WT菌株和ΔESA_01393菌株DNA為模板進行PCR.如圖1(a)所示，以ESA_01393 1-F/ESA_01393 1-R為引物，WT菌株擴增出 315bp的產物，ΔESA_01393菌株沒有出現 DNA條帶.如圖1(b)所示，以ESA_01393 2-F/ESA_01393 2-R為引物，WT菌株擴增出 1710bp的產物，ΔESA_01393菌株擴增出1395bp的產物.如圖1(c)所示，以 cpESA_01393F/cpESA_01393R為引物，cpESA_01393菌株擴增的DNA條帶為315bp.PCR結果表明，ΔESA_01393和cpESA_01393菌株構建成功，可以進行后續實驗.

圖1 阪崎克羅諾桿菌ESA_01393基因敲除和回補株構建結果的驗證Fig.1 Validation of the results of ESA_01393 gene knock-out and cpESA_01393 complementary strain in C.sakazakii

2.2 ESA_01393基因對阪崎克羅諾桿菌ATCCBAA-894生長的影響

比較阪崎克羅諾桿菌野生型、ΔESA_01393突變株及 cpESA_01393回補株的生長曲線，結果如圖2所示.與野生型相比，ΔESA_01393突變株顯示出相似的生長速率，表明基因缺失后其生長未受影響，同時 cpESA_01393回補株的 A600沒有明顯變化.這說明 ESA_01393基因的缺失不影響細菌的生長，是細菌的非致死基因，對細胞的生長是非必需的，同時也排除了生長規律不同對后續研究結果的影響.

圖2 阪崎克羅諾桿菌野生型、ΔESA_01393突變株及cpESA_01393回補株的生長曲線比較Fig.2 Comparision of growth curves for the growth of WT，ΔESA_01393 and cpESA_01393 strains of C.sakazakii

2.3 ESA_01393基因對阪崎克羅諾桿菌ATCC BAA-894運動能力的影響

阪崎克羅諾桿菌野生型、ΔESA_01393突變株及cpESA_01393回補株的運動性鑒定結果如圖3所示.阪崎克羅諾桿菌野生型、ΔESA_01393突變株及cpESA_01393回補株在 0.3%的瓊脂培養基上形成大小相似的運動環；與野生型比較，ΔESA_01393突變株運動能力沒有較大變化，回補株運動能力也與野生型相似.運動環直徑的測量結果表明，基因 ESA_01393的缺失不影響阪崎克羅諾桿菌的運動能力.

圖3 阪崎克羅諾桿菌野生型、ΔESA_01393突變株及cpESA_01393回補株的運動性鑒定Fig.3 Mobility identification of WT，ΔESA_01393and cpESA_01393 strain of C.sakazakii

2.4 ESA_01393基因對阪崎克羅諾桿菌ATCC BAA-894生物膜形成能力的影響

生物膜的形成取決于細菌誘導 SOS反應的能力[25].為了驗證 ESA_01393基因對阪崎克羅諾桿菌ATCC BAA-894生物膜形成能力的影響，評估了野生型、突變株和回補株的生物膜形成量(圖4).與野生型相比，ΔESA_01393突變株所形成的生物膜形成量略有減少，但沒有顯著性.cpESA_01393回補株顯示出與野生型菌株相似的生物膜形成能力.生物膜的形成過程可能受到多種因子的調節，基因ESA_01393可能不是主要的調控因子.

圖4 阪崎克羅諾桿菌野生型、ΔESA_01393突變株及cpESA_01393回補株的生物膜合成能力比較Fig.4 Comparision of biofilm formation of the WT，ΔESA_01393 and cpESA_01393 strain of C.sakazakii

2.5 ESA_01393基因對阪崎克羅諾桿菌ATCC BAA-894耐干燥性的影響

阪崎克羅諾桿菌野生型、ΔESA_01393突變株及cpESA_01393回補株的干燥死亡率如圖5所示.與野生型相比，ΔESA_01393突變株干燥死亡率更高，回補株表現出與野生型相似的干燥死亡率.因此，ESA_01393的缺失會降低阪崎克羅諾桿菌耐受干燥環境的能力，該基因能夠在一定程度上抵抗干燥環境的壓力.

圖5 阪崎克羅諾桿菌野生型、ΔESA_01393突變株及cpESA_01393回補株的干燥死亡率Fig.5 Drying mortality rate of WT，ΔESA_01393and cpESA_01393 strain of C.sakazakii

阪崎克羅諾桿菌具有一些重要的毒力相關因子或應激生存因子，尤其是在各種不利環境條件下仍能存活的能力，最顯著的是耐干燥和耐滲透脅迫的能力[26].細菌不斷地暴露在變化和壓力的環境中.全部調節系統的協調反應使細菌能夠生存并適應各種環境壓力[27].多因子和冗余分子機制參與了持久性和耐受性細胞的生成和生存[28-29]，其中最著名的耐壓機制包括應激反應、SOS反應、抗氧化能力、毒素-抗毒素系統(TA)、群體感應、能量代謝和藥物外排泵[29-32].最近有研究[15]表明，雖然 SOS反應最初被認為是調節 DNA損傷修復，但其對細菌的耐受性也有著重要影響.在大腸桿菌中，SOS反應在細胞持續形成的過程中增加了細菌的抗生素耐藥性[33-34].在阪崎克羅諾桿菌中，SOS反應參與了生物膜的形成、K+的積累[35]、海藻糖和甜菜堿的合成[36]等過程，因此很可能經由以上途徑間接參與該菌的耐干燥調控.然而到目前為止，在阪崎克羅諾桿菌中還沒有 SOS反應基因參與耐干燥機制的報道.在大腸桿菌中，yebG基因被鑒定為一種新的SOS反應調控基因[17]，而阪崎克羅諾桿菌中yebG基因的同源物ESA_01393基因可能通過SOS反應參與該菌的耐干燥過程.

2.6 ESA_01393基因對阪崎克羅諾桿菌ATCC BAA-894受到UV照射和絲裂霉素C處理的影響

UV照射和絲裂霉素C處理后，比較阪崎克羅諾桿菌野生型、ΔESA_01393突變株及cpESA_01393回補株的死亡率，結果如圖6所示.由圖6(a)可知：在短時間內(5min和 10min)，菌株的 DNA受到損傷時，與野生型相比，ΔESA_01393菌株的死亡率顯著升高.由圖6(b)可知：當長時間 UV照射(15min)和絲裂霉素C處理(30min)時，菌株的DNA受到嚴重損傷，菌株 WT、ΔESA_01393和 cpESA_01393顯示出相似的菌株死亡率，且死亡率均達到 90%以上.這可能是由于 DNA損傷比較嚴重，引起細菌細胞大量死亡.結果表明，阪崎克羅諾桿菌ESA_01393基因參與了DNA損傷修復過程.

圖6 UV照射和絲裂霉素C處理后，野生型、ΔESA_01393突變株及cpESA_01393回補株的死亡率比較Fig.6 Comparison of mortality rates of the WT，ΔESA_01393 and cpESA_01393 strain afterUV irradiation and treated with mitomycin C

細菌的 SOS反應是一種廣泛存在的處理 DNA損傷的轉錄調控機制[37].SOS反應是由含有損傷的DNA 復制過程中單鏈 DNA 的積累引起的[38].當DNA聚合酶在 DNA損傷處停止而復制解旋酶繼續解開DNA時，就會產生單鏈DNA[39].SOS反應需要多個基因的表達，這些基因在 DNA損傷反應中發揮多種功能，包括切除修復、同源重組、翻譯DNA復制和細胞分裂停止[12].DNA損傷修復后恢復正常生理狀態，DNA損傷較廣泛時可能會導致細胞死亡[40].因此，當發生 DNA損傷時，細菌會激活 SOS反應，以適應 DNA損傷壓力[41-42].最常見的引起 DNA損傷的因素包括了紫外線照射和復制抑制劑抗生素絲裂霉素 C暴露[43].研究[41-42]發現紫外線照射后的大腸桿菌通過 SOS反應進行 DNA損傷修復，也有研究[9]表明yebG基因受SOS反應誘導表達，但沒有明確該基因的功能.本研究證實了阪崎克羅諾桿菌中yebG基因的同源物ESA_01393基因參與UV照射和絲裂霉素C處理引起的DNA損傷修復過程，并發揮了重要的作用.

3 結 論

采用同源重組的方法敲除了阪崎克羅諾桿菌ESA_01393基因，并對 ESA_01393基因的功能進行研究.比較了阪崎克羅諾桿菌野生型、ΔESA_01393突變株及 cpESA_01393回補株在生長曲線、運動性、生物膜形成、耐干燥性和 DNA損傷修復能力等方面的差異.研究發現 ESA_01393基因對阪崎克羅諾桿菌的生長、運動性和生物膜形成沒有明顯影響，但是可能作為細菌 SOS反應的一部分，參與了該菌耐干燥和DNA損傷修復過程.本研究為了解阪崎克羅諾桿菌 ESA_01393基因的功能及其在阪崎克羅諾桿菌中的分子機制提供了參考.