乳酸菌發酵對四種雜豆蛋白凝膠及消化特性的影響

姜文鎧，李秋艷，盛文洋，王雅瓊，芮 昕

（南京農業大學食品科技學院，江蘇南京 210095）

近年來，隨著植物基酸奶市場的飛速發展以及消費者對健康消費理念的升級，植物基酸奶已成為研究者關注的熱點問題。植物基酸奶是以豆類、堅果類、谷物類或其他富含蛋白質的植物為原料，經發酵作用而形成的具有低飽和脂肪酸，不含膽固醇和反式脂肪酸等特點的植物基食品[1]。由于植物基蛋白與牛乳蛋白結構與特性的差異，導致以植物蛋白為原料的發酵酸奶存在口感粗糙、粉感嚴重以及豆腥味重等問題[2]。目前，國內外市場上銷售的植物基酸奶的基底多以大豆為主[3]，而以雜豆為基底的植物基酸奶市場占比較少。

據聯合國糧食及農業組織（FAO）數據顯示，2020年世界雜豆生產總值達370118.7萬美元，我國的雜豆生產總值達2148.3萬美元，我國為世界少數幾個雜豆資源非常豐富的國家之一。其中，蕓豆、鷹嘴豆、豌豆和小扁豆分別為世界產量第一、第二、第三和第六[4]的雜豆類。雜豆蛋白含量較高，鷹嘴豆、紅蕓豆、小扁豆和豌豆蛋白含量為23%～30%，且組成較為均衡，研究表明，鷹嘴豆蛋白所含必需氨基酸齊全，易消化[5]，為優質植物蛋白；此外，研究表明一些雜豆蛋白具有獨特的生理功能，如紅蕓豆蛋白產生的肽段具有較高的抗氧化活性和免疫調節[6]等功能；小扁豆蛋白具有預防心血管疾病和降低膽固醇[7]等生理功能；豌豆蛋白產生的多肽具有抗氧化[8]、抗癌防癌、抗菌消炎和增強機體免疫力等生理功能。因此，四種雜豆蛋白是營養、功能價值較高的優質植物蛋白源，在植物基酸奶的應用中具有廣闊的市場前景。

蛋白凝膠是決定酸奶品質的重要因素。乳酸菌發酵誘導蛋白凝膠是典型的酸誘導凝膠。乳酸菌在發酵過程中pH降低，促使經適當熱前處理的蛋白質分子在接近等電點時分子間靜電斥力減弱，從而形成有序的三維凝膠結構，這在牛乳和大豆中已有較多相關報道[9-10]。然而，不同植物基來源的蛋白由于其自身特性的差異，在乳酸菌發酵作用下形成的凝膠能力可能不同，凝膠結構與質構特性可能存在差異，繼而影響植物基酸奶的感官品質。關于雜豆蛋白在乳酸菌作用下的凝膠特性的相關報道較少，Boeck等[11]研究指出小扁豆蛋白在乳酸菌發酵作用下可形成凝膠，且質構和流變學特性結果表明其結構與酸牛乳凝膠類似，該作者指出，小扁豆蛋白在其他發酵乳制品替代品中顯示出很高的應用潛力。而截止目前，鷹嘴豆、紅蕓豆、豌豆尚未有相關研究報道。

食品基質（Food Matrix）是影響營養素分子釋放與吸收的重要因素。研究表明，蛋白凝膠結構的差異性將進一步引發蛋白質分子在胃腸道消化過程中重排，導致差異性的分子釋放及降解模式，最終影響其營養價值[12]。發酵牛乳凝膠結構狀態與蛋白質分子的消化特性已得到較為充分的研究[13]。然而，雜豆蛋白在該領域的研究尚屬空白。本研究主要探究乳酸菌對鷹嘴豆、豌豆、紅蕓豆、小扁豆這四種雜豆蛋白的凝膠形成、凝膠特性、微觀結構、體外動態胃腸道消化中的消化行為的影響及蛋白凝膠對乳酸菌的保護作用，以期為植物基酸奶發酵底物的選擇和發揮益生作用等方面提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

植物乳桿菌B1-6（Lactobacillus plantarumB1-6） 來源于新疆傳統發酵飲品BOZA，保藏于南京農業大學食品科技學院微生物實驗室。該菌株通過16S rDNA序列鑒定，基因加入號KM200717；樣品

采購自江蘇省南京市玄武區蘇果超市，選取自帶包裝、成熟干燥且來自不同產地的雜豆4種，于20 ℃條件下儲藏。四種雜豆為鷹嘴豆（品種：卡布里；產地：新疆）、紅蕓豆（品種：英國大紅；產地：遼寧）、小扁豆（品種：04鑒1；產地：甘肅）和豌豆（品種：中豌6號；產地：山東）；α-淀粉酶（來自人類唾液，A1031，1500 U/mg）、胃蛋白酶（來自豬胃粘膜，P7125，400 U/mg）、胰酶（來自豬胰腺，p7545，200 U/mg）、膽汁鹽（來自豬，B8631） 美國Sigma-Aldrich公司；MRS培養基 青島海博生化科技有限公司；正戊烷

色譜純，上海沃凱試劑公司；甲醇 色譜純，美國Tedia試劑公司；考馬斯亮藍G250、十二烷基硫酸鈉、鄰苯二甲醛（o-phthaldialdehyde，OPA） 分析純，南京壽德試劑公司；牛血清白蛋白 分析純，上海源葉生物公司；胰酪蛋白胨 分析純，美國Sigma-Aldrich公司；其他試劑均為國產分析純。

LRH-150型生化培養箱 上海一恒科學儀器有限公司；SU8010型冷凍電子顯微鏡 日本東京日立公司；64RL型高速冷凍離心機 美國Beckman公司；TLP型質構分析儀 美國Food Technology公司；CR-400型色差儀 英國Norma Lab公司；Bionic Rat Model II+型機械小鼠模型 江蘇省南通東概念新材料科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 雜豆蛋白提取 鷹嘴豆蛋白的提取參照安馨等[14]的方法，紅蕓豆蛋白的提取參考梁珊等[15]的方法，小扁豆蛋白的提取參考聶麗潔[16]的方法，豌豆蛋白的提取參考秦高一鑫等[17]的方法。

1.2.1.1 脫脂 雜豆粉碎過篩（100目標準篩）。稱取100 g雜豆粉置于1 L三角瓶中，用500 mL正己烷混溶，放入攪拌機（180 r/min，20 ℃）攪拌60 min，取沉淀倒回三角瓶，加正己烷重復3次，最后取沉淀，用平板晾曬一晚后收集。

1.2.1.2 雜豆蛋白提取工藝 脫脂豆粉用水按1:10（50 g脫脂豆粉：500 mL純水）的比例混合均勻，調節溶液pH，室溫下攪拌提取，后離心棄沉淀，調節上清液pH至等電點后離心，收集沉淀冷凍干燥得到四種雜豆蛋白。

提取參數：鷹嘴豆調節溶液pH至10.0，攪拌提取80 min（180 r/min），離心20 min（3500 r/min，4 ℃），調至等電點pI值4.5，離心10 min（4000 r/min，4 ℃）；紅蕓豆調節溶液pH至9.0，攪拌提取120 min（180 r/min），離心30 min（3500 r/min，4 ℃），調至等電點pI值4.5，離心20 min（4000 r/min，4 ℃）；小扁豆調節溶液pH至9.0，攪拌提取90 min（180 r/min），離心20 min（3800 r/min，4 ℃），調至等電點pI值4.6，離心15 min（3800 r/min，4 ℃）；豌豆調節溶液pH至9.0，攪拌提取120 min（180 r/min），離心10 min（4000 r/min，4 ℃），調至等電點pI值4.2，離心10 min（4000 r/min，4 ℃）。獲取的鷹嘴豆蛋白、紅蕓豆蛋白、小扁豆蛋白和豌豆蛋白分別被簡稱為CP、RKP、LP和PP。

1.2.1.3 雜豆蛋白主要成分的測定 水分含量測定：采用GB 5009.3-2016《食品中水分的測定》的直接干燥法；灰分含量測定：采用GB 5009.4-2016《食品中灰分的測定》的灼燒法；總蛋白含量測定：采用GB 5009.5-2016《食品中蛋白質的測定》的凱氏定氮法；粗脂肪含量測定：采用GB 5009.6-2016《食品中脂肪的測定》的索氏抽提法；碳水化合物含量測定：采用GB/Z 21922-2008《食品營養成分基本術語》的減法計算。

1.2.2 乳酸菌發酵制備雜豆蛋白凝膠

1.2.2.1 菌種活化 菌種活化按照Blana等[18]的方法。將植物乳桿菌B1-6接種于MRS液體培養基中，于37 ℃培養箱中進行活化培養。兩次連續培養后，將發酵液離心30 s（10000 r/min，20 ℃），在菌體沉淀中加入等體積生理鹽水（0.85%，m/v）以洗去培養基。清洗兩次后加入等體積生理鹽水混合均勻后備用。

1.2.2.2 雜豆蛋白凝膠的制備 采用去離子水分別配制終濃度在0.1%～3.0%（w/v）的四種雜豆蛋白溶液，雜豆蛋白溶液濃度的選擇參考Rui等[19]的方法。調節pH至7.0，85 ℃滅菌10 min，加入過濾除菌的葡萄糖使其終濃度為2.0%（w/v），分別接種3.0%（v/v）的植物乳桿菌B1-6發酵種子液，置于37 ℃培養箱內發酵。

1.2.2.3 發酵速率的測定 參考Rui等[19]的方法，乳酸菌發酵速率以乳酸菌在雜豆蛋白體系發酵產酸致pH降低所需的時間進行計量，具體計算公式如下：

式中：v表示乳酸菌發酵速率，1/h；ΔpH表示發酵雜豆蛋白pH降低值；t表示pH降低所需的發酵時間，h。

1.2.3 發酵雜豆蛋白凝膠特性研究

1.2.3.1 最小臨界凝膠濃度的研究 根據Guldiken等[20]的方法對四種雜豆蛋白的凝膠形成能力進行分析。在平底玻璃管內監測雜豆蛋白凝膠的直觀圖像。在發酵pH7.0、6.5、6.0、5.5、5.0、4.5時將各蛋白濃度樣品倒置，當樣品不流動時，表明凝膠形成，倒置后樣品有少許流動時表明弱凝膠形成。臨界凝膠濃度（LGC）為將平底玻璃管倒置后，樣品能夠形成倒置不流動凝膠的最小蛋白濃度，低于此濃度不能形成自支撐凝膠。樣品的pH由pH計測量。

1.2.3.2 質構特性 探明四種雜豆蛋白最小凝膠濃度后，采用蛋白濃度在2.0%（w/v）發酵雜豆蛋白凝膠樣品，將其切為23 mm高×25 mm直徑的圓柱體，使用TLP質構儀測定樣品的硬度、彈性、內聚性和膠黏性，測定模式選用T.P.A模式，具體參數設置如下：探頭型號選擇p/50，選擇探頭直徑50 mm的平頭探頭，前速度為1 mm/s測量時速度為5 mm/s，返回速度為5 mm/s，觸發力為5 g，2次壓縮中停頓時間設為5 s，探頭移動距離為30%。

1.2.3.3 凝膠色差 采用CR-400色差儀測定，測量結果用亮度（L*）、紅度（a*）和黃度（b*）表示。色差值（ΔE）的計算公式如下：

1.2.3.4 微觀結構 發酵雜豆蛋白凝膠樣品的微觀結構測定參考 Liu 等[21]的方法。采用日立 SU8010掃描電鏡，配有冷凍固定裝置。低溫固定是將少量樣品放置在樣品專用槽上，通過超快速冷卻技術將溫度降至液氮（-196 ℃）或以下。將冷凍固定試樣在真空條件下進行低溫斷裂，以觀察其內部微觀結構，電壓為15 kV。

1.2.4 發酵雜豆蛋白凝膠胃腸道消化特性研究

1.2.4.1 動態模擬胃腸道消化 參考Pongmalai等[22]的方法，配制模擬胃液和模擬腸液并對體外模擬胃腸道消化模型的參數進行設置。模擬胃液（SGF）：緩沖液KCl（6.9 mmol/L）、NaHCO3（25 mmol/L）、KH2PO4（0.9 mmol/L）、NaCl（47.2 mmol/L）、（NH4）2CO3（0.5 mmol/L）和MgCl2（H2O）6（0.1 mmol/L），用緩沖液配制胃蛋白酶（0.27 g/L）和粘蛋白（1.5 g/L），pH調至1.6，置于37 ℃水浴中20 min激發酶的活力。模擬腸液（SIF）：緩沖液為KH2PO4（0.8 mmol/L）、KCl（6.8 mmol/L）、NaCl（38.4 mmol/L）、NaHCO3（85 mmol/L）和MgCl2（H2O）6（0.33 mmol/L），用緩沖液配制胰酶（5.62 g/L）和膽鹽（8.17 g/L），pH調至7.0，置于37 ℃水浴中20 min激發酶的活力。

消化開始前，調節溫度設置為37 ℃并提前預熱。預熱結束后，在胃中加入0.6 mL的SGF，再注入5 mL的樣品。設置設備運行參數：模擬胃液、腸液注入速度52 μL/min；排空速度104 μL/min；胃擠壓頻率3 cpm，胃滾動頻率12 cpm，腸滾動頻率36 cpm，消化時間為3 h，在腸消化0、30、90及180 min分別取模擬消化樣品。取樣后用于乳酸菌活菌計數樣品不經滅酶過程直接測定，用于可溶性蛋白、肽含量測定的樣品置于沸水浴滅酶處理5 min后進行測定。

1.2.4.2 肽含量測定 參照吳寒等[23]的方法進行肽含量的檢測。取不同消化時間的樣品200 μL，加入等體積10%三氯乙酸（w/w），充分混勻后在20 ℃條件下靜置沉淀4～5 h，離心15 min（5000 r/min，4 ℃）后收集上清液。取5 μL上清液，加入200 μL OPA反應試劑，室溫下反應2 min，在340 nm波長下測定吸光值，以胰酪蛋白胨標準溶液繪制標準曲線，標曲方程為y=0.1885x+0.1516，R2=0.9981，計算肽含量（μg/mL）。

1.2.4.3 可溶性蛋白含量測定 參照李洋[24]的方法，采用考馬斯亮藍法（Bradford）進行可溶性蛋白含量測定。準確吸取1 mL樣液與5 mL考馬斯亮藍染色液混勻，室溫下反應5 min，在595 nm波長下測定吸光值。根據以牛血清白蛋白為標準做出的標準曲線，標曲方程為y=0.1429x+0.3075，R2=0.9922，計算可溶性蛋白含量（μg/mL）。

1.2.4.4 乳酸菌活菌計數 乳酸菌活菌數參照Feng等[25]的方法，采用平板計數法測定。具體方法是：吸取雜豆凝膠消化產物100與900 μL無菌生理鹽水（0.85%，v/v）充分混合后梯度稀釋至一定倍數，采用MRS瓊脂培養基平板傾注法，在37 ℃條件下倒置培養48 h計菌落總數，測定乳酸菌活菌數。

1.3 數據處理

試驗數據為3次重復試驗結果的平均值，采用SPSS 22.0軟件對數據進行ANOVA單因素方差分析，應用Duncan檢測對結果進行顯著性分析（P＜0.05），采用Origin 8.5軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 四種雜豆蛋白提取物的主要成分分析

四種雜豆蛋白提取物的主要成分含量如表1所示。由表1可知，四種雜豆蛋白提取物蛋白質含量均達80%以上，其中，LP蛋白質含量最高，CP蛋白質含量最低，四種雜豆蛋白含量均具有顯著差異性（P＜0.05）。PP和RKP脂肪含量較高于CP與LP。四種雜豆蛋白中RKP碳水化合物含量最低，CP、LP和PP碳水化合物含量相似。CP灰分含量為5.81%，顯著高于其他三種雜豆（P＜0.05），RKP、LP與PP灰分含量無顯著差異（P＞0.05）。

表 1 四種雜豆蛋白提取物的主要成分含量Table 1 The content of main components of four pulse proteins

2.2 四種雜豆蛋白種類及濃度對發酵速率的影響

四種雜豆蛋白種類及濃度對發酵速率的影響如表2所示。發酵導致四種雜豆蛋白的pH均呈下降趨勢。由表2可知，下降速率隨pH降低逐漸減緩。四種雜豆蛋白相比，蛋白濃度為0.1%（w/v）的RKP和PP樣品發酵速率更快；蛋白濃度為1.0%～3.0%（w/v）的LP和RKP樣品發酵速率更快，這說明低蛋白濃度的RKP和PP和高濃度的LP和RKP發酵性能更優異。此外，高濃度蛋白（2.0%～3.0%，w/v）條件下，pH下降速率減緩，蛋白濃度在3.0%（w/v）的CP、RKP和PP在pH5.5至4.5酸化速率變慢，而3.0%（w/v）的LP酸化速率無明顯變化。說明LP的膠凝過程受蛋白濃度影響較小，而高濃度的CP、RKP和PP可以顯著延緩植物乳桿菌的產酸速率（P＜0.05），這可能與高濃度蛋白具有更強的緩沖作用有關[26]。四種雜豆蛋白發酵速率的差異與乳酸菌差異化利用雜豆蛋白作為生長所需氮源密切相關。四種雜豆蛋白的組成、結構、小分子肽含量均可能導致乳酸菌代謝變化，從而影響產酸速率。郭增旺等[27]發現球蛋白含量影響了蕓豆蛋白的成膠速率。

2.3 最小臨界凝膠濃度的測定

不同發酵時間及不同pH對四種雜豆蛋白成膠特性的影響如圖1所示。CP、RKP、LP和PP的最小臨界凝膠濃度（LGC）分別為1.6%（w/v）、1.6%（w/v）、1.4%（w/v）和1.2%（w/v），說明PP可以在較低的蛋白濃度下形成凝膠，其次為LP，而CP和RKP需要較高的濃度才可以形成凝膠。四種雜豆蛋白的LGC值均低于文獻報道的乳酸菌誘導大豆蛋白形成凝膠的LGC值，說明四種雜豆蛋白具有良好的成膠特性[26]。

圖 1 不同蛋白濃度及不同發酵終點pH對四種雜豆蛋白成膠特性的影響Fig.1 Effects of different protein concentrations and fermentation terminal pH values on the gelatinization characteristics of four pulse proteins

四種雜豆LGC值的差異可能與各雜豆蛋白組成及蛋白結構差異密切相關。安馨等[14,16]研究表明雜豆蛋白中球、清蛋白含量均占80%以上，但其比例各不相同，如蕓豆、鷹嘴豆、小扁豆球蛋白含量較高，而清蛋白含量較低；豌豆蛋白中球蛋白含量較低（56.6%±0.60%），清蛋白含量較高（34.0%±4.34%）。這可能是造成PP的LGC值較低的原因之一。此外，提高蛋白濃度促使雜豆蛋白在較高的pH條件下形成凝膠。當蛋白溶液濃度提升至2.0%（w/v）時，CP 和 LP 初始凝膠 pH 由 4.5 上升至 5.0，RKP 和 PP初始凝膠pH分別由4.5和5.0上升至5.5，這可能與四種雜豆蛋白中游離巰基等基團含量的差異有關，Yang等[28-29]研究指出PP和RKP的游離巰基含量高于LP和CP的游離巰基含量，且游離巰基含量可能與蛋白凝膠點呈正相關。

表 2 雜豆蛋白種類及濃度對發酵速率的影響Table 2 Effects of four pulse proteins and concentrations on the fermentation rate

2.4 四種雜豆蛋白凝膠的質構特性分析

根據雜豆蛋白的最小凝膠濃度和發酵過程中pH下降規律，選取蛋白濃度在2.0%（w/v），發酵終點pH為5.0的四種雜豆蛋白凝膠做進一步研究。

四種雜豆蛋白凝膠的質構特性如表3所示。由表3可知，雜豆蛋白種類對凝膠彈性和膠粘性的影響差異不顯著（P＞0.05）。CP與LP蛋白凝膠的硬度顯著高于RKP與PP（P＜0.05），且LP蛋白凝膠的硬度顯著高于CP（P＜0.05），說明CP與LP的蛋白凝膠機械強度更高，特別是LP蛋白凝膠，而RKP與PP硬度較低。CP、PP和RKP蛋白凝膠的內聚性顯著高于LP（P＜0.05），說明LP蛋白凝膠內部結合力更小，這可能與四種雜豆蛋白組成差異有關。四種雜豆蛋白凝膠硬度和彈性值與文獻報道的乳酸菌發酵大豆蛋白凝膠相比較低，說明雜豆蛋白形成的凝膠比較柔軟，可能與LGC值較低有關[9]。

表 3 四種雜豆蛋白凝膠的質構特性Table 3 Textural properties of four pulses protein gels

2.5 四種雜豆蛋白發酵前后的色差分析

凝膠的色澤是影響其外觀和認可度的重要指標之一，其中L*代表亮度，a*為紅度值，b*為黃度值，ΔE越大表示樣品的顏色變化的程度越大。

四種雜豆蛋白發酵前后的色澤的變化如表4所示。由表4可知，發酵后四種雜豆蛋白的L*值均增大，說明四種雜豆蛋白發酵后凝膠亮度增加，其中，LP的亮度提升程度較高。這可能與凝膠的網絡結構增大了光反射的程度有關[30]。有研究[31]證明孔隙更小的凝膠網絡會導致反射光增強，因此亮度值更大。這與樣品的微觀結構相符。此外，CP、LP和PP的a*值均偏向綠色且b*值均偏向黃色，而RKP的a*值偏向紅色且b*值偏向黃色。發酵沒有改變四種雜豆蛋白的a*、b*值偏向，但改變了其偏向程度。發酵后CP、LP和PP蛋白的a*、b*絕對值增大，而RKP的a*、b*絕對值減小，說明發酵增加了CP、LP和PP的黃綠程度且降低RKP的紅黃程度。從總色差（ΔE）的測定來看，發酵后四種雜豆蛋白凝膠樣品的總色差均減小且總色差仍差異顯著（P＜0.05），其中，CP和LP樣品降幅明顯小于RKP和PP，說明LP和CP顏色變化程度更淺。這與計紅芳等[32]研究報道豌豆蛋白與牛肉鹽溶蛋白共混形成凝膠后樣品亮度增大以及紅度和黃度偏向加深相符。

表 4 四種雜豆蛋白發酵前后的色差分析Table 4 Chromatic aberration between the four pulse proteins before and after fermentation

2.6 四種雜豆蛋白凝膠的微觀結構分析

微觀結構的表征是研究凝膠結構與特性的重要手段。四種雜豆蛋白凝膠的微觀結構如圖2所示。由圖2可知，所有雜豆蛋白凝膠樣品的微觀結構都呈現網狀多孔結構，且不同雜豆蛋白凝膠網絡結構存在一定差異。RKP和PP樣品均具有帶非均質孔[33]和大量粗鏈的凝膠結構，其孔徑約為20 μm。而CP和LP呈現出密集和精細的蛋白三維凝膠網絡，其孔徑約為2.5 μm。與LP相比，CP的三維凝膠網絡含有大量粗鏈且網孔分布不均勻，LP形成一種無粗鏈結構、孔洞均勻的三維凝膠網絡。聶麗潔[16]曾指出球蛋白含量更高的CP和LP蛋白凝膠結構更致密。Xing等[34]研究報道乳酸菌發酵的大豆生物豆腐中呈現類似的蜂窩狀凝膠網絡結構[35]。

圖 2 四種雜豆蛋白凝膠的微觀結構Fig.2 Microstructure of four pulses protein gels

2.7 雜豆蛋白凝膠對動態胃腸道消化的pH影響分析

四種雜豆蛋白凝膠對胃腸道消化pH的影響如圖3所示。雜豆蛋白凝膠中蛋白質等物質具有一定的緩沖作用。蛋白質結構的改變可能引起酶解特性[36]的變化。由圖3可知，腸道消化的初始pH為7.0，在腸消化前期（0～30 min），LP的腸消化液的pH最高，PP的腸消化液pH最低，各樣品間均存在顯著差異（P＜0.05），這可能與其胃腸轉換速率及堿性氨基酸的釋放有關[37]。在腸消化中期和后期（30～180 min），RKP與PP蛋白的腸消化液pH變化比CP與LP更劇烈，說明CP與LP蛋白對胃腸液的緩沖能力高于RKP與PP蛋白，這可能與致密的凝膠網絡更耐受胃腸液的環境[38]有關。有研究表明雜豆蛋白中球蛋白在胃腸消化過程中緩沖能力高于清蛋白[16]，這可能是球蛋白含量高的CP和LP蛋白凝膠樣品具有更強的緩沖能力的原因。

圖 3 四種雜豆蛋白凝膠對動態胃腸道消化pH的影響Fig.3 Effects of four pulses protein gels on the pH of dynamic gastrointestinal digestion

2.8 雜豆蛋白凝膠在胃腸道消化過程中可溶性蛋白含量的變化

四種雜豆蛋白凝膠在腸消化中可溶性蛋白的含量如圖4所示。可溶性蛋白含量表征容易發生酶水解的蛋白質數量指標[39]。由圖4可知，四種蛋白凝膠經動態胃腸消化后可溶性蛋白含量均呈現先上升后下降的趨勢。在消化早期（0～30 min），各組雜豆凝膠可溶性蛋白呈上升趨勢且于腸消化30 min達到頂點，表明可溶性蛋白在消化早期呈現釋放過程。其中，LP消化產物可溶性蛋白含量最高，其次為CP和RKP，而PP可溶性蛋白顯著較低（P＜0.05）。這一研究結果說明LP、CP與RKP凝膠在腸道蠕動、pH作用與消化酶解作用下更易釋放可溶性蛋白。在消化中期和后期（30～180 min），各組樣品可溶性蛋白含量下降，這可能是由于排空或蛋白降解[40]為小分子肽所致，CP和LP蛋白凝膠的可溶性蛋白含量減少量顯著低于RKP和PP蛋白凝膠（P＜0.05），可能與其較為致密的凝膠結構有關。Yang等[41]研究指出致密的凝膠網絡會延緩胃消化過程的蛋白質水解速率。

圖 4 四種雜豆蛋白凝膠在胃腸道消化過程中可溶性蛋白含量的動態變化Fig.4 The dynamic change of soluble protein content in four pulse protein gels at gastrointestinal digestion

2.9 雜豆蛋白凝膠在胃腸道消化過程中肽含量的變化

四種雜豆蛋白凝膠在腸消化時間（0、30、90、120 min）的消化產物中肽的含量變化如圖5所示。由圖5可知，在腸消化早期（0～30 min），CP與LP蛋白凝膠釋放的肽含量明顯高于RKP與PP蛋白凝膠且CP與LP蛋白凝膠的肽含量均為RKP和PP蛋白凝膠的兩倍左右，說明CP和LP凝膠酶解速率較快，這可能與蛋白酶對CP和LP蛋白水解作用更強和可溶性蛋白底物量更高有關[42]；在消化中期和后期（30～180 min），盡管RKP和PP消化產物的肽含量得到了一定程度的提升，但CP和LP的肽含量仍顯著高于RKP和PP（P＜0.05），且CP與LP之間的肽含量仍存在顯著差異（P＜0.05），這說明不同雜豆在乳酸菌作用下形成的凝膠及結構差異可能蛋白酶切位點暴露的差異，從而影響其消化效率。結果表明，結構較為致密的凝膠（CP和LP）釋放肽的能力優于結構較為疏松的凝膠（RKP和PP）。四種雜豆蛋白凝膠肽含量變化趨勢與大豆蛋白凝膠的體外消化特性相似，研究表明，乳酸菌誘導的大豆蛋白凝膠網絡結構對蛋白質消化及釋放肽有一定的延緩作用[43]。這與本研究結果相似。

圖 5 四種雜豆蛋白凝膠在胃腸道消化中肽含量的動態變化規律Fig.5 The dynamic change of peptide content in four pulse protein gels at gastrointestinal digestion

2.10 雜豆蛋白凝膠在動態胃腸消化中對植物乳桿菌B1-6活力的保護作用研究

乳酸菌通常以口服的形式進入人體，所以只有耐受胃及十二指腸道的嚴苛環境，到達小腸才能發揮生理功效。因此，對植物乳酸桿菌在不同雜豆蛋白凝膠結構內的耐受胃腸消化的程度進行了比較研究。

四種雜豆蛋白凝膠在胃腸道中消化對植物乳桿菌B1-6活菌數的影響如圖6所示。由圖6可知，經動態胃腸消化后，四種雜豆蛋白凝膠中植物乳桿菌的存活率均呈下降趨勢。在消化前期與中期（0～90 min），CP、LP與PP樣品的植物乳酸桿菌存活率顯著高于RKP（P＜0.05）。在消化后期（90～180 min），所有雜豆蛋白的植物乳桿菌存活率均下降至最低且四組凝膠不存在顯著差異（P＞0.05）。結果表明，消化前期和中期致密的凝膠網絡結構對植物乳桿菌的保護作用更佳，凝膠結構在消化后期的解構導致植物乳桿菌的保護作用的大幅削弱。這與伍鵬等[44]報道發酵乳中酪蛋白在胃腸道消化環境中形成結構致密的凝聚物對乳酸菌有保護作用類似。李軍等[45]曾報道腸道消化階段末期動物雙歧桿菌活菌數大量下降，這與本研究結果一致。

圖 6 胃腸道消化過程中四種雜豆蛋白凝膠中植物乳桿菌活菌數的變化規律Fig.6 Changes in vitality of Lactobacillus plantarum in four pulses protein gels at the gastrointestinal digestion

3 結論

本文對植物乳桿菌引導四種雜豆（鷹嘴豆、紅蕓豆、小扁豆、豌豆）蛋白凝膠形成及特性進行了研究，結果表明：鷹嘴豆蛋白、紅蕓豆蛋白、小扁豆蛋白和豌豆蛋白的最小臨界凝膠濃度（LGC）分別為1.6%（w/v）、1.6%（w/v）、1.4%（w/v）和1.2%（w/v）；質構特性結果表明CP和LP蛋白凝膠硬度顯著高于RKP和PP蛋白凝膠（P＜0.05），微觀結構結果表明CP和LP形成的凝膠具有較為致密而均勻的三維蛋白凝膠網絡，而RKP與PP形成的凝膠微觀結構較為疏松。采用動態模擬胃腸道消化模型對具有不同結構特征的四種雜豆蛋白凝膠進行消化特性評估，結果表明，CP、LP蛋白在消化早、中期的可溶性蛋白和肽含量顯著高于另兩組蛋白凝膠（RKP和PP），且CP、LP蛋白凝膠對植物乳桿菌B1-6的保護作用顯著優于另兩組蛋白凝膠。本研究結果有助于加深對四種雜豆蛋白在乳酸菌發酵作用下表現出差異性膠凝能力及消化特性的影響認知，為明確不同雜豆蛋白在乳酸菌作用下的發酵性能、凝膠特性及營養特性提供了理論與應用基礎。