不同采收期蟲草參多酚對(duì)羥基自由基介導(dǎo)的DNA氧化損傷保護(hù)作用的研究

高春燕，郭 琦，李媛麗，李 望，盧躍紅,

（1.北方民族大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，寧夏銀川 750021；2.大理大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，云南大理 671000）

自由基是人體內(nèi)產(chǎn)生的正常代謝的中間產(chǎn)物[1]。外部因素，如環(huán)境污染物、壓力、農(nóng)藥、輻射、水源污染、各種醫(yī)療處理也會(huì)促進(jìn)自由基的形成[2]。自由基具有高反應(yīng)活性，可以與糖類、蛋白質(zhì)、脂類、DNA等生物分子發(fā)生氧化反應(yīng)，啟動(dòng)自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，破壞生物機(jī)體的結(jié)構(gòu)，從而損害機(jī)體[3-5]。其中，自由基攻擊DNA，可引起細(xì)胞內(nèi)DNA的氫鏈斷裂、堿基降解和主鏈解旋，可造成細(xì)胞生物學(xué)活性改變，甚至導(dǎo)致基因突變、腫瘤與細(xì)胞死亡。此外，自由基被認(rèn)為是引起衰老和各種慢性疾病，如神經(jīng)系統(tǒng)疾病、心血管疾病、癌癥和糖尿病的重要因素[6-9]。多酚，廣泛存在于植物的花、莖、葉及果實(shí)中[10]。大量的研究表明，多酚是良好的抗氧化劑，具有顯著的自由基清除活性[11-14]。

蟲草參（Lycopus lucidusTurcz.），系唇形科地筍屬多年生草本植物的地下根莖[15]。在我國(guó)，主要分布在山東、四川、重慶、廣西等地區(qū)。其中，在云南主要分布在麗江、大理、昆明[16]。大理劍川沙溪鎮(zhèn)是云南省境內(nèi)野生蟲草參的原產(chǎn)地，現(xiàn)已建成大規(guī)模的人工引種栽培基地。蟲草參富含酚酸[17]、黃酮[18]、三萜類[19]、多糖等植物化學(xué)物[20-21]，具有抗氧化[22]、抗衰老[23]、降血糖[24]、降血脂[25-26]、增強(qiáng)免疫[27]、抗腫瘤等功能活性[28-29]。蟲草參作為云南高原特色食品資源[19]，在民間傳統(tǒng)中以炒制、燉煮、油炸和腌漬食用等為主。

自當(dāng)年種植的11月份至次年的1月份，可陸續(xù)進(jìn)行蟲草參的采挖。先前，郭琦等[30]已經(jīng)報(bào)道了四聯(lián)村三個(gè)采收期蟲草參對(duì)ROO·介導(dǎo)的DNA損傷的保護(hù)作用，但對(duì)·OH介導(dǎo)的DNA損傷的保護(hù)作用尚未見報(bào)道。為了進(jìn)一步明確蟲草參對(duì)不同自由基介導(dǎo)的DNA損傷保護(hù)作用，本文以兩個(gè)采收地三個(gè)采收期的蟲草參為原料，采用分步提取法，提取了蟲草參中的游離酚和結(jié)合酚，測(cè)定了提取物的多酚含量，并采用HPLC法檢測(cè)了沒(méi)食子酸、綠原酸、咖啡酸和迷迭香酸在提取物中的含量。同時(shí)采用體外·OH介導(dǎo)的DNA氧化損傷體系，評(píng)價(jià)了蟲草參多酚提取物對(duì)DNA氧化損傷的保護(hù)作用，以期為蟲草參功能活性的開發(fā)提供理論依據(jù)，同時(shí)為DNA損傷的預(yù)防與治療提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

蟲草參 采自云南省劍川縣沙溪鎮(zhèn)江尾村（S1）和鰲鳳村（S2）三個(gè)采收期（T1：2016/11/28；T2：2016/12/27；T3：2017/01/27）的新鮮樣品，清洗，凍干，粉碎，過(guò)60目篩，-20 ℃冷藏備用；pBR322質(zhì)粒DNA（0.5 μg/μL）、咖啡酸、綠原酸、迷迭香酸、沒(méi)食子酸、Folin-酚試劑、Trolox 標(biāo)品純度≥99%，Sigma-Aldrich公司；色譜甲醇 美國(guó)Fisher公司；其它試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

Scientz-18ND型真空冷凍干燥機(jī) 寧波新芝生物科技股份有限公司；V-T3可見分光光度計(jì) 屹譜儀器制造（上海）有限公司；Agilent 1200高效液相色譜儀和Agilent ZORBAX SB-C18色譜柱 美國(guó)Agilent公司；DYY-6C型雙穩(wěn)定時(shí)電泳儀和WD-9413C型凝膠成像分析系統(tǒng) 北京六一科技生物有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 多酚的提取 參考文獻(xiàn)[31]的方法進(jìn)行游離酚和結(jié)合酚的提取。游離酚的提取步驟：5.0 g蟲草參粉，80%甲醇超聲波輔助（37 ℃、500 W）提取3次（10 min/次），合并濾液，旋蒸，剩余水相調(diào)pH至1～2，乙酸乙酯萃取3次，合并乙酸乙酯相，旋蒸，剩余殘留物凍干，得游離酚提取物。

結(jié)合酚的提取步驟：提取完游離酚后所得蟲草參殘?jiān)琋aOH（2 mol/L，含乙二胺四乙酸和維生素C），室溫避光震蕩水解4 h，調(diào)pH至1～2，抽濾，濾液乙酸乙酯萃取3次，合并乙酸乙酯相，旋蒸，剩余殘留物凍干，得結(jié)合酚提取物。

1.2.2 多酚含量的測(cè)定 采用Folin-酚法測(cè)定[32]，分別吸取0.00、0.08、0.12、0.16、0.20、0.24、0.28 mL 100 μg/mL沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液于10 mL具塞試管中，加入100 μL Folin-酚試劑，混勻，3 min后，加入2 mL 7.5%（w/v）Na2CO3，蒸餾水定容至5 mL刻度處，混勻，置暗室反應(yīng)40 min。待反應(yīng)結(jié)束后于760 nm處測(cè)定吸光值。以沒(méi)食子酸濃度為橫坐標(biāo)，以吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。得沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=0.0965x+0.0974（0～6.4 μg/mL），相關(guān)系數(shù)R2=0.9917。配制一定濃度的地參游離酚和結(jié)合酚提取物待測(cè)液，分別吸取0.1 mL，按上述步驟，測(cè)定其多酚含量。多酚含量測(cè)定結(jié)果以沒(méi)食子酸等量每毫克提取物干重表示（μg GAE/mg）。

1.2.3 HPLC分析條件 色譜柱：Agilent ZORBAX SB-C18色譜柱（5 μm，250 mm×4.6 mm）；流速：1 mL/min；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)：320 nm。流動(dòng)相A：100%色譜甲醇；流動(dòng)相B：色譜甲醇:冰乙酸:H2O，10:1:89。

蟲草參游離酚和結(jié)合酚梯度洗脫條件見表1。以峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，以濃度（C）為橫坐標(biāo)，在游離酚洗脫條件下，沒(méi)食子酸、綠原酸、迷迭香酸和咖啡酸的回歸方程分別為Y=1.915C-2.19（R2=0.9929，10～50 μg/mL）、Y=31.786C-154.62（R2=0.9936，10～50 μg/mL）、Y=20.75C-335.16（R2=0.9985，40～200 μg/mL）和Y=65.704C-989.22（R2=0.9925，40～200 μg/mL）；在結(jié)合酚洗脫條件下，沒(méi)食子酸、綠原酸、迷迭香酸和咖啡酸的回歸方程分別為Y=1.975C+1.01（R2=0.9964，10～50 μg/mL）、Y=30.683C-136.23（R2=0.9982，10～50 μg/mL）、Y=14.186C-54.828（R2=0.9914，5～40 μg/mL）和 Y=53.679C-166.8（R2=0.9934，5～40 μg/mL）。樣品中含量的測(cè)定結(jié)果以微克每毫克提取物表示（μg/mg）。

表 1 HPLC梯度洗脫條件Table 1 Gradient elution conditions of HPLC

1.2.4 多酚提取物DNA氧化損傷保護(hù)作用的測(cè)定參考Jeong等[33]的方法進(jìn)行測(cè)定。具體操作流程為：1 μL質(zhì)粒DNA、10 μL 10 mmol/L pH7.4 PBS、分別加入5 μL游離酚溶液（25、50、100、200、300 μg/mL）、結(jié)合酚溶液（3.125、6.25、12.5、25、50 μg/mL）（正常組和損傷組為5 μL PBS），充分混勻，加入2 μL 1 mmol/L FeSO4和2 μL 1 mmol/L H2O2（正常組為4 μL PBS），37 ℃水浴30 min，取出4 μL，加入2 μL loading buffer，混勻，吸取4 μL，加入1.0%的瓊脂糖凝膠Tris/Acetate/EDTA緩沖液中電泳50 min，凝膠成像系統(tǒng)測(cè)定灰度值。按下式計(jì)算雙螺旋百分比：雙螺旋百分比（%）=G1/（G1+G2+G3）×100。式中：G1、G2和G3分別為雙螺旋、開環(huán)和線性DNA的灰度值；以Trolox（25、50、100、200、300 μg/mL）作為陽(yáng)性對(duì)照。

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 蟲草參多酚提取物的多酚含量

兩個(gè)采收地三個(gè)采收期的蟲草參多酚提取物的多酚含量見表2。蟲草參游離酚和結(jié)合酚提取物的多酚含量范圍分別為86.53～181.40和89.70～193.58 μg GAE/mg，且S2采收地的高于S1。不同采收地的蟲草參游離酚和結(jié)合酚在采收過(guò)程中多酚含量變化趨勢(shì)存在差異。就游離酚而言，S1采收地的蟲草參呈現(xiàn)T1＜T2＜T3的趨勢(shì)，而S2采收地的呈現(xiàn)T3＜T2＜T1的趨勢(shì)；就結(jié)合酚而言，S1采收地的蟲草參呈現(xiàn)T1＜T3＜T2的趨勢(shì)，而S2采收地的呈現(xiàn)T2＜T3＜T1的趨勢(shì)。采用析因分析檢驗(yàn)了采收地和采收期對(duì)多酚提取物多酚含量的影響以及兩因素的交互作用，結(jié)果見表3和表4。就游離酚而言，其多酚含量不僅受到采收地和采收期的影響，同時(shí)還受到兩因素的共同交互作用；就結(jié)合酚而言，其多酚含量受到采收地的影響和兩因素的共同交互作用。與植物多酚的合成與代謝有關(guān)的酶有苯丙氨酸解氨酶（PAL）、酪氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（TAT）、肉桂酸-4-羥基化酶（C4H）、多酚氧化酶（PPO）等。不同采收地蟲草參在采收過(guò)程中酶的合成或者酶的活性發(fā)生的變化不同，從而影響了蟲草參中游離酚和結(jié)合酚的合成與代謝，致使其在不同采收期多酚含量存在差異[34]。

表 2 蟲草參多酚提取物的多酚含量（μg GAE/mg）Table 2 Polyphenolic content of extracts from Lycopus lucidus Turcz. (μg GAE/mg)

表 3 采收地和采收期對(duì)蟲草參游離酚提取物多酚含量的主體間效應(yīng)檢驗(yàn)Table 3 The test of between-subjects effects of collect sites and harvest times on the polyphenolic content of free phenolic extract from Lycopus lucidus Turcz.

表 4 采收地和采收期對(duì)蟲草參結(jié)合酚提取物多酚含量的主體間效應(yīng)檢驗(yàn)Table 4 The test of between-subjects effects of collect sites and harvest times on the phenolic content of bound phenolic extract from Lycopus lucidus Turcz.

2.2 蟲草參多酚提取物中多酚組成的HPLC分析結(jié)果

根據(jù)前期研究結(jié)果[17,30]，采用HPLC檢測(cè)了蟲草參多酚提取物中四種酚酸的含量，代表性的色譜圖見圖1。可以看出，結(jié)合酚中分離出的色譜峰多于游離酚，且沒(méi)食子酸和綠原酸在所有樣品中均未檢出。咖啡酸在游離酚中含量較低甚至未檢出，在結(jié)合酚中的含量范圍為6.53～44.29 μg/mg，迷迭香酸在游離酚和結(jié)合酚中的含量范圍分別為40.43～77.64和1.93～5.32 μg/mg（表5），表明咖啡酸在結(jié)合酚中含量較高，而迷迭香酸在游離酚中含量較高。此外，不同采收地同一采收期游離酚和結(jié)合酚提取物中咖啡酸和迷迭香酸的含量水平不同，S2采收地蟲草參中的咖啡酸含量高于S1；而迷迭香酸在游離酚中，T1和T3采收期，S2采收地的高于S1，相反在T2采收期，S2采收地的低于S1，在結(jié)合酚中，三個(gè)采收期均為S2采收地的高于S1。這種含量的差異可歸因于采收地對(duì)咖啡酸和迷迭香酸在蟲草參生長(zhǎng)過(guò)程中合成代謝的影響不同。

圖 1 代表性的 HPLC 色譜圖Fig.1 Representative HPLC chromatograms

表 5 蟲草參多酚提取物中迷迭香酸和咖啡酸的含量（μg/mg）Table 5 The content of rosmarinic acid and caffeic acid in phenolic extracts from Lycopus lucidus Turcz. (μg/mg)

2.3 蟲草參多酚提取物對(duì)DNA氧化損傷的保護(hù)作用

蟲草參游離酚和結(jié)合酚提取物對(duì)DNA氧化損傷的保護(hù)作用分別見圖2和圖3。正常的pBR322質(zhì)粒DNA主要為雙螺旋結(jié)構(gòu)（泳道1），被·OH氧化損傷的DNA，主要為開環(huán)和線性結(jié)構(gòu)（泳道2）。與損傷的DNA相比，添加了蟲草參多酚提取物后，DNA雙鏈被損傷的程度明顯減弱（泳道3～7）。保護(hù)作用的定量分析結(jié)果以雙螺旋百分比（%）進(jìn)行表征，值越大，表明保護(hù)效果越好。

在25～300 μg/mL濃度范圍內(nèi)，蟲草參游離酚提取物對(duì)DNA氧化損傷保護(hù)作用的雙螺旋百分比范圍為1.81%%～55.04%（圖2），且不同采收地保護(hù)作用不同。就S1而言，其雙螺旋百分比范圍為3.99%～49.15%，且不同采收期保護(hù)作用存在差異；T1采收期的雙螺旋百分比范圍為8.29%～49.15%，且呈現(xiàn)先升高后降低而后又上升的趨勢(shì)，當(dāng)濃度從25 μg/mL提高至50 μg/mL時(shí)，保護(hù)作用也提高，當(dāng)提高至100 μg/mL時(shí)反而又降低，進(jìn)一步從100提高至300 μg/mL時(shí)，保護(hù)作用也逐漸提高；T2采收期的雙螺旋百分比在3.99%～32.33%范圍內(nèi)，且在50 μg/mL時(shí)，保護(hù)作用最強(qiáng)；T3采收期的雙螺旋百分比范圍為8.66%～44.78%，當(dāng) 濃 度 從25 μg/mL提 高 至50 μg/mL時(shí)，保護(hù)作用逐漸減小，當(dāng)濃度提高至100～200 μg/mL時(shí)，保護(hù)作用顯著增強(qiáng)，且達(dá)到最大，但當(dāng)濃度進(jìn)一步提高至300 μg/mL時(shí)，保護(hù)作用反而又減弱。就S2而言，其雙螺旋百分比范圍為1.81%～55.04%，且不同采收期保護(hù)作用同樣存在差異；T1采收期的雙螺旋百分比范圍為6.84%～50.19%，當(dāng)濃度從25 μg/mL提高至50 μg/mL時(shí)，保護(hù)作用無(wú)顯著變化，當(dāng)濃度提高至100 μg/mL時(shí)，保護(hù)作用顯著升高，而后隨著濃度的增加呈波浪性變化；T2采收期雙螺旋百分比范圍為30.14%～55.04%，保護(hù)作用隨著濃度的增加呈現(xiàn)先降低后升高，而后再降低的變化趨勢(shì)；T3采收期雙螺旋百分比范圍為1.81%～50.10%，保護(hù)作用隨著濃度的提高呈現(xiàn)先升高后降低的變化趨勢(shì)，在50 μg/mL時(shí)，保護(hù)作用最強(qiáng)。

在3.125～50 μg/mL濃度范圍內(nèi)，蟲草參結(jié)合酚提取物對(duì)DNA氧化損傷保護(hù)作用的雙螺旋百分比范圍為1.67%～70.83%（圖3），與游離酚相似，不同采收地保護(hù)作用不同。就S1而言，其雙螺旋百分比范圍為1.67%～45.36%，且不同采收期保護(hù)作用存在差異；T1采收期的雙螺旋百分比在4.68%～45.36%范圍內(nèi)，且隨著濃度的增加呈現(xiàn)先升高后降低而后又升高的趨勢(shì)，在6.25 μg/mL時(shí)，保護(hù)作用達(dá)到最大；T2采收期的雙螺旋百分比在1.67%～5.94%之間，幾乎無(wú)保護(hù)作用；T3采收期的雙螺旋百分比在2.56%～39.99%范圍內(nèi)，且呈現(xiàn)先降低后升高而后又降低的趨勢(shì)，在25 μg/mL時(shí)保護(hù)作用達(dá)到最大。就S2而言，其雙螺旋百分比范圍為3.03%～70.83%，且不同采收期保護(hù)作用同樣存在差異；T1采收期的雙螺旋百分比在3.03%～51.87%范圍內(nèi)，隨著濃度的提高保護(hù)作用呈現(xiàn)先降低后升高而后又降低的趨勢(shì)，在25 μg/mL時(shí)，保護(hù)作用最大；T2采收期的雙螺旋百分比在17.71%～55.94%范圍內(nèi)，當(dāng)濃度由3.125 μg/mL提高至6.25 μg/mL時(shí)，保護(hù)作用顯著下降，繼續(xù)提高至25 μg/mL時(shí)，保護(hù)作用無(wú)顯著性差異，進(jìn)一步增加至50 μg/mL時(shí)，保護(hù)作用顯著提高且達(dá)到最大；T3采收期的雙螺旋百分比在15.87%～70.83%范圍內(nèi)，當(dāng)濃度從3.125 μg/mL提高至25 μg/mL時(shí)，保護(hù)作用逐漸增加，但當(dāng)濃度繼續(xù)提高至50 μg/mL時(shí)，保護(hù)作用反而顯著下降。

圖 2 蟲草參游離酚對(duì) DNA 氧化損傷的保護(hù)作用Fig.2 DNA oxidative damage protective effect of free phenolics from Lycopus lucidus Turcz.

圖 3 蟲草參結(jié)合酚對(duì) DNA 氧化損傷的保護(hù)作用Fig.3 DNA oxidative damage protective effects of bound phenolics from Lycopus lucidus Turcz.

具有清除·OH和螯合Fe2+能力的化合物，對(duì)·OH介導(dǎo)的DNA氧化損傷，都會(huì)顯示出一定的保護(hù)作用。通過(guò)浸提法獲得的多酚粗提物中通常含有色素、糖類、蛋白質(zhì)、氨基酸等非多酚類成分，而這些物質(zhì)同樣具有清除自由基和螯合Fe2+的能力[35-36]。此外，多酚提取物中的各成分之間對(duì)DNA損傷的保護(hù)作用可能存在拮抗或協(xié)同的關(guān)系。因此，蟲草參多酚提取物對(duì)DNA氧化損傷的保護(hù)作用未呈現(xiàn)出劑量依賴效應(yīng)。

陽(yáng)性對(duì)照Trolox對(duì)DNA氧化損傷的保護(hù)作用見圖4，在濃度25～300 μg/mL范圍內(nèi)，其雙螺旋百分比范圍為53.27%～77.28%，且濃度越大，保護(hù)效果越好。與Trolox相比，在25～300 μg/mL濃度范圍內(nèi)，S1和S2采收地的游離酚提取物對(duì)DNA氧化損傷保護(hù)作用的雙螺旋百分比最高分別為49.15%和55.04%，接近于25 μg/mL Trolox的保護(hù)作用；在3.125～50 μg/mL濃度范圍內(nèi)，S1和S2采收地結(jié)合酚提取物雙螺旋百分比最高分別為46.36%和70.83%，分別與25 和100 μg/mL Trolox（圖4中3、5泳道）的保護(hù)作用接近。大體上講，相較于游離酚，結(jié)合酚對(duì)DNA氧化損傷表現(xiàn)出更好的保護(hù)作用，這不僅與兩種不同結(jié)合態(tài)多酚提取物多酚含量水平的不同有關(guān)，還與兩種多酚提取物中多酚類化合物單體的組成存在差異有關(guān)。

圖 4 Trolox 對(duì) DNA 氧化損傷的保護(hù)作用Fig.4 DNA oxidative damage protective effects of Trolox

3 結(jié)論

蟲草參游離酚和結(jié)合酚提取物的多酚含量范圍分別為86.53～181.40 μg GAE/mg和89.70～193.58 μg GAE/mg，且S2采收地的高于S1。游離酚提取物的多酚含量不僅受到采收地和采收期的影響，同時(shí)還受到兩因素的共同交互作用；結(jié)合酚的多酚含量受到采收地的影響和兩因素的共同交互作用。兩個(gè)采收地三個(gè)采收期的蟲草參多酚提取物中均未檢出沒(méi)食子酸和綠原酸。咖啡酸在結(jié)合酚中含量較高，而迷迭香酸在游離酚中含量較高，且不同采收地含量存在差異。蟲草參多酚對(duì)·OH介導(dǎo)的DNA氧化損傷具有一定的保護(hù)作用，相較于游離酚，結(jié)合酚表現(xiàn)出更好的保護(hù)效果。