米曲霉RIB40高效同源重組和尿苷/尿嘧啶營養缺陷型菌株的構建

高育青，張豪杰，張丹鳳，潘裕添，張 峰,

（1.閩南師范大學福建省菌類活性物質工程技術研究中心，福建漳州 363000；2.閩南師范大學生物科學與技術學院，福建漳州 363000）

米曲霉（Aspergillus oryzae）是公認的食品安全菌株，主要用于醬油和酒類的釀制，以及發酵產生蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶和果膠酶等[1-4]。米曲霉3.042和米曲霉RIB40分別是在我國和日本廣泛應用于食品工業的兩種米曲霉菌種。它們的基因組長度都約為38 Mb，兩者的大部分功能基因都比較保守，但在菌株生長、耐鹽、環境抗性和次生代謝產物相關的基因方面具有一些不同點[5-6]。研究表明，米曲霉3.042菌株含有更多與細胞生長和環境抗性相關的基因而具有更強的生長活力。米曲霉RIB40菌株因含有較多的Na+、K+、甘油代謝相關基因，而更能耐受鹽脅迫，使其在食品工業應用中更有價值[7]。此外，3.042菌株和RIB40菌株在醇、酸和氨基酸形成相關的酶的基因上也有差異，這些差異造成兩者在生產醬油時產生不同的風味[8]。例如，侯麗華等[9]利用低鹽固態工藝研究發現米曲霉RIB40菌株在原料溶出、蛋白質的分解以及生產還原糖方面的能力較強。王瑩[10]在對兩株菌株的發酵性能的比較中發現米曲霉RIB40發酵的醬油偏醇香，而米曲霉3.042偏酯香。本研究以米曲霉RIB40為出發菌株，構建遺傳轉化體系，能為我國食品工業提供更為多樣的菌株選擇。

借助遺傳轉化手段能在較短時間內實現基因的遺傳改造，但首先需要建立高效的遺傳轉化體系。目前雖已有多種方法用于建立米曲霉的遺傳轉化體系，但是轉化效率并不十分理想。Sun等[11]利用農桿菌法以pyrG基因作為篩選標記構建了尿苷/尿嘧啶營養缺陷型的米曲霉3.042遺傳轉化體系，但是只獲得了0.1%的轉化率。近年，畢付提等[12]同樣利用農桿菌法以pyrG基因作為篩選標記，通過優化條件僅將米曲霉3.042的轉化效率提高到了8.33%。劉雪[13]利用PEG-CaCl2介導的基因重組技術以米曲霉3.951為出發菌株構建的米曲霉pyrG單缺失菌株，結果發現其同源重組效率低于5%[14]。由于目前多數的遺傳轉化體系都是基于外源基因在出發菌株體內發生的基因重組，因此建立高效的遺傳轉化體系必須使出發菌株具有發生高效的基因重組的潛力。在構建的尿苷/尿嘧啶營養缺陷型菌株基礎上，本研究進一步敲除了米曲霉中阻礙基因重組的Aoku70基因，能大大提高基因的重組效率。

本研究通過同源重組技術和5-氟乳清酸（5-Fluoroorotic Acid，5-FOA）的篩選作用對米曲霉RIB40的AopyrG和Aoku70基因進行雙敲除，旨在建立具有高重組效率的遺傳轉化體系，為今后米曲霉RIB40的遺傳改造提供了良好的出發菌株。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

米曲霉RIB40（Aspergillus oryzaeRIB40） 由華南理工大學潘力教授贈送；酵母提取物、蛋白胨英國OXOID公司；瓊脂粉 BBI生命科學有限公司；吐溫20、二甲基亞砜 西隴科學股份有限公司；Driselase、山梨醇、十二烷基硫酸鈉 北京蘭博利德生物技術有限公司；聚乙二醇4000 國藥集團化學試劑有限公司；Tris 廣州賽國生物科技有限公司；Lysing Enzymes和β-glucoronidase 美國Sigma公司；PDA培養基 美國BD公司；TransTaq? DNA Polymerase High Fidelity（HiFi） TransGen Biotech公司；2×Taq PCR Master Mix 北京金百特生物技術有限公司；瓊脂糖凝膠回收試劑盒 上海惠凌生物技術有限公司；5-FOA 上海生物工程有限公司；所用YGT、復蘇培養基及孢子洗脫液、DNA基因組小量抽提裂解液、原生質體裂解液、STC溶液和PEG Buffer的具體配方請參見文獻[15]。

GF88DX全自動高壓滅菌鍋 廈門致微儀器有限公司；T30三槽基因擴增儀 杭州朗基科學儀器有限公司；Elix Essential5反滲透純水系統 Merck Millipore；Synergy超純水系統 Millipore；LAS600凝膠成像分析系統 美國GE公司；Nanodrop2000超微量分光光度計 Thermo Scientific；TGL-20M臺式高速冷凍離心機 湘儀公司；Leica ICC50 E生物顯微鏡和LeicaSP8激光掃描共聚焦顯微鏡 徠卡公司；ZQLY-180F單目雙層全溫搖床 上海知楚儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 米曲霉基因組DNA的提取 將菌絲或孢子液接種到YGT液體培養基中，于30 ℃培養2 d后，室溫12000 r/min離心2 min收集菌絲。向菌絲中加入500 μL DNA基因組小量抽提裂解液，并于65 ℃金屬浴裂解菌絲30 min。向裂解物中加入200 μL 3 mol/L乙酸鉀，混勻后13000 r/min離心5 min。將上清液轉移至另一個EP管中并加入等體積的異丙醇，混勻后12000 r/min離心10 min，收集沉淀物。向沉淀物中加入700 μL 75%的乙醇溶液洗滌，13000 r/min離心5 min后棄上清，于50 ℃烘箱中烘干沉淀，最后加30 μL無菌水溶解DNA。

1.2.2 基因片段的擴增 首先按照TransTaq? DNA Polymerase High Fidelity試劑盒的說明書對目的基因的上下游同源臂和標記基因進行PCR擴增，反應總體積為100 μL。對PCR產物用0.8%瓊脂糖凝膠電泳并用瓊脂糖凝膠回收試劑盒進行回收，用超微量分光光度計測定DNA濃度。接著將上下游同源臂和標記基因DNA片段等摩爾比混合，使用TransTaq?DNA Polymerase High Fidelity試劑盒進行重疊延伸PCR反應（Overlap Extension PCR，OEPCR）。OE-PCR反應體系按照TransTaq?DNA Polymerase High Fidelity試劑盒說明書進行，OE-PCR反應程序參照文獻[16]。對OE-PCR產物用0.8%瓊脂糖凝膠進行電泳并用瓊脂糖凝膠回收試劑盒進行回收，用超微量分光光度計測定DNA濃度。

1.2.3 米曲霉原生質體的制備 將孢子液接種至100 mL YGT液體培養基中，30 ℃ 180 r/min培養16 h。用紗布收集菌絲，并用無菌水洗滌菌絲，再用濾紙吸干水分。向菌絲中加入5 mL原生質體裂解液，在30 ℃條件下裂解6 h。裂解后的混合物用擦鏡紙過濾，并用預冷的1.2 mol/L山梨醇沖洗。將濾液于4 ℃冷凍離心機中4500 r/min離心15 min后，收集沉淀物。向沉淀物中加入300 μL預冷的1.2 mol/L STC溶液，再加入7%的二甲基亞砜重懸沉淀，分裝后于-80 ℃保存。

1.2.4 米曲霉的轉化及PCR驗證 將瓊脂糖凝膠回收的5 μg OE-PCR產物與預冷的200 μL STC溶液在無菌的EP管中混勻，再加入200 μL預冷的PEG Buffer混勻，最后加入100 μL原生質體。將混合物混勻后冰水浴30 min，然后再補加1 mL PEG Buffer，混勻后再冰水浴10 min。最后將上述混合液與頂層復蘇培養基混勻后倒入已凝固的底層復蘇培養基上，30 ℃培養至長出菌落。挑取轉化子接種到YGT液體培養基中，培養2 d后，按照1.2.1中的方法提取DNA。轉化子DNA的PCR驗證條件按照2×Taq PCR Master Mix說明書進行。取5 μL PCR產物用1%瓊脂糖凝膠進行電泳檢測。

1.2.5AopyrG基因的敲除 從NCBI數據庫中檢索到米曲霉的乳清酸核苷-5’-磷酸脫羧酶基因（AopyrG）的序列，并設計AopyrG上下游引物（AopyrG-L1和AopyrG-L2，AopyrG-R1和AopyrGR2，表1）。按照1.2.2中的方法，以AopyrG上下游引物分別擴增AopyrG的上下游同源臂（AopyrGL、AopyrGR），然后以AopyrG-P1和AopyrG-P2引物（表1）通過OE-PCR將上下游同源臂融合成一個片段（AopyrGLR）。按照1.2.4中的方法，將AopyrGLR片段轉化米曲霉RIB40的原生質體。在含有5-FOA培養基上挑取生長出來的菌株進行培養并進行PCR驗證。

表 1 PCR擴增中所用到的引物Table 1 Primers used in PCR amplification

1.2.6Aoku70基因的敲除 從NCBI數據庫中檢索到米曲霉的Aoku70序列，并設計引物。按照1.2.2中的方法，以引物Aoku70-L1和Aoku70-L2，Aoku70-R1和Aoku70-R3，Aoku70-R1和Aoku70-R2（表1）分別擴增Aoku70上游（Aoku70L）、部分下游（Aoku 70r）和下游同源臂（Aoku70R），以引物AfpyrGO1和AfpyrG-O2（表1）擴增AfpyrG基因。先通過OE-PCR得到Aoku70r-AfpyrG片段，然后再通過OE-PCR得到Aoku70L-Aoku70r-AfpyrG-Aoku70R片段（LrGR）。按照1.2.4中的方法，將LrGR片段轉化ΔAopyrG原生質體，挑取在不含有尿苷/尿嘧啶的培養基上生長出來的菌株進行培養和驗證。將驗證成功的菌株的孢子涂布到含有5-FOA的培養基上生長，挑取長出的菌株進行培養和PCR驗證。

1.2.7AoH2B-mCherry核定位熒光菌株的構建從NCBI數據庫中檢索到米曲霉組蛋白AoH2B的基因序列，并設計引物。按照1.2.2中的方法，以引物AoH2B-L1和AoH2B-L2，AoH2B-R1和AoH2B-R2（表1）分別擴增AoH2B-ORF區及其上游同源臂（AoH2BL）、下游同源臂（AoH2BR），然后以引物mCherry-AfpyrG-O1和mCherry-AfpyrG-O2（表1）擴增mCherry-AfpyrG片段，最后以AoH2B-P1和AoH2B-P2引物（表1）通過OE-PCR將同源臂和mCherry-AfpyrG片段融合成一個片段（AoH2BmCherry-AfpyrG-AoH2BR）。按照1.2.4中的方法，將AoH2B-mCherry-AfpyrG-AoH2BR融合片段轉化ΔAoku70ΔAopyrG雙缺失菌株的原生質體，在復蘇培養基上挑取生長出來的菌株進行培養及PCR驗證。

1.2.8mCherry熒光的檢測 將10 μL含有mCherry基因的米曲霉孢子液接種于YGT液體培養基中，在30 ℃搖床中培養。培養12 h后，12000 r/min 離心5 min收集萌發的孢子。將孢子分散鋪于載玻片上，用10 μL無菌水沖洗孢子，并用擦鏡紙小心地吸走水分，蓋上蓋玻片，在激光共聚焦顯微鏡下用激發波長587 nm，發射波長610 nm激發并觀察紅色熒光的位置。

1.2.9 米曲霉菌株生長狀況的分析 將1 μL米曲霉孢子液接種于PDA培養基上，30 ℃培養6 d后用孢子洗脫液洗脫并收集孢子。用血球計數板在顯微鏡下進行孢子計數，然后用孢子洗脫液稀釋孢子液至相同濃度。接種1 μL孢子液至PDA平板中央，30 ℃培養并每天測量菌落直徑。

1.3 數據處理

菌落直徑實驗做3個平行實驗，每個平行實驗重復3次，以平均值和標準差表示數據結果。運用Excel和SPSS Statistics 23.0軟件進行統計分析，采用獨立樣本T檢驗進行差異性比較，在95%顯著性水平下分析差異的顯著性，在Excel中進行柱狀圖分析。

圖 1 AopyrG基因敲除的驗證Fig.1 Verification of the AopyrG gene knockout

2 結果與分析

2.1 ΔAopyrG敲除菌株的構建

為了利用同源重組法獲得米曲霉的ΔAopyrG敲除菌株（圖1a），首先利用OE-PCR獲得只含有AopyrG上下游序列的AopyrGLR片段（圖1b），然后將其轉化為野生型菌株的原生質體。轉化混合物在含有5-FOA、尿苷和尿嘧啶的復蘇培養基上培養，對長出的菌落提取DNA進行PCR驗證。結果如圖1c所示，用AopyrG的ORF引物進行PCR驗證時發現，米曲霉野生型菌株可擴增出AopyrG的ORF片段，而轉化菌株不能擴增出相應片段。用AopyrG的上下游引物AopyrG-P1和AopyrG-P2進行PCR擴增時發現，米曲霉野生型菌株擴增得到的片段比轉化菌株擴增得到的片段長，以上結果說明米曲霉ΔAopyrG菌株構建成功。

2.2 ΔAoku70ΔAopyrG雙敲除菌株的構建與驗證

為了獲得ΔAoku70ΔAopyrG雙敲除菌株，先以Aoku70r-AfpyrG片段替換ΔAopyrG敲除菌中的Aoku70，然后利用5-FOA脅迫使得轉化子基因組發生自身環化丟失AfpyrG實現Aoku70和AopyrG的雙敲除（圖2a）。用三對引物Aoku70-O1和Aoku70-O2（擴增Aoku70的ORF區）、Aoku70-L1和AfpyrG-O4（擴增L-AfpyrG區）、Aoku70-R2和AfpyrG-O3（擴增AfpyrG-R區）對Aoku70r-AfpyrG替換ΔAopyrG敲除菌中的Aoku70進行PCR驗證。結果如圖2b所示，野生型菌株只能擴增出Aoku70的ORF片段，而轉化菌株只有Aoku70的ORF不能擴增出來。以上結果表明Aoku70r-AfpyrG成功替換了ΔAopyrG敲除菌的Aoku70基因。將上一步的轉化子用5-FOA脅迫使得轉化子基因組發生自身環化丟失AfpyrG，用AopyrG和Aoku70的ORF引物進行PCR驗證。結果如圖2c所示，野生型菌株可以同時擴增出AopyrG和Aoku70的ORF，而轉化菌株都不能擴增出相應片段。但是，用引物Aoku70-P1和Aoku70-P2擴增Aoku70上下游跨越區時發現，野生型菌株擴增得到的片段比轉化菌株擴增得到的片段長。綜合以上結果表明ΔAoku70ΔAopyrG雙敲菌株構建成功。

圖 2 AopyrGAoku70基因敲除的驗證Fig.2 Verification of the AopyrGAoku70 gene knockout

2.3 米曲霉核定位熒光菌株的構建

為了驗證ΔAoku70ΔAopyrG雙敲菌株的可用性，以該菌株為宿主利用同源重組技術將mCherry-AfpyrG片段插入到組蛋白H2B的ORF后面構建一個核定位熒光菌株（圖3a）。用引物mCherry-O1和mCherry-O2對轉化子的mCherry-ORF區進行PCR驗證，用AoH2B上下游、mCherry內部和AfpyrG內部的引物對轉化子進行AoH2B-mCherry區和mCherry-AfpyrG區的進一步驗證。結果如圖3b所示，三個片段大小均與預期相符，這說明AoH2B-mCherry熒光菌株構建成功。將驗證成功的菌株孢子，經過萌發后，在激光共聚焦顯微鏡下觀察其紅色熒光的位置。結果如圖3c所示，在細胞核中可以觀察到紅色熒光，進一步說明AoH2B-mCherry核定位熒光菌株構建成功。以上結果表明本研究構建的ΔAoku70ΔAopyrG雙敲菌株可以用于米曲霉基因的改造研究。

圖 3 米曲霉核定位熒光菌株的構建Fig.3 Subcellular localization of AoH2B-mCherry in A. oryzae

2.4 米曲霉核定位熒光菌株的生長分析

為了研究插入mCherry基因對米曲霉生長的影響，分別將含有106個AoH2B-mCherry菌株和對照菌株（ΔAopyrGΔAoku70::AfpyrG）的孢子液接種到PDA培養基上，測量兩種米曲霉在5 d內的生長直徑。結果如圖4所示，AoH2B-mCherry菌株的形態（圖4a）和生長直徑（圖4b）與對照菌株相比沒有明顯差異（P＞0.05），這表明mCherry基因的插入對米曲霉菌株的生長狀況沒有影響。后續研究可將融合了GFP熒光的目的基因轉化至該核定位菌株，通過觀察綠色和紅色熒光的相對位置來確定目的基因的亞細胞定位，從而用于米曲霉基因的功能研究。

圖 4 mCherry基因對AoH2B-mCherry菌株生長的影響Fig.4 The effect of mCherry gene on AoH2B-mCherry strain growth

3 討論與結論

米曲霉的基因組序列雖已被測定，但是米曲霉的細胞壁成分特殊使其不能像酵母和大腸桿菌一樣具有高的遺傳轉化效率[6,17]，因此米曲霉遺傳改良進展緩慢。建立高效的遺傳轉化體系首先需要考慮選擇合適的遺傳篩選標記。本研究通過敲除米曲霉中編碼乳清酸核苷-5'-磷酸脫羧酶的pyrG基因，構建了以pyrG基因為篩選標記的遺傳轉化體系。與以往的主要以ble[18]、ptrA[19]、sdh[20-21]和hyg[22-23]等抗性基因作為篩選標記的遺傳轉化體系相比，以pyrG基因作為篩選標記不需要對抗性藥物種類和濃度進行摸索，縮短了轉化周期[24-26]。此外，pyrG基因的導入也不會使人們對食品安全產生疑慮，因此，基于pyrG基因進行遺傳改良的米曲霉在生產應用中不會受到限制。

多數絲狀真菌能利用非同源末端連接（Nonhomologous End Joining，NHEJ）途徑修復DNA雙鏈斷裂（DNA Double Strand breaks，DSBs），使基因重組受阻[27-28]。NHEJ過程是由Ku70-Ku80異源二聚體、DNA依賴的蛋白激酶催化亞基和DNA連接酶IV-Xrcc4復合物所介導[29-30]。現有研究表明，在絲狀真菌中敲除ku70基因可顯著提高同源重組效率。Ninomiya等[29]在粗糙脈孢菌（Neurospora crassa）中敲除了ku70基因后發現，同源重組效率由野生型中的30%提高到了100%。Koh等[31]發現ku70缺失的圓紅冬孢酵母（Rhodosporidium toruloides）突變體中，轉化效率可達95.8%。Tu等[32]發現在ku70突變的亮蓋靈芝（Ganoderma lucidum）中，CRISPR/Cas9基因編輯引起的靶基因插入效率能提高到96.3%，替換效率能提高到93.1%。本研究在ΔAopyrG單缺失的基礎上，進一步敲除了Aoku70基因，獲得了具有高效同源重組的營養缺陷型菌株ΔAoku70ΔAopyrG。

本研究以野生型的米曲霉RIB40為出發菌株，通過PEG-CaCl2介導的同源重組技術敲除了AopyrG和Aoku70兩個基因，最終獲得了尿苷/尿嘧啶合成和非同源末端連接途徑同時缺陷的ΔAoku70ΔAopyrG突變體，并利用mCherry熒光定位驗證了此遺傳轉化體系的可用性，為今后米曲霉RIB40的遺傳改造和功能基因研究奠定了基礎。