白鰱魚(yú)鱗抗凍多肽的制備及對(duì)凍融魚(yú)糜凝膠特性的改善作用

李曉貞，陳 旭，楊傅佳，黃 丹，黃建聯(lián)，劉永樂(lè)，汪少蕓,2,

（1.福州大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，福建福州 350108；2.福州海洋研究院食品研發(fā)中心，福建福州 350108；3.福建省冷凍調(diào)理水產(chǎn)品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建廈門(mén) 361022；4.安井食品集團(tuán)股份有限公司，福建廈門(mén) 361022；5.長(zhǎng)沙理工大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，湖南長(zhǎng)沙 410114）

冷凍貯藏技術(shù)被廣泛用于魚(yú)糜制品的長(zhǎng)期儲(chǔ)存[1-2]，但在實(shí)際生產(chǎn)中，冷凍設(shè)備不穩(wěn)定、運(yùn)輸步驟多等因素可能導(dǎo)致魚(yú)糜在運(yùn)輸和儲(chǔ)存過(guò)程中出現(xiàn)反復(fù)凍融現(xiàn)象[3]，該現(xiàn)象會(huì)加速魚(yú)糜品質(zhì)劣變，嚴(yán)重破壞魚(yú)糜制品風(fēng)味、質(zhì)地和功能特性[1]。添加低溫保護(hù)劑可最大限度降低魚(yú)糜凍藏品質(zhì)的劣變，食品行業(yè)中的低溫保護(hù)劑主要包括蔗糖、山梨醇、磷酸鹽等[4]，其中，4%蔗糖和4%山梨醇的組合被稱為商業(yè)抗凍劑（SUSO），因其價(jià)格低廉、抗凍效果好，成為冷凍魚(yú)糜中最常用的抗凍劑[5]，但過(guò)量攝入添加了商業(yè)抗凍劑的冷凍魚(yú)糜會(huì)使消費(fèi)者間接攝入過(guò)量糖分，給消費(fèi)者的健康帶來(lái)隱患[4,6]，因此，需尋找可替代商業(yè)抗凍劑的低溫保護(hù)劑。

研究表明，魚(yú)糜凍藏品質(zhì)劣變的根本原因是凍藏過(guò)程中冰晶導(dǎo)致魚(yú)糜蛋白質(zhì)的冷凍變性[1,7]，因此，抑制魚(yú)糜冷凍過(guò)程中的冰晶生長(zhǎng)和重結(jié)晶，是提升魚(yú)糜及魚(yú)糜制品加工與貯藏品質(zhì)的關(guān)鍵。抗凍多肽在抑制冰晶生長(zhǎng)和重結(jié)晶方面具有良好效果[8-10]，且安全、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，有望成為魚(yú)糜及魚(yú)糜制品冷凍加工與貯藏更為理想的新型冷凍保護(hù)劑。抗凍多肽多以食用膠原蛋白、明膠[11]或動(dòng)物皮[10,12-14]、魚(yú)鱗[15]、動(dòng)物肌腱等加工副產(chǎn)物通過(guò)生物酶解技術(shù)獲取具有特異性的高活性多肽片段。白鰱魚(yú)作為四大家魚(yú)之一，也是養(yǎng)殖產(chǎn)量最高的淡水魚(yú)之一，2020年全國(guó)白鰱魚(yú)養(yǎng)殖產(chǎn)量為381.03萬(wàn)噸，占全國(guó)淡水養(yǎng)殖產(chǎn)量12.6%[16]。在其精加工過(guò)程中，會(huì)產(chǎn)生大量的魚(yú)鱗廢棄物，約占魚(yú)體總重2%～5%[17]，造成嚴(yán)重的資源浪費(fèi)與環(huán)境污染，而白鰱魚(yú)鱗自身富含50%～80%優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)[18]，正是制備抗凍多肽良好的來(lái)源。因此，本研究利用生物酶解技術(shù)制備白鰱魚(yú)鱗抗凍多肽（ScAFPs），通過(guò)單因素、響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)研究其最佳制備工藝，表征ScAFPs基本性質(zhì)并將其應(yīng)用于凍融魚(yú)糜的低溫保護(hù)中，探究ScAFPs對(duì)凍融魚(yú)糜凝膠特性的影響，為ScAFPs作為低溫保護(hù)劑應(yīng)用于魚(yú)糜及魚(yú)糜制品冷凍貯藏奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

白鰱魚(yú)鱗 安井食品集團(tuán)股份有限公司提供；體重約1.5 kg左右新鮮草魚(yú) 購(gòu)自福建永輝超市；嗜熱鏈球菌 上海交通大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院提供；復(fù)合風(fēng)味蛋白酶（20 U/mg） 廣州市華琪生物技術(shù)有限公司；木瓜蛋白酶（2000 U/mg） 北京博奧拓達(dá)科技有限公司；胰蛋白酶（250 U/mg） 上海源葉生物科技有限公司；中性蛋白酶（100 U/mg） 諾維信（中國(guó)）生物技術(shù)有限公司；堿性蛋白酶（200 U/mg） 大連美侖生物技術(shù)有限公司；其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

LDZF-50L立式壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫(yī)療器械廠；YC-S30水浴恒溫震蕩搖床、SY-550B全溫型恒溫培養(yǎng)搖床 天津市泰斯特儀器有限公司；752紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海安亭科學(xué)儀器廠；Waters 1525高效液相色譜儀 美國(guó)Waters公司；ZEN3600納米粒度電位儀 英國(guó)Malvern公司；Fluoro Max-4熒光分光光度計(jì) 美國(guó)HORIBA公司；DSC214差示掃描量熱儀 德國(guó)耐馳儀器制造公司；ADCI-60-C色差儀 北京辰泰克儀器技術(shù)有限公司；TA.XT PLUS型質(zhì)構(gòu)儀 英國(guó)SMS公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 白鰱魚(yú)鱗預(yù)處理及基本成分測(cè)定 新鮮的白鰱魚(yú)鱗經(jīng)清水洗凈，瀝干水分后置于50 °C電熱鼓風(fēng)干燥箱中烘6～8 h，然后用粉碎機(jī)將魚(yú)鱗粉碎過(guò)80目篩后備用。白鰱魚(yú)鱗水分、粗灰分、粗蛋白、粗脂肪含量分別參照GB 5009.3-2016、GB 5009.4-2016、GB 5009.5-2016、GB 5009.6-2016進(jìn)行測(cè)定。

1.2.2 ScAFPs的制備工藝優(yōu)化

1.2.2.1 白鰱魚(yú)鱗酶解液制備 粉碎后的白鰱魚(yú)鱗中加入適量蒸餾水，將其超聲（50 °C，200 W）處理90 min后再進(jìn)行60 min高溫高壓處理（121 °C，0.1 MPa），待混合液冷卻至室溫后調(diào)節(jié)其pH至相應(yīng)蛋白酶最適pH，添加適量蛋白酶混合均勻，迅速放置于水浴恒溫震蕩搖床中酶解一定時(shí)長(zhǎng)后進(jìn)行沸水浴滅酶10 min，最后待酶解液冷卻至室溫后離心（4 °C，10000 r/min）10 min，取上清液，上清液即為白鰱魚(yú)鱗酶解液。

1.2.2.2 單因素實(shí)驗(yàn) 以嗜熱鏈球菌低溫存活率為主指標(biāo)，水解度（DH）為輔助指標(biāo)，對(duì)ScAFPs酶解工藝進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，依次按照蛋白酶、底物濃度、酶底比、酶解時(shí)間的篩選順序進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，每次實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格控制單一變量。篩選蛋白酶時(shí)，設(shè)置酶解初始條件為：底物濃度3%（w/v），酶底比5%（w/w），酶解時(shí)間6 h，隨后根據(jù)每次篩選結(jié)果對(duì)初始條件中的相應(yīng)因素條件替換后，再進(jìn)行下一因素的篩選。各因素變量分別為：蛋白酶種類選取復(fù)合風(fēng)味蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶和堿性蛋白酶，這5種蛋白酶最適pH與溫度分別為：7.0，50 °C；8.0，37 °C；8.0，37 °C；7.0，50 °C；8.0，50 °C；底物濃度選取1%、2%、3%、4%、5%（w/v）；酶底比選取1%、3%、5%、7%、9%（w/w）；酶解時(shí)間選取1、2、3、4、5、6、7 h。

1.2.2.3 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn) 在單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，對(duì)ScAFPs酶解制備工藝進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)。選擇A：底物濃度（%）、B：酶底比（%）、C：酶解時(shí)間（h）三個(gè)因素，以嗜熱鏈球菌存活率為響應(yīng)值，利用Design-Expert 8.0.6軟件的Box-Behnken design模型設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)方案，其因素水平表如表1所示。

表 1 因素水平編碼表Table 1 Factor level coding table

1.2.2.4 嗜熱鏈球菌存活率測(cè)定 取200 μL二次活化的嗜熱鏈球菌菌液至20 mL M17液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)4 h后取4 mL菌液離心（4 °C，5000 r/min）10 min，去除上清液，再加入4 mL生理鹽水洗滌離心（4 °C，5000 r/min）10 min后保留菌泥，該步驟重復(fù)兩次，最后將菌泥重懸于8 mL生理鹽水中。取60 μL重懸的菌液分別與540 μL的生理鹽水（空白對(duì)照組）和魚(yú)鱗酶解液混合均勻，魚(yú)鱗酶解液預(yù)先使用0.22 μm濾菌膜過(guò)濾，然后吸取50 μL于4 mL M17液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)7 h，利用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)600 nm處的吸光值A(chǔ)0。將剩余混合菌液放入-20 °C冰箱冷凍24 h，在冷凍的前4 h內(nèi)，每隔2 h進(jìn)行一次凍融循環(huán)（37 °C水浴，10 min）。冷凍24 h后將菌液水浴解凍（37 °C ，10 min），再次取50 μL接種培養(yǎng)7 h后測(cè)吸光值A(chǔ)1。嗜熱鏈球菌的低溫存活率計(jì)算公式為：

式中：A0：冷凍前菌液600 nm處的OD值；A1：冷凍后菌液600 nm處的OD值。

1.2.2.5 水解度（DH）的測(cè)定 采用甲醛滴定法，首先在100 mL燒杯中加入2.5 mL酶解液和30 mL蒸餾水混合均勻，將混合液與甲醛溶液的pH均調(diào)至8.2，往混合液中加入10 mL甲醛溶液，然后用0.02 mol/L氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液將所混合的溶液滴定至9.2，記錄下所消耗氫氧化鈉的體積△V，參照LIN等[19]的方法計(jì)算DH。

1.2.3 白鰱魚(yú)鱗抗凍多肽基本性質(zhì)表征 根據(jù)響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化的ScAFPs最佳制備工藝條件，制備得到液態(tài)ScAFPs，將其凍干后置于-20 °C冰箱中備用。

1.2.3.1 肽基本成分的測(cè)定 ScAFPs中的多肽含量參照劉聃等[20]的方法稍作修改后測(cè)定，首先向酶解制備所得的ScAFPs溶液中按照1:1的比例添加10%三氯乙酸溶液（去離子水配制），混合均勻后靜置10 min，離心（4 °C，10000 r/min）10 min后，取上清液凍干成粉末，參照GB 5009.5-2016中的凱氏定氮法測(cè)定多肽含量。ScAFPs中水分與粗灰分含量測(cè)定分別參照GB 5009.3-2016 中直接干燥法和GB 5009.4-2016中食品總灰分的測(cè)定。

1.2.3.2 分子量分布 將ScAFPs配制成20 mg/mL的水溶液，選用TSK-Gel-G2000SWXL凝膠色譜柱，進(jìn)樣量為10 μL，流速為0.5 mL/min，利用WatersTM650E高級(jí)蛋白質(zhì)純化系統(tǒng)的高效液相色譜儀進(jìn)行分子量分布測(cè)定[19]。

1.2.3.3 表面疏水性測(cè)定 通過(guò)8-苯胺基-1-萘磺酸銨（ANS）熒光探針測(cè)定ScAFPs的表面疏水性，具體測(cè)定方法參照曾茂茂等[21]的方法稍作修改。利用PBS（0.1 mol/L、pH7.0），分別配制8 mmol/L ANS溶液、100 μg/mL BSA溶液和100 μg/mL ScAFPs溶液。以牛血清蛋白（BSA）為對(duì)照，利用PBS分別將BSA與ScAFPs溶液稀釋成梯度濃度為100、50、25、12.5、6.25 μg/mL的樣品溶液。各取梯度稀釋后的樣品溶液4 mL，加入20 μL ANS溶液混合均勻后，立即使用熒光分光光度計(jì)測(cè)定其熒光強(qiáng)度。儀器參數(shù)條件設(shè)置為：激發(fā)波長(zhǎng)374 nm、狹縫校正寬度5 nm；發(fā)射波長(zhǎng)485 nm、狹縫校正寬度5 nm；靈敏度為2。樣品表面疏水性值以樣品濃度（橫坐標(biāo)）和熒光強(qiáng)度（縱坐標(biāo)）擬合的線性方程的斜率表示。

1.2.3.4 等電點(diǎn)測(cè)定 ScAFPs的等電點(diǎn)利用納米粒度電位儀進(jìn)行測(cè)定。首先使用去離子水配制1 mg/mL ScAFPs溶液，用0.1 mol/L鹽酸將其pH分別調(diào)節(jié)至2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0與8.0后在25 °C下測(cè)定其Zeta電位，上樣量為1 mL。將各pH與相對(duì)應(yīng)的Zeta電位值繪制成折線圖，當(dāng)多肽樣品溶液Zeta電位為0時(shí)，說(shuō)明此時(shí)溶液的pH在等電點(diǎn)附近。

1.2.3.5 熱穩(wěn)定性測(cè)定 稱取適量ScAFPs樣品，使用無(wú)菌水配制15 mg/mL ScAFPs溶液，用0.22 μm濾菌膜過(guò)濾后分裝4份于玻璃試管中，將其用封口膜封口后置于沸水浴中分別加熱0、10、20、30 min，冷卻至室溫后，按照實(shí)驗(yàn)方法1.2.2.4測(cè)定其嗜熱鏈球菌低溫存活率。

1.2.3.6 熱滯活性（THA）測(cè)定 ScAFPs的THA測(cè)定參照WU等[22]的方法稍作變化，用去離子水配制15 mg/mL BSA溶液（對(duì)照組）與ScAFPs溶液，使用帶有Proteus熱分析軟件的差示掃描量熱儀測(cè)定其THA，上樣量為5 μL。a：選取測(cè)定過(guò)程中的保留溫度：將樣品置于10 °C中保溫5 min后，以-2 °C/min的速率使樣品由10 °C降至-30 °C，平衡5 min，使樣品全部結(jié)冰，然后根據(jù)DSC曲線選取保留溫度（Th1：-0.5 °C、Th2：0 °C和Th3：0.3 °C）；b：測(cè)定過(guò)程的溫度梯度流程設(shè)定為：以-2 °C/min速率降溫至-30 °C，平衡5 min，樣品全部結(jié)冰；以2 °C/min升溫/降溫速率在保留溫度與-10 °C之間凍融循環(huán)，每個(gè)保留溫度下恒溫5 min。使用Proteus熱分析軟件計(jì)算樣品的熔化焓（ΔHm）、結(jié)晶開(kāi)始溫度（T0）和放熱焓（ΔHf），THA與樣品中冰的含量（φ）計(jì)算公式如下：

式中：Th：保留溫度，°C；T0：結(jié)晶開(kāi)始溫度，°C；ΔHf：樣品放熱焓，J/g；ΔHm：樣品熔化焓，J/g。

1.2.4 魚(yú)糜的制備 新鮮草魚(yú)擊暈后，去除頭部、魚(yú)鱗、內(nèi)臟、魚(yú)皮與紅肉，取白色魚(yú)肉沖洗干凈，用絞肉機(jī)將其粉碎成魚(yú)糜。按照LIN等[23]所描述的方法洗滌魚(yú)糜，以1:3（w/v）的比例往魚(yú)糜中加入去離子水（4 °C），用電動(dòng)攪拌器勻速攪拌10 min，然后離心（4 °C，6000 r/min）5 min，倒出上清液，該清洗過(guò)程重復(fù)兩次。將洗滌兩遍后的魚(yú)糜重新分散在3倍體積的0.5%氯化鈉溶液中（4 °C），攪拌10 min，離心（4 °C，6000 r/min）15 min脫水后即得到草魚(yú)魚(yú)糜。

1.2.5 魚(yú)糜樣品的處理及凍融循環(huán)處理 將制備所得的草魚(yú)魚(yú)糜平均分為六部分，分別在魚(yú)糜中加入0%、2%、4%、6%、8% ScAFPs和8% SUSO（w/w），其中，0% ScAFPs魚(yú)糜組為空白對(duì)照組，8% SUSO作為陽(yáng)性對(duì)照組。每組樣品用手動(dòng)攪拌器勻速攪拌5 min以確保添加劑和魚(yú)糜混合均勻。各魚(yú)糜樣品組均經(jīng)過(guò)5次凍融循環(huán)，每次循環(huán)在-20 °C冷凍72 h后于25 °C解凍1 h。新鮮未凍藏樣品立即進(jìn)行指標(biāo)測(cè)定，經(jīng)過(guò)冷凍的樣品于每次解凍后進(jìn)行指標(biāo)測(cè)定。

1.2.6 魚(yú)糜凝膠的制備 在新鮮或解凍后的魚(yú)糜樣品中加入2%氯化鈉（w/w），利用研砵研磨3 min，攪拌均勻，制得魚(yú)糜溶膠，將魚(yú)糜溶膠塞進(jìn)預(yù)先切掉頭部的5 mL注射器，避免魚(yú)糜溶膠在注射器中產(chǎn)生空隙而影響后續(xù)實(shí)驗(yàn)，然后用保鮮膜將注射器兩端封緊，利用兩段加熱法（40 °C 30 min，90 °C 30 min）制備魚(yú)糜凝膠。加熱結(jié)束后的魚(yú)糜凝膠立即放置于冰水中冷卻15 min，并在4 °C保存以供進(jìn)一步分析。分析魚(yú)糜凝膠特性前，將制備所得的魚(yú)糜凝膠切成1 cm高的圓柱體。

1.2.7 白度的測(cè)定 在室溫中利用色差儀測(cè)定魚(yú)糜凝膠L*、a*、b*值，每組樣品測(cè)4次平行，結(jié)果取平均值，白度計(jì)算公式如下[24]：

式中：W：樣品的白度；L*：樣品的亮度；a*：樣品顏色的紅綠值；b*：樣品顏色的黃藍(lán)值。

1.2.8 質(zhì)構(gòu)特性（TPA）的測(cè)定 參照YE等[24]的方法稍作修改。利用質(zhì)構(gòu)儀測(cè)定魚(yú)糜凝膠TPA，設(shè)定參數(shù)為：探頭P/36R，測(cè)前速度5.00 mm/s，測(cè)中速度1.00 mm/s，測(cè)后速度10.00 mm/s，觸發(fā)力5.0 g，壓縮比40.0%。選擇硬度、咀嚼性、彈性與粘黏性作為檢測(cè)指標(biāo)。

1.2.9 凝膠強(qiáng)度的測(cè)定 參照LIU等[25]的方法稍作修改。利用質(zhì)構(gòu)儀測(cè)定魚(yú)糜凝膠強(qiáng)度，參數(shù)設(shè)定為：探頭P/0.5，測(cè)前速度5.00 mm/s，測(cè)中速度1.00 mm/s，測(cè)后速度10.00 mm/s，觸發(fā)力20.0 g，壓縮比50.0%。凝膠強(qiáng)度試驗(yàn)曲線上第一個(gè)峰對(duì)應(yīng)的力和距離分別是破斷力與斷裂距離，破斷力可反映凝膠硬度，斷裂距離則反映凝膠彈性，凝膠強(qiáng)度大小為二者乘積。

1.3 數(shù)據(jù)處理

利用Origin 2021軟件作圖，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)結(jié)果均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行單因素方差分析（ANOVA），以P＜0.05作為差異顯著。DSC數(shù)據(jù)利用NETZSCH Proteus Analysis軟件進(jìn)行分析處理。使用Origin 2021軟件的Principal Component Analysis、Multivariate Analysis對(duì)魚(yú)糜凝膠白度、質(zhì)構(gòu)特性（硬度、咀嚼性、彈性、粘黏性）與凝膠強(qiáng)度指標(biāo)進(jìn)行PCA主成分分析與聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 白鰱魚(yú)鱗基本成分

由表2可知，白鰱魚(yú)鱗富含蛋白質(zhì)，脂肪含量較低。白鰱魚(yú)鱗主要由蛋白質(zhì)和灰分組成，占魚(yú)鱗干重的87.51%左右，其中粗蛋白含量為64.78%±0.15%，該結(jié)果表明白鰱魚(yú)鱗是制備膠原基多肽的理想原料。

表 2 白鰱魚(yú)鱗的基本成分（%，w/w，干基）Table 2 The basic components of sliver carp scales (%, w/w, dry basis)

2.2 ScAFPs的制備工藝優(yōu)化

2.2.1 單因素實(shí)驗(yàn)分析 以嗜熱鏈球菌凍融存活率和DH為雙指標(biāo)，對(duì)ScAFPs酶解制備工藝中常見(jiàn)蛋白酶制劑種類、底物濃度、酶底比及酶解時(shí)間這4個(gè)因素進(jìn)行篩選，其篩選結(jié)果如圖1所示。圖1a所示，利用胰蛋白酶制備的酶解液抗凍活性最強(qiáng)，其嗜熱鏈球菌凍融脅迫后存活率為81.56%±4.50%；因此選取胰蛋白酶進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。在確定酶種類后，依次對(duì)底物濃度、酶底比、酶解時(shí)間進(jìn)行分析，其結(jié)果分別如圖1b、1c、1d所示。酶解液的抗凍活性隨著底物濃度、酶底比以及酶解時(shí)間的變化而變化，總體呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，根據(jù)以嗜熱鏈球菌低溫存活率為主指標(biāo)的原則，選取底物濃度4%（w/v）、酶底比3%、酶解時(shí)間3 h進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，因?yàn)榇藭r(shí)嗜熱鏈球菌存活率最高，酶解液的抗凍活性最強(qiáng)。

圖 1 各因素對(duì)嗜熱鏈球菌低溫存活率和DH的影響Fig.1 Effects of various factors on low temperature survival rate of S. thermophilus and DH

2.2.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)分析 在單因素基礎(chǔ)上，以嗜熱鏈球菌凍融后存活率為響應(yīng)值，對(duì)底物濃度、酶底比和酶解時(shí)間進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化，結(jié)果如表3所示。

表 3 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案與結(jié)果Table 3 Experimental design and results of response surface methodology

通過(guò)回歸模擬方差分析結(jié)果（表4）可知，底物濃度（A）對(duì)響應(yīng)值嗜熱鏈球菌存活率的影響顯著（P＜0.01），酶底比（B）對(duì)響應(yīng)值嗜熱鏈球菌存活率的影響極顯著（P＜0.001），而酶解時(shí)間（C）對(duì)響應(yīng)值嗜熱鏈球菌存活率的影響不顯著（P＞0.05）。嗜熱鏈球菌存活率隨著底物濃度、酶底比和酶解時(shí)間變化得到擬合回歸方程：嗜熱鏈球菌存活率=72.57+4.22×A+14.66×B+1.73×C-4.91×AB+5.39×AC-1.73×BC+8.04×A2-11.14×B2-12.08×C2。根據(jù)表4回歸模型的方差分析結(jié)果可知，回歸模型極顯著（P＜0.001），失擬項(xiàng)不顯著（P＞0.05），R2為0.9795，說(shuō)明該模型擬合較好，可用于ScAFPs制備工藝參數(shù)預(yù)測(cè)。

表 4 回歸模型的方差分析（嗜熱鏈球菌存活率為響應(yīng)值）Table 4 Variance analysis of the regression mode (survival rate of S. thermophilus as response value)

響應(yīng)面試驗(yàn)預(yù)測(cè)得到理論最佳條件為：底物濃度5.0%，酶底比3.8%，酶解時(shí)間3.5 h，在該條件下預(yù)測(cè)嗜熱鏈球菌存活率87.81%。對(duì)響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果得到的理論最佳酶解工藝參數(shù)（底物濃度5.0%，酶底比3.8%，酶解時(shí)間3.5 h）進(jìn)行驗(yàn)證，測(cè)得該條件下制得的酶解液對(duì)嗜熱鏈球菌冷凍存活率為82.19%±1.03%，與理論預(yù)測(cè)值87.81%之間無(wú)明顯差異，說(shuō)明響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果可靠。因此，以底物濃度5.0%，酶底比3.8%，酶解時(shí)間3.5 h為制備ScAFPs最佳酶解工藝參數(shù)，在此條件下的DH為7.54%±0.43%。

2.3 ScAFPs的基本性質(zhì)分析

2.3.1 基本成分分析 由表5可知，ScAFPs中多肽含量為93.30%±1.57%，水分和粗灰分含量分別為3.50%±0.00%和2.84%±0.01%，說(shuō)明ScAFPs的多肽含量超過(guò)90%，可用于后續(xù)研究。

表 5 ScAFPs基本成分（%，w/w，干基）Table 5 The basic components of ScAFPs (%, w/w, dry basis)

2.3.2 分子量分布 利用HPLC法測(cè)定ScAFPs的相對(duì)分子質(zhì)量分布，其結(jié)果如圖2所示。由圖可知ScAFPs的相對(duì)分子質(zhì)量主要集中在180～3000 Da之間，占總量的78.95%，其中180～1000 Da之間占42.54%。說(shuō)明ScAFPs主要是由2～10個(gè)氨基酸組成的小肽組成。以上結(jié)果與目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于水解抗凍肽分子質(zhì)量分布趨勢(shì)一致[7,26]。

圖 2 ScAFPs的分子量分布Fig.2 The molecular weight distribution of ScAFPs

2.3.3 表面疏水性 通過(guò)ANS法對(duì)ScAFPs的親疏水性進(jìn)行分析，擬合出來(lái)的線性方程的斜率越大表示疏水性越大，而其親水性越弱[27]。圖3結(jié)果表明，ScAFPs的疏水性值為41.1199，而B(niǎo)SA標(biāo)品的疏水值為1513.6502，說(shuō)明ScAFPs較BSA標(biāo)準(zhǔn)品是一種具有較強(qiáng)親水性的多肽。根據(jù)CHEN等[7]報(bào)道，食源性抗凍肽通常具有較強(qiáng)的親水性，抗凍肽富含的親水基團(tuán)可以維持其與冰晶結(jié)合的穩(wěn)定性。此外，魚(yú)糜在冷凍貯藏過(guò)程中由于冰晶生長(zhǎng)導(dǎo)致的魚(yú)糜肌原纖維蛋白結(jié)合水解離，造成魚(yú)糜肌原纖維蛋白外部水化層被破壞，從而影響魚(yú)糜的凝膠性，而商業(yè)抗凍劑主要是通過(guò)其富含的親水基團(tuán)以維持魚(yú)糜肌原纖維蛋白外部水化層的穩(wěn)定性，從而起到對(duì)魚(yú)糜的冷凍保護(hù)作用[6]。以上結(jié)果說(shuō)明，ScAFPs具有與食源性抗凍肽類似的特點(diǎn)，且其強(qiáng)親水性特點(diǎn)具有作為冷凍保護(hù)劑應(yīng)用于魚(yú)糜冷凍貯藏的潛質(zhì)。

2.3.4 等電點(diǎn) ScAFPs的等電點(diǎn)測(cè)定結(jié)果如圖4所示。等電點(diǎn)可以反映體系的穩(wěn)定性，由圖可知，ScAFPs的等電點(diǎn)在4.2左右，而魚(yú)糜的pH通常在6.0～8.0之間[28]，說(shuō)明ScAFPs適用于魚(yú)糜體系，可以避免多肽的聚集沉淀而影響其抗凍活性。

圖 3 cAFPs的表面疏水性Fig.3 The surface hydrophobicity of ScAFPs

圖 4 cAFPs的Zeta電位分析Fig.4 Zeta potential analysis of ScAFPs

2.3.5 熱穩(wěn)定性 ScAFPs的熱穩(wěn)定性測(cè)定結(jié)果如表6所示。經(jīng)過(guò)沸水處理30 min后，ScAFPs對(duì)嗜熱鏈球菌凍融后的存活率為73.85%±4.22%與未經(jīng)過(guò)沸水處理組的76.57%±1.91%無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。說(shuō)明ScAFPs具有良好的熱穩(wěn)定性。

2.3.6 熱滯活性 當(dāng)AFPs吸附于冰水界面時(shí)，造成冰晶生長(zhǎng)軌跡發(fā)生改變，導(dǎo)致冰水界面蒸汽壓升高使得溶液冰點(diǎn)與熔點(diǎn)之間形成差值，而THA的高低可以通過(guò)這個(gè)溫度差值體現(xiàn)[8-10]。通過(guò)DSC對(duì)ScAFPs的THA及不同保留溫度下凍融過(guò)程的冰晶含量進(jìn)行分析。由圖5可知，與標(biāo)準(zhǔn)蛋白BSA組相比，ScAFPs組在相同保留溫度下降溫過(guò)程中的熱流圖出現(xiàn)一定的滯后現(xiàn)象。進(jìn)一步通過(guò)NETZSCH Proteus Analysis軟件對(duì)熱流圖進(jìn)行積分計(jì)算，得到表7數(shù)據(jù)。由表可以發(fā)現(xiàn)，在較低的保留溫度下，雖然BSA組與ScAFPs組的THA均較低，但是含有ScAFPs的體系中冰晶含量顯著降低。且當(dāng)保留溫度為0.3 °C時(shí)，ScAFPs組的THA為1.1 °C，顯著高于BSA組的0.3 °C。以上結(jié)果表明，雖然ScAFPs在較低的保留溫度下其THA較低，但是能顯著降低體系中的冰晶含量，從而發(fā)揮抗凍效果。

表 6 ScAFPs的熱穩(wěn)定性分析Table 6 Thermal stability analysis of ScAFPs

圖 5 ScAFPs在不同保留溫度下的DSC熱流圖Fig.5 DSC curves of ScAFPs at different retention temperatures

表 7 ScAFPs在不同保留溫度下的熱力學(xué)特性Table 7 Thermodynamic characteristics of ScAFPs at different retention temperatures

2.4 ScAFPs對(duì)凍融魚(yú)糜凝膠特性的影響

2.4.1 白度 白度作為衡量冷凍魚(yú)糜色澤的重要依據(jù)，是判定魚(yú)糜品質(zhì)好壞最直觀的指標(biāo)之一。不同添加量ScAFPs對(duì)凍融魚(yú)糜凝膠白度的影響如表8所示。由表8可知，空白對(duì)照組的魚(yú)糜凝膠初始白度值略高于其余各組處理組魚(yú)糜，這是由于ScAFPs與商業(yè)抗凍劑自身的白度值略差于新鮮魚(yú)糜的白度，其中2%、4% ScAFPs處理組魚(yú)糜的凝膠白度值與空白對(duì)照組相比無(wú)顯著性差異（P＞0.05），6%、8%ScAFPs處理組魚(yú)糜的凝膠白度值與商業(yè)抗凍劑處理組相比無(wú)顯著性差異（P＞0.05），這說(shuō)明2%～8%ScAFPs添加量對(duì)魚(yú)糜凝膠初始白度值的影響在可接受范圍內(nèi)。在凍融循環(huán)過(guò)程中，魚(yú)糜的色澤會(huì)逐漸變差，僅經(jīng)歷1次凍融循環(huán)處理，空白對(duì)照組的白度值便低于2%、4% ScAFPs處理組魚(yú)糜；經(jīng)過(guò)5次凍融循環(huán)后，空白對(duì)照組的魚(yú)糜白度值較初始值下降7.52%，變化幅度最大，商業(yè)抗凍劑組的魚(yú)糜白度值較初始值下降4.95%，而2%、4% ScAFPs處理組魚(yú)糜僅下降2.84%與2.80%，6%與8% ScAFPs處理組魚(yú)糜的白度值與初始值相比均無(wú)顯著變化（P＞0.05）。以上結(jié)果證明了ScAFPs可以有效保護(hù)魚(yú)糜的白度，并且與商業(yè)抗凍劑相比，ScAFPs對(duì)魚(yú)糜初始白度值影響更小，保護(hù)效果更佳，說(shuō)明ScAFPs對(duì)魚(yú)糜制品的后續(xù)深加工應(yīng)用前景更廣闊。

2.4.2 TPA 為了評(píng)估ScAFPs對(duì)凍融魚(yú)糜凝膠結(jié)構(gòu)的保護(hù)作用，測(cè)定了魚(yú)糜凝膠的質(zhì)構(gòu)特性，選取硬度、咀嚼性、彈性和粘黏性四個(gè)指標(biāo)進(jìn)行分析（表9）。由表可知，添加ScAFPs或商業(yè)抗凍劑處理組的魚(yú)糜凝膠初始硬度、咀嚼性、粘黏性較空白對(duì)照組有所下降（P＜0.05），JITTINANDANA等[29]與KORZENIOWSKA等[30]研究均指出添加商業(yè)抗凍劑可以導(dǎo)致魚(yú)糜凝膠硬度下降而使其質(zhì)地變得更柔軟，這說(shuō)明ScAFPs與商業(yè)抗凍劑一樣具有提高魚(yú)糜質(zhì)地柔軟度與彈性的作用。經(jīng)過(guò)1次凍融時(shí)，空白對(duì)照組的魚(yú)糜凝膠咀嚼性與粘黏性突增，彈性值突降，這有可能是魚(yú)糜在冷凍過(guò)程中冰晶對(duì)蛋白質(zhì)的損傷與蛋白質(zhì)聚集、變性所導(dǎo)致的[31]，相較于空白對(duì)照組，ScAFPs與商業(yè)抗凍劑處理組的添加使魚(yú)糜質(zhì)構(gòu)在凍融處理?xiàng)l件下表現(xiàn)更穩(wěn)定。而經(jīng)過(guò)5次凍融后，空白對(duì)照組魚(yú)糜所制備的凝膠硬度、咀嚼性、粘黏性均下降最多，與初始值相比，分別下降了36.86%、40.13%與6.45%，添加了2%～8% ScAFPs與商業(yè)抗凍劑處理組魚(yú)糜的凝膠硬度及咀嚼性與各自初始值相比，分別下降了27.62%、32.52%、31.16%、28.55%、32.06%和22.69%、31.07%、29.79%、26.02%、26.94%。以上結(jié)果說(shuō)明，ScAFPs與商業(yè)抗凍劑對(duì)魚(yú)糜凝膠硬度與咀嚼性的下降具有抑制作用。

表 8 凍融循環(huán)中ScAFPs對(duì)魚(yú)糜凝膠白度的影響Table 8 Effects of ScAFPs on whiteness of surimi gel during freeze-thaw cycles

表 9 凍融循環(huán)中ScAFPs對(duì)魚(yú)糜凝膠質(zhì)構(gòu)特性的影響Table 9 Effects of ScAFPs on gel texture properties of surimi during freeze-thaw cycles

2.4.3 凝膠強(qiáng)度 魚(yú)糜凝膠強(qiáng)度可以客觀反應(yīng)凝膠三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的聚集程度，從而評(píng)價(jià)魚(yú)糜制品的品質(zhì)[32]。ScAFPs添加量對(duì)凍融魚(yú)糜的凝膠破斷力、斷裂距離以及凝膠強(qiáng)度的影響如圖6所示。從圖中可以看出，與空白對(duì)照組相比，ScAFPs或商業(yè)抗凍劑的添加對(duì)魚(yú)糜凝膠初始破斷力、斷裂距離以及凝膠強(qiáng)度均無(wú)顯著影響（P＞0.05），結(jié)合表9凝膠質(zhì)構(gòu)特性初始值分析，說(shuō)明ScAFPs與商業(yè)抗凍劑僅改變魚(yú)糜凝膠質(zhì)地的柔軟度而不影響魚(yú)糜凝膠的成膠性。隨著凍融處理次數(shù)的增加，各組魚(yú)糜樣品組的凝膠破斷力、凝膠強(qiáng)度整體呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，斷裂距離呈上升趨勢(shì)，這意味著凍融使魚(yú)糜蛋白發(fā)生冷凍變性，導(dǎo)致魚(yú)糜凝膠性能變差。經(jīng)過(guò)5次凍融處理后，空白對(duì)照組魚(yú)糜的凝膠強(qiáng)度從2535.43下降至1525.07 g·mm，降低了39.85%，而2%、4%、6%、8% ScAFPs與商業(yè)抗凍劑處理組魚(yú)糜僅分別下降4.05%、5.01%、4.11%、15.64%和14.90%，由此可見(jiàn)，ScAFPs比商業(yè)抗凍劑對(duì)凍融魚(yú)糜的凝膠性能保護(hù)效果更佳，僅添加2%ScAFPs就可以很好的保護(hù)魚(yú)糜在凍融條件下保持良好的凝膠性，但8% ScAFPs處理組魚(yú)糜對(duì)魚(yú)糜凝膠的低溫保護(hù)效果略微有所下降，這可能是因?yàn)檫^(guò)量的ScAFPs會(huì)阻礙肌原纖維蛋白交聯(lián)，ScAFPs中含有較多小分子游離氨基酸，過(guò)高的添加量會(huì)導(dǎo)致魚(yú)糜體系中存在高濃度的游離氨基酸，這將有所抑制魚(yú)糜蛋白形成凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)[33]。

2.5 PCA主成分分析

對(duì)不同處理組魚(yú)糜的凝膠特性指標(biāo)進(jìn)行PCA主成分分析，得到凍融循環(huán)期間各處理組魚(yú)糜的魚(yú)糜凍藏品質(zhì)有關(guān)指標(biāo)的線性組合并將其投射到二維平面上（圖7a）。從圖中可以看出，第一主成分（PC1）可以解釋50.0%的總方差，第二主成分（PC2）解釋28.7%的總方差，表明數(shù)據(jù)中78.7%的總方差由前兩個(gè)主成分解釋。PC1除了與彈性呈負(fù)相關(guān)作用，與其余指標(biāo)均呈正相關(guān)作用。PC2與白度、硬度、彈性、凝膠強(qiáng)度呈正相關(guān)關(guān)系，與咀嚼性、粘黏性呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。

圖 6 凍融循環(huán)中ScAFPs對(duì)魚(yú)糜凝膠強(qiáng)度的影響Fig.6 Effects of ScAFPs on gel strength of surimi during freeze-thaw cycles

圖7b顯示了在二維空間中使用PC1和PC2作為負(fù)荷因子的不同處理組的預(yù)測(cè)得分圖，將圖7b中的樣品位置映射于圖7a中，推斷位于象限1、2、3和4的指標(biāo)與相應(yīng)象限中的樣品相關(guān)[34]。從圖中可以看出，空白對(duì)照組除了新鮮魚(yú)糜樣品（0-0）分布在第1象限，一次凍融的樣品（0-1）最接近咀嚼性與粘黏性，說(shuō)明空白對(duì)照組魚(yú)糜樣品經(jīng)1次凍融后對(duì)凝膠的咀嚼性與粘黏性影響較大，其余樣品主要分布第4象限，隨著凍融次數(shù)的增加，樣品遠(yuǎn)離各項(xiàng)指標(biāo)距離變大，說(shuō)明凍融處理對(duì)空白對(duì)照組魚(yú)糜凝膠特性影響很大。而ScAFPs與商業(yè)抗凍劑處理組魚(yú)糜樣品主要分布于靠近象限中心的第1、2象限中，與凝膠特性各指標(biāo)的直線距離小于空白對(duì)照組。基于以上結(jié)果，說(shuō)明凍融循環(huán)期間，空白對(duì)照組魚(yú)糜凝膠特性被嚴(yán)重破壞，添加ScAFPs與商業(yè)抗凍劑有效保護(hù)魚(yú)糜凍藏期間的凝膠特性。此外，商業(yè)抗凍劑與2%ScAFPs的位置最接近，說(shuō)明就整體而言，2% ScAFPs的抗凍效果就與商業(yè)抗凍劑相似。

圖 7 凍融循環(huán)中ScAFPs對(duì)魚(yú)糜凝膠特性的PCA分析Fig.7 PCA analysis of gel characteristics of surimi by ScAFPs during freeze-thaw cycles

2.6 聚類分析

將凍融期間的各處理組魚(yú)糜樣品進(jìn)行聚類分析，如圖8所示。從圖中可以看出，魚(yú)糜主要被分為5類。第1類將0-0、0-1聚為一類；2-0、2-1、2-2、2-3、2-4、4-0、4-1、4-2、4-4、6-0、6-1、6-2、8-0、8-1、s-0、s-1、s-2聚為第2類；0-2、2-5、4-3、4-5、6-3、6-4、6-5、8-2、8-3、8-4、8-5、s-3、s-4、s-5聚 為 第3類；0-3被單獨(dú)聚為第4類；0-4、0-5聚為第5類，該結(jié)果表明空白對(duì)照組與添加抗凍劑樣品組差異明顯。從第3類中可以看出，空白對(duì)照組僅經(jīng)過(guò)第二次凍融（0-2）的魚(yú)糜凝膠特性與添加2% ScAFPs經(jīng)5次凍融、4%、6%、8% ScAFPs及商業(yè)抗凍劑的魚(yú)糜樣品經(jīng)2～5次凍融后的凝膠特性相似，說(shuō)明添加ScAFPs或商業(yè)抗凍劑的冷凍魚(yú)糜可以有效保護(hù)凍融魚(yú)糜凝膠特性。此外，從第2類分類中可以得知，ScAFPs添加量為2%、4%對(duì)凍融魚(yú)糜的凝膠特性較高添加量6%、8%及商業(yè)抗凍劑的效果好，說(shuō)明在魚(yú)糜低溫保護(hù)應(yīng)用中，不宜添加含量過(guò)高的ScAFPs。

圖 8 不同凍融循環(huán)魚(yú)糜樣品組的聚類分析Fig.8 Cluster analysis of surimi samples with different freeze-thaw cycles

3 結(jié)論

本研究?jī)?yōu)化得到ScAFPs最佳酶解制備工藝，并探究了ScAFPs對(duì)凍融魚(yú)糜的凝膠特性的影響。研究結(jié)果表明，用胰蛋白酶在最佳酶解制備工藝參數(shù)（底物濃度5.0%、酶底比3.8%、酶解溫度37 °C、酶解時(shí)間3.5 h）下制備得到的ScAFPs的多肽含量為93.30%±1.57%，等電點(diǎn)為4.2左右，相對(duì)分子量在180～3000 Da之間的含量占總含量的78.95%，且ScAFPs還具有極強(qiáng)的親水性和較好的熱穩(wěn)定性，并且能有效降低體系冰晶含量。而ScAFPs對(duì)凍融魚(yú)糜的凝膠特性綜合分析，結(jié)果表明對(duì)照組（未添加低溫保護(hù)劑的魚(yú)糜）在經(jīng)過(guò)5次凍融循環(huán)后，其色澤、硬度、咀嚼性、凝膠強(qiáng)度較初始值各下降7.52%、36.86%、40.13%與40.05%，而添加2% ScAFPs對(duì)凍融魚(yú)糜凝膠特性具有良好保護(hù)作用，較初始值僅下降2.84%、27.62%、22.69%、4.05%，且效果優(yōu)于商業(yè)抗凍劑（4.95%、32.06%、26.94%、14.90%）。通過(guò)PCA與聚類分析，進(jìn)一步闡明ScAFPs對(duì)凍融魚(yú)糜凝膠具有良好的冷凍保護(hù)效果。以上研究結(jié)論說(shuō)明，ScAFPs具有作為新型魚(yú)糜低溫保護(hù)劑的潛力。