枳椇高粱共釀蒸餾酒釀造工藝優化及其特征風味物質和體外抗氧化活性

趙敏惠，易 媛，張 強，陳 靜，左 勇,3,

（1.四川輕化工大學生物工程學院，四川宜賓 644000；2.固態發酵資源利用四川省重點實驗室，四川宜賓 644000；3.四川師范大學生命科學學院，四川成都 610000）

枳椇（Hovenia acerba）又名拐棗、萬壽果、雞爪果，富含維生素、氨基酸、蛋白質、黃酮、生物堿、三萜皂苷等生物活性成分[1]，具有解酒保肝、降血糖、抗氧化等功效[2-4]，是藥食兩用中藥品種。枳椇果香濃郁，碳水化合物含量極高，總糖和還原糖含量分別可達249.24和167.57 mg/g[5]，總多酚含量更是高達376.27 mg GAE/100 g FW[6]，是制備發酵酒的優良原料。

目前，枳椇主要用于制備發酵型果酒和泡制露酒，其在蒸餾酒中的應用研究較少。國內蒸餾酒一般以高粱為原料，經蒸煮、發酵、蒸餾等工序釀造而成，而純高粱所制蒸餾酒體外抗氧化能力相比葡萄酒、黃酒等較弱[7]，且遠遠小于已知的人工合成抗氧化劑。大量研究表明，枳椇富含酚類物質，加工成發酵酒或露酒后仍能保持較強的抗氧化性能[8]，且枳椇富含多糖、生物堿等活性成分，但在釀酒原料中加入枳椇是否能提高蒸餾酒的抗氧化能力及改善其風味感官品質還有待進一步研究。

因此，本實驗擬采用枳椇和高粱為釀酒原料，以中溫大曲為發酵劑，在單因素實驗的基礎上利用正交試驗對枳椇高粱共釀蒸餾酒發酵工藝進行優化，并對酒中特征風味物質和體外抗氧化活性與純高粱蒸餾酒進行對比分析，以期為枳椇酒工業化生產提供科學參考，為新型保健蒸餾酒的開發提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

枳椇 10月份采于四川省萬源市秦巴山區，篩選成熟、無霉爛枳椇；糯高粱 購于山西晉城；中溫大曲 取于山西杏花村晉源晉大曲酒曲廠；DPPH、ABTS標準品（≥98%） 美國Sigma公司；福林酚（BR）、沒食子酸標準品（＞99%） 麥克林生化科技有限公司；其他試劑均為分析純。

DB-WAX-UI石英毛 細柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）及TSQ8000型氣相色譜-質譜聯用儀 美國Thermo Fisher公司；T6新世紀紫外可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司；AR 1140電子天平 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 枳椇高粱共釀蒸餾酒發酵工藝流程

操作要點：將清洗后的枳椇用剪刀剪為1 cm左右小段，上鍋蒸煮40 min，晾涼至室溫；將高粱破碎4～6瓣后過20目篩，用70 ℃熱水浸潤1 h后投入蒸鍋內蒸煮1 h，蒸好后向高粱中潑入原料質量40%的無菌水，翻拌后晾凉至室溫；將枳椇和高粱按不同比例與大曲混勻后投入發酵桶中，28 ℃密閉發酵。將發酵結束的酒醅上甑蒸餾，收集餾出液進行測定。

參照上述發酵工藝，不加入枳椇，制備純高粱蒸餾酒。

1.2.2 單因素實驗 通過控制變量法進行單因素實驗，以添加30%枳椇、15%大曲、發酵28 d為基礎發酵條件，固定其他條件不變，分別探究枳椇添加量（0%、10%、20%、30%、40%）、大曲添加量（5%、10%、15%、20%、25%）、發酵時間（7、14、21、28、35 d）各因素對枳椇高粱共釀蒸餾酒感官評價、出酒率、總酸和總酯的影響。

1.2.3 正交試驗 在單因素實驗的基礎上進行正交試驗，以感官評價、出酒率為指標，確定枳椇高粱共釀蒸餾酒最佳工藝參數。利用正交試驗表L9（34）進行試驗，正交試驗因素水平如表1所示。

表 1 正交試驗因素水平表Table 1 Orthogonal experimental factors and level design

1.2.4 感官評價 參考魏勁松等[9]的方法，對不同發酵工藝的枳椇高粱共酵蒸餾酒樣品進行感官評價。感官評價小組由10名（5名男性，5名女性）經過感官評定分析專業培訓且具有相關經驗的人組成。評分結果參照馬寧原等[10]的方法，采用模糊數學感官評價法進行分析，如表2所示。

表 2 綜合感官評價標準Table 2 Criteria for comprehensive sensory evaluation

1.2.5 風味物質分析 檢測參照郭世鑫等[11]的方法，并略有改進。HS-SPME萃取：取5 mL酒樣于頂空進樣瓶中，加入2 g NaCl和20 μL 0.4 g/L 2-辛醇，置于50 ℃恒溫水浴鍋中加熱平衡5 min。將已活化平衡好的萃取頭（250 ℃老化15 min）插入樣品瓶中吸附45 min，將萃取頭迅速插入GC-MS進樣口，熱解析，進行采集數據狀態。

GC條件：色譜柱為DB-Wax（60 m×250 μm×0.25 μm）毛細管柱，升溫程序：初始溫度為50 ℃，保持2 min，然后以2 ℃/min的速率升到60 ℃，保持1 min，再以3 ℃/min的速率升到105 ℃，保持3 min，再以4 ℃/min的速率升到180 ℃，保持3 min，最后以6 ℃/min的速率升到230 ℃，保持1 min；進樣口溫度230 ℃；載氣高純He（99.999%），流速1.00 mL/min，不分流。

MS條件：電離方式EI；電子能量70 eV；離子源溫度230 ℃；接口溫度230 ℃。

定性：通過與標準譜庫（NIST05）的譜圖進行比較鑒定，保留匹配度大于80的結果。

定量：以2-辛醇為內標，對枳椇酒香氣成分含量進行計算，公式如（1）所示。

式中：C為所測揮發性物質濃度（g/L）；Ax為所測揮發性物質峰面積；C0為內標物濃度，0.4 g/L；V0為內標物進樣量，20 μL；A0為內標物峰面積；V為酒樣萃取體積，5 mL。

1.2.6 關鍵風味化合物確定 參照張秀玲等[12]的方法，采用香氣活性閾值（odor activity value，OAV）來確定酒中關鍵風味化合物，公式如（2）所示。通常，OAV值＞1表示該物質對香氣貢獻度較大，為關鍵風味化合物。

1.2.7 描述性剖面分析 參照GB/T 33404-2016《白酒感官品評導則》對枳椇高粱共酵蒸餾酒進行感官定量描述分析。取10 mL樣品裝入15 mL編碼的玻璃瓶中，在室溫下平衡20 min，然后隨機提供給評定人員評定。根據評定結果，花香、果香、酸香、酒香、糧香、異味被選在香氣剖面中，然后評定人員被要求根據相應標準溶液來確定香氣屬性的強度（花香對應乙酸苯乙酯、果香對應十二酸乙酯、酸香對應乙酸、酒香對應異戊醇、糧香對應糠醛），以5點為尺度，從0（極弱）到5（極強）。每位評定人員的感官評定結果超出相對標準差（RSD）20%被排除在外。

1.2.8 指標測定方法

1.2.8.1 總酸、總酯含量測定 按照GB/T 10345-2007《白酒分析方法》。

1.2.8.2 出酒率測定 參照游湘淘等[13]的方法，公式如（3）所示。

式中：s為酒精度數，%Vol；V為酒精體積，mL；50以酒精度50%Vol計；M為原糧質量，g。

1.2.8.3 總酚含量測定 參照蔡萌等[14]的方法，采用Folin-Ciocalteau法進行測定。取1 mL待測液，加入1 mL Folin-Ciocalteau試劑和3 mL 10% Na2CO3，混勻后定容至10 mL，避光反應2 h后于765 nm處測定吸光度。以0～20 mg/L沒食子酸標準溶液建立標準曲線，得到回歸方程為y=0.1308x+0.0193，R2=0.9978。根據線性回歸方程計算總酚含量。

1.2.8.4 DPPH自由基清除能力測定 參照郭睿等[15]的方法，公式如（4）所示。取0.2 mL待測液，加入7.8 mL DPPH無水乙醇溶液，混勻后避光反應30 min，于517 nm處測定吸光度值，記為A1；以無水乙醇溶液代替DPPH乙醇溶液，測定吸光度值，記為A2；以蒸餾水代替待測液，記錄吸光度值為A0。

1.2.8.5 ABTS自由基清除能力的測定 參照Vi?nja等[16]方法，公式如（5）所示。取0.2 mL待測液，與7.8 mL ABTS+·工作液混勻后避光反應5 min，于734 nm處測定吸光度值，記為A1；以無水乙醇溶液代替ABTS+·工作液，測定吸光度值，記為A2；以蒸餾水代替待測液，記為A0。

1.2.8.6 總還原能力的測定 參照石亞林等[7]的方法。取1 mL待測液，加入2.5 mL磷酸緩沖液（0.2 mol/L，pH6.6）和2.5 mL 1%亞鐵氰化鉀溶液，混勻后置于50 ℃水浴鍋中水浴20 min。冷卻后加入1 mL 10%三氯乙酸，3000 r/min離心10 min。取2.5 mL上清液，加入2.5 mL蒸餾水和0.1% FeCl3混勻后靜置5 min，于700 nm處測定吸光度值。

1.3 數據處理

實驗數據均為3次重復實驗結果的平均值，結果表示為平均值±標準偏差。采用SPSS 20.0軟件對數據進行顯著性分析，P＜0.05為差異顯著，采用Origin 2018軟件進行數據圖形化處理。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗

2.1.1 枳椇添加量對枳椇高粱共釀蒸餾酒感官評價、出酒率、總酸和總酯的影響 由圖1-a可知，蒸餾酒中總酸含量隨著枳椇的增加而增加，當枳椇添加量為30%時趨于平穩，此時總酸含量為0.48 g/L。枳椇添加量對總酯的影響差異不顯著（P＞0.05），總酯含量為1.75 g/L左右，高于中國傳統特級清香型白酒中總酯含量（1.10 g/L）。導致這一現象的原因可能是枳椇中有機酸含量豐富，其有機酸與發酵過程中生成的醇類物質發生酯化反應導致總酯含量較高[17]。由圖1-b所示，隨著枳椇添加量的增加，酒體中枳椇蒸煮后特有的香味越發濃郁，感官評分隨著枳椇添加量呈現先增加后降低的趨勢，于添加量為30%時達到最高，為95.11分。出酒率隨枳椇添加量的增加而降低，當枳椇添加量為30%時，出酒率僅為37.24%；當枳椇添加量為20%時，出酒率可達39.5%，差異顯著（P＜0.05）。其原因可能與可發酵性糖供給不足有關[18]，枳椇的發酵性能低于高粱，其總糖含量雖高但大多可能為不可發酵性糖。因此，綜合經濟考慮，選擇枳椇最佳添加量為20%。

圖 1 枳椇添加量對枳椇高粱共釀蒸餾酒的影響Fig.1 Effect of Hovenia acerba addition on the quality of Hovenia acerba-sorghum co-fermented distilled liquor

2.1.2 大曲添加量對枳椇高粱共釀蒸餾酒感官評價、出酒率、總酸和總酯的影響 由圖2-a可知，大曲添加量對酒樣中總酯含量影響較大。蒸餾酒中總酯含量隨大曲添加量增加而增加，于大曲添加量為15%時趨于平穩，此時總酯含量為2.62 g/L。大曲添加量對蒸餾酒總酸的影響差異不顯著（P＞0.05）。由圖2-b可知，出酒率和感官評分均呈先增后減的趨勢，大曲添加量為15%時，出酒率為39.08%，感官評分為94.27分。當大曲添加量大于15%時，出酒率逐漸下降。因此，大曲最佳添加量為15%。

圖 2 大曲添加量對枳椇高粱共釀蒸餾酒的影響Fig.2 Effect of Daqu addition on the quality of Hovenia acerba-sorghum co-fermented distilled liquor

2.1.3 發酵時間對枳椇高粱共釀蒸餾酒感官評價、出酒率、總酸和總酯的影響 由圖3-a可知，總酸和總酯含量隨發酵時間增加而增加，第7～21 d增速較為平緩，可能是由于酵母菌旺盛發酵從而抑制了產酸菌活性。第21～28 d總酸和總酯含量急劇升高，并于28 d時趨于平穩，此時總酸含量為0.34 g/L，達到一級清香型高度白酒的質量要求0.30 g/L；總酯含量為2.61 g/L，高于優級濃香型高度白酒的質量要求2.00 g/L。由圖3-b可知，出酒率和感官評分隨發酵時間增加而增加，于28 d時達到最優，此時出酒率為39.1%，感官評分為94.37分。隨著發酵時間的延長，感官評分略有下降，可能是由于發酵時間過長酒醅中產生了雜味物質，導致感官品質下降。因此，選擇發酵時間28 d為宜。

圖 3 發酵時間對枳椇高粱共釀蒸餾酒的影響Fig.3 Effect of fermentation time on the quality of Hovenia acerba-sorghum co-fermented distilled liquor

2.2 正交優化試驗

根據單因素實驗結果，對枳椇添加量（A）、大曲添加量（B）、發酵時間（C）三個因素進行正交試驗，其結果如表3所示。

由表3可知，對枳椇高粱共釀蒸餾酒感官評分影響因素的主次順序為大曲添加量＞枳椇添加量＞發酵時間，最優釀造工藝為A2B3C2。對出酒率影響因素的主次順序為枳椇添加量＞大曲添加量＞發酵時間，最優釀造工藝為A1B3C3。以直觀分析感官評分最高的5號（A2B2C3）做參照，以感官評分和出酒率為評價指標得出的最佳發酵工藝組合進行驗證，結果如表4所示。A2B2C3工藝的感官評分（93.91分）和出酒率（40.21%）最高，因此確定枳椇高粱共釀蒸餾酒最佳發酵工藝為枳椇添加量20%、大曲添加量15%、發酵時間35 d。

表 4 最優釀造工藝驗證結果Table 4 Verification test results of optimal brewing process

2.3 枳椇高粱共釀蒸餾酒揮發性成分及OAV分析

2.3.1 HS-SPME-GC-MS分析酒體中揮發性成分采用頂空固相微萃取-氣相色譜-質譜聯用技術對最佳工藝所得枳椇高粱共釀蒸餾酒和純高粱蒸餾酒中揮發性成分進行檢測分析，其鑒定結果如表5所示。枳椇高粱共釀蒸餾酒中鑒定出48種揮發性成分，其中醇類7種、酯類22種、酸類5種、醛酮類8種、烷烯烴類6種。根據香氣活性閾值判定48種揮發性風味物質中有21種物質對酒體風味貢獻度較大，包括1種醇類物質、13種酯類物質、2種酸類物質、3種醛類物質和2種酚類物質。純高粱蒸餾酒中鑒定出32種揮發性成分，其中醇類6種、酯類13種、酸類2種、醛酮類6種、烷烯烴類5種，其中有20種物質對酒體風味貢獻度較大，包括3種醇類物質、7種酯類物質、2種醛類物質和3種酚類物質。

2.3.1.1 醇類物質 醇類物質在酒體中占比最大，但除乙醇外OAV值并不高，主要起呈味助香作用[24]。正丙醇、異丁醇、正丁醇和異戊醇為兩種蒸餾酒中共有的揮發性成分，2,3-丁二醇、苯乙醇為枳椇高粱共釀蒸餾酒中特有的揮發性成分。

2.3.1.2 酯類物質 由于白酒中乙醇含量較高，乙醇經過固態發酵形成了較多乙酯類揮發性成分。其中，乙酸乙酯、丁酸乙酯、乙酸異戊酯、乳酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯、苯甲酸乙酯、丁二酸二乙酯、乙酸苯乙酯、月桂酸乙酯、棕櫚酸乙酯為中國傳統蒸餾酒典型揮發性物質[25]，因此枳椇高粱共釀蒸餾酒與純高粱蒸餾酒具有一定的相似性。在枳椇高粱共釀蒸餾酒中肉豆蔻酸乙酯和棕櫚酸乙酯質量濃度較高，分別為0.0072和0.0613 g/L。有研究表明，枳椇原料中含有多種不飽和高級脂肪酸[26]，它們在酵母和酶的作用下能與乙醇發生酯化反應形成脂肪酸乙酯[27]，使酒體更具醇厚感。9-癸烯酸乙酯、10-溴代癸酸乙酯均未在純高粱白酒中檢出，可能與枳椇原料的引入有關。酯類物質是枳椇高粱共釀蒸餾酒中最豐富的類別之一，丁酸乙酯和辛酸乙酯OAV值更是高達6750.26和2062.10，是枳椇高粱共釀蒸餾酒中最主要的特征風味，賦予酒體濃厚的花香與果香。

表 5 揮發性成分檢出結果Table 5 Identification of volatile compounds

2.3.1.3 酸類物質 純高粱蒸餾酒中僅檢出乙酸，含量為0.0042 g/L。枳椇高粱共釀蒸餾酒中的酸類物質從高到低依次為L-丙氨酸（0.0139 g/L）、乙酸（0.0055 g/L）、正辛酸（0.0049 g/L）、正丁酸（0.0021 g/L）和異丁酸（0.0009 g/L），其中僅正辛酸和正丁酸OAV值＞1。適量正辛酸和正丁酸能賦予枳椇高粱共釀蒸餾酒花果香和“窖香”，過濃則會增加油脂臭和汗臭[28]。L-丙氨酸是一種兼具咸味和甜味的鮮味氨基酸，在兩種蒸餾酒中均有檢出，可能是由大曲中鏈霉素或假單胞菌通過發酵產生的[29]。

續表 5

2.3.1.4 醛類物質 作為白酒中四大呈香物質之一，適量的醛類對白酒的香氣起著平衡和協調作用。由表5可知，異戊醛、乙偶姻、苯乙醛、愈創木酚、4-乙基愈創木酚OAV值＞1，對枳椇高粱共釀蒸餾酒風味具有一定貢獻。其中，異戊醛、愈創木酚、4-乙基愈創木酚OAV值＞40，對枳椇高粱共酵蒸餾酒的風味有顯著貢獻，為關鍵風味化合物。異戊醛具有麥芽香氣。4-乙基愈創木酚、愈創木酚可以由阿魏酸、香草醛、香草酸經大曲中的酵母或細菌發酵產生，除了具有水果香、花草香、焦醬香和甜香外還具有一定抗氧化活性[30]，賦予白酒一定保健功能。

2.3.1.5 其他 此外，本實驗還檢測出一些烷、烯烴類揮發性化合物，推測其可能與枳椇經微生物發酵的代謝產物有關。枳椇含糖量高，其碳含量也相對較高，烷、烯烴類物質可能由碳原子經發酵后形成。由于在白酒中烷、烯烴類物質含量不多，因此其對白酒風味的影響還有待進一步研究。

2.3.2 整體風味輪廓 整體風味輪廓是用于將具有相似氣味特征的化合物劃分為感官氣味類別，以形成擁有幾個芳香系列的芳香圖譜。由圖4可以看出，與純高粱蒸餾酒相比，枳椇高粱共釀蒸餾酒酒體豐滿，不僅具有純高粱酒的典型香氣，還具有果酒特有的果香和花香。在枳椇高粱共釀蒸餾酒中，果香的主要貢獻化合物為丁酸乙酯、正己酸乙酯、辛酸乙酯、愈創木酚、乙酸異戊酯、異丁酸乙酯、月桂酸乙酯、癸酸乙酯。楊旖旎[31]研究表明，異丁酸乙酯是枳椇中具有主要貢獻的風味化合物，賦予了酒體枳椇特有風味，使枳椇高粱共釀蒸餾酒更具有典型性。根據OAV值分析，酒體中少量的異味可能來自于乙酸苯乙酯、正辛酸和4-乙基愈創木酚。

圖 4 感官定量分析雷達圖Fig.4 Quantitative analysis of sensory flavor properties

2.4 體外抗氧化活性實驗

對工藝優化后的兩種蒸餾酒進行總酚含量、自由基清除率和總還原力的檢測，結果見表6。

表 6 體外抗氧化活性檢測結果Table 6 Results of antioxidant activity detection in vitro

自由基損傷是導致肝病、動脈粥樣硬化及癌癥的主要因素，若白酒中含有有效清除自由基的活性物質，便能有效抑制乙醇代謝過程中羥自由基的生成，保護機體免受自由基損傷[32]。實驗結果表明，純高粱蒸餾酒體外抗氧化能力較弱，這與石亞林、張明珠等[7,33]的研究結果一致。由表6可知，枳椇蒸餾酒總酚含量為21.001 μg/mL，為純高粱蒸餾酒總酚含量的32倍。導致這一現象的原因可能是由于枳椇果梗中阿魏酸含量和單寧含量很高，分別達到9.66和62.70 mg/100 g FW[6]，這些物質經過微生物的發酵過程形成酚類物質[34]，使得酒體中總酚含量大大提升。枳椇高粱共釀蒸餾酒DPPH自由基清除率、ABTS自由基清除率和總還原力分別為54.929%、21.86%和0.1827，以上均約為純高粱蒸餾酒的2倍。HSSPME-GC-MS檢測結果顯示，枳椇高粱共釀蒸餾酒中4-乙基愈創木酚、對乙烯基愈創木酚、愈創木酚濃度均高于純高粱蒸餾酒，這些物質作為自由基清除劑賦予了枳椇高粱共釀蒸餾酒良好的保健功能。

3 結論

本研究以枳椇和高粱為原料，通過單因素和正交試驗優化得到枳椇高粱共釀蒸餾酒最佳發酵工藝為枳椇添加量20%、大曲添加量15%、發酵時間35 d，此時感官評分為93.91分，出酒率為40.21%，果香濃郁，酒味協調，酒體澄清無渾濁。通過HSSPME-GC-MS和描述性剖面分析對枳椇高粱共釀蒸餾酒和純高粱蒸餾酒揮發性成分進行對比，結果表明，枳椇高粱共釀蒸餾酒檢測到48種揮發性成分，而純高粱蒸餾酒僅檢測到32種揮發性成分，2,3-丁二醇、苯乙醇、異丁酸乙酯、乙酸庚酯、正己酸乙酯、異丁酸異戊酯、9-癸烯酸乙酯、苯乙酸乙酯、10-溴代癸酸乙酯、肉豆蔻酸乙酯、十五酸乙酯、9-十六碳烯酸乙酯、正丁酸、異丁酸、正辛酸、異戊醛、乙偶姻、苯乙醛、對乙烯基愈創木酚、環辛四烯、十五烯為枳椇高粱共釀蒸餾酒中特有成分。經OAV分析，在枳椇高粱共釀蒸餾酒中丁酸乙酯、辛酸乙酯、愈創木酚、正己酸乙酯、乙醇、異戊醛、4-乙基愈創木酚、肉豆蔻酸乙酯、乙酸異戊酯、異丁酸乙酯、月桂酸乙酯、癸酸乙酯的OAV值＞20，對枳椇高粱共釀蒸餾酒的風味有顯著貢獻，為關鍵風味化合物，賦予酒體濃郁的花果香。枳椇高粱共釀蒸餾酒酒體豐滿，不僅具有純高粱酒的典型香氣，還具有果酒特有的果香和花香。對枳椇高粱共釀蒸餾酒和純高粱蒸餾酒體外抗氧化能力進行探究，結果表明，枳椇高粱共釀蒸餾酒總酚含量為純高粱酒的32倍，DPPH自由基清除率、ABTS自由基清除率和總還原力均約為純高粱蒸餾酒的2倍。總體而言，在釀酒原料中加入枳椇能賦予酒體濃郁的果味，提高其體外抗氧化活性。