基于HS-SPME-GC-MS和PLS-DA分析不同季節早白尖紅茶揮發性風味物質

潘婉舒，胡先強，張正義，呂 陳，王 松,3,

（1.宜賓學院農林與食品工程學部，四川宜賓 644000；2.中國人民大學長江經濟帶研究院，四川宜賓 644000；3.宜賓學院固態發酵資源利用四川省重點實驗室，四川宜賓 644000）

筠連早白尖紅茶是四川工夫紅茶的優質代表，為國家地理標識產品。早白尖品種是由四川筠連本地川小葉群體種經多年選育出的國家級良種，種植區海拔760～1200 m，土壤為黃或棕壤且偏酸性，腐殖質含量較高，茶樹成活率高，生長優勢強，全年采摘期長達7個月，鮮葉具有“早、嫩、快、好”的優良品質[1]。筠連早白尖紅茶條索顯金毫，湯色濃亮，滋味醇厚鮮爽，帶桔糖香，深受消費者喜愛。

茶的香氣是其最重要的感官屬性之一，對茶葉的品質和市場價格具有重要影響，而紅茶是揮發性風味物質濃度最高，香氣感知度最強烈的茶型[2-4]，因此有關各地紅茶香氣物質方面的研究越來越受到關注。紅茶香氣的形成主要受茶樹品種和加工工藝的影響[5-7]，另外采摘季節、土壤條件、栽培海拔高度等也顯著影響紅茶中香氣物質的組成和含量，進而產生不同紅茶類型的香氣品質[8-11]。目前對早白尖紅茶香氣的研究僅有少量感官香型描述[12]，對不同季節筠連早白尖紅茶香氣成分的研究鮮見報道。

在分析茶中揮發性化合物方面，頂空-固相微萃取（HS-SPME）已被證明是一種無溶劑、快速、簡單且方便的方法[13]，其通常與氣相色譜-質譜聯用（GCMS）結合進行分析，通過標準質譜庫和保留指數來鑒定和定量單個揮發性化合物[14-16]。同時，為了最大程度地從揮發性成分分析的大數據中提取有用信息，應用化學計量學方法如主成分分析（PCA）、偏最小二乘-判別分析（PLS-DA）、層次聚類分析（HCA）等對數據進行處理和分析是非常必要的[17-18]。目前，HSSPME-GC-MS與這些化學計量學方法相結合的模式已在分析不同類型茶樣品中獲得了越來越多的成功[19-20]。然而，相關研究模式尚未用于筠連早白尖紅茶揮發性成分研究。

為了解筠連早白尖紅茶的主要香氣成分，解析不同季節早白尖紅茶關鍵香氣物質及差異，本研究采用HS-SPME-GC-MS定性定量分析春、夏、秋茶中各香氣成分，采用PLS-DA以茶樣中香氣成分的相對含量建立不同季節判別模型，確定對分類起關鍵作用的香氣成分，最后通過聚類分析的樹狀熱圖來確定各關鍵香氣成分在不同季節筠連早白尖紅茶中的分布規律，為更加科學和客觀地評價筠連早白尖紅茶的香氣品質和地方優質紅茶品牌塑造提供一些參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

供試早白尖紅茶 由四川筠連縣農產品品牌辦公室提供，于2019年采自筠連縣茶園，春、夏、秋茶分別于3、6、9月份采集，采摘標準為一芽二葉，當季從不同的茶園（位于北緯27°，東經104°，其中，H和L茶園海拔1100～1200 m，W、S和Y茶園海拔600～700 m）共采集5個茶樣，鮮葉收集到同一加工廠，按照“萎凋-揉捻-發酵-干燥”[21]的傳統川紅工藝制得紅茶成品，每個茶樣3個重復，所有工藝參數一致。當季紅茶成品研磨過60目篩，自封袋封裝后常溫保存，隨后送至實驗室3 d內完成測試分析。每季均從相同的茶園獲得同樣數量的鮮葉用于成品制作，三季共測試分析15個茶樣。

FA1104分析天平 上海舜宇恒平科學儀器有限公司；氣相色譜（7890A）-質譜（5975C）聯用儀 美國安捷倫科技有限公司；65 μm PDMS/DVB固相微萃取頭 美國Supelco公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品前處理 稱取0.4 g磨碎茶樣于樣品瓶中，添加10 μL內標溶液（1-辛醇 10 μg/mL），加入0.6 g NaCl和2 mL 100 ℃蒸餾水，加蓋密封，60 ℃水浴中平衡15 min[22]。使用65 μm PDMS/DVB固相微萃取頭60 ℃頂空吸附60 min，進樣口240 ℃，解析5 min。

1.2.2 色譜條件 采用HP-5MS石英毛細管色譜柱（30 m×0.32 mm，0.25 μm）；進樣口溫度240 ℃，載氣為高純度氦氣，流速0.8 mL/min，不分流進樣；梯度升溫程序：柱溫為0 ℃，保持3 min，以 2 ℃/min升至 90 ℃，保持 5 min，再以 3 ℃/min 升至 160 ℃，以10 ℃/min升至250 ℃，保持5 min。

1.2.3 質譜條件 離子源為EI源，溫度230 ℃，電子能量70 eV，四極桿溫度150 ℃，接口溫度280 ℃，電子倍增器電壓1680 V，掃描范圍44～350 m/z。

1.2.4 揮發性成分的定性和定量 根據樣品總離子流圖，結合NIST 98.L譜庫和前人的相關研究，對不同季節茶葉中揮發性成分進行鑒定，篩選匹配度達到90%以上的化合物，同時排除柱流失等干擾性化合物。以1-辛醇為內標作為峰面積對照，參照汪鵬等[23]的研究方法采用歸一法計算相對含量和內標法半定量計算其余組分含量，計算公式如下：

1.3 數據處理

原始數據用Microsoft Excel 2019進行預處理；采用SPSS 22.0進行單因素方差分析；采用SIMCAP14.1進行偏最小二乘（PLS-DA）分析；采用Origin 2019進行圖表繪制。

2 結果與分析

2.1 不同季節筠連早白尖紅茶揮發性成分分析

早白尖紅茶樣品色譜圖見圖1。如表1所示，對不同季節共15個早白尖紅茶樣品中揮發性成分分析表明，總共鑒定出44種化合物，包括醛類、醇類、酮類、酯類、碳氫化合物、雜環類及其他類化合物。其中醇類物質相對含量最豐富，共檢出11種，各樣品相對含量35.34%～64.42%之間，樣品平均相對含量為53.65%；其次是醛類物質，共檢測出12種，各樣品相對含量在10.57%～36.88%之間，樣品平均相對含量為20.29%；酯類物質為第三大類揮發性成分，共檢測出2種，各樣品相對含量在5.09%～20.92%之間，樣品平均相對含量為12.28%；酮類、碳氫化合物和雜環類及其他類物質相對含量均非常低，分別檢測出8種、6種、5種，樣品平均相對含量分別只有0.55%、0.19%和3.93%。馬玉青等[24]研究云南滇紅香氣組成包含醇類、酯類、醛類、萜烯類、酮類，其中醇類接近香氣總量的43%，遠高于其它種類化合物占比。章港等[25]利用SPME-GC-MS技術研究祁門紅茶，發現醇類、醛類與酯類成分是主要揮發性香氣物質，分別占總含量的67.54%、16.93%和11.36%。筠連早白尖紅茶香氣組成與前人研究基本一致，即紅茶香氣物質主要是醇類、醛類和酯類，由鮮葉中的糖苷類、氨基酸、脂肪酸、β-胡蘿卜素等香氣前體物質在萎凋、揉捻、發酵、干燥的加工過程中通過一系列生物化學反應逐漸形成[26]。

圖 1 早白尖紅茶樣品（春季CH）GC-MS色譜圖Fig.1 Sample chromatogram (Spring CH) of Zaobaijian black tea

表 1 各季節樣品揮發性成分（μg/g）Table 1 Volatile components of each tea sample collected from different seasons (μg/g)

根據各樣品揮發性成分（表1），春季樣品平均揮發性成分最高（179.43 μg/g），夏季樣品次之（175.56 μg/g），秋季樣品最低（137.62 μg/g），但三季樣品之間差異不顯著（P＞0.05）。從季節來看（圖2），春季樣品酯類物質含量顯著高于（P＜0.05）夏季和秋季樣品，醇類物質顯著高于（P＜0.05）秋季，醇類物質主要差異來自香葉醇，春季5個樣品中均檢出了含量豐富的香葉醇，平均含量達到了44.38 μg/g，而夏季和秋季樣品檢出的是橙花醇（順-香葉醇），平均含量分別為11.78和18.59 μg/g。香葉醇主要由鮮葉中萜烯醇類糖苷在加工過程中水解形成，具有典型的玫瑰花香和甜香，是“祁門香”的主要香氣物質之一[25]。王夢琪等[26]研究發現不同季節鮮葉中各類糖苷含量的是不同的，春季以萜烯醇類糖苷為主，其含量可以達到70%以上，而夏季和秋季萜烯醇類糖苷大幅減少，芳香族醇和脂肪族醇糖苷含量明顯增多。酯類物質的主要差異來自于水楊酸甲酯，具有典型的冬青香氣，春季樣品平均含量高達34.72 μg/g，而夏季和秋季樣品分別為18.14 μg/g和13.64 μg/g。秋季樣品的醛類物質最豐富，且顯著高于（P＜0.05）春季樣品；本實驗檢出的醛類物質除了β-檸檬醛以外，其余醛類在秋季樣品中的平均含量均高于春季樣品，尤其是苯乙醛，夏季和秋季樣品平均含量分別為21.38 μg/g和15.42 μg/g，而春季樣品只有6.81 μg/g。另外，春季樣品酮類物質相對含量最高，秋季樣品碳氫類和雜環類物質相對含量最高，但其含量在樣品中均極低，且三季節樣品之間無顯著性差異（P＞0.05），而夏季樣品各類物質相對含量大多處于春季和秋季樣品之間，只有酮類物質含量最低。

圖 2 不同季節早白尖紅茶中各類香氣化合物相對含量Fig.2 Relative content of various aroma compounds in Zaobaijian black tea collected in different seasons

從所有樣品的平均化合物含量來看，苯乙醇（26.69 μg/g）、水楊酸甲酯（22.17 μg/g）、苯甲醛（15.61 μg/g）、苯乙醛（14.54 μg/g）、芳樟醇氧化物Ⅰ（14.56 μg/g）、苯甲醇（12.00 μg/g）、2,4-二叔丁基苯酚（6.25 μg/g）在所有樣品中均可發現，另外香葉醇（或橙花醇）、芳樟醇（8.23 μg/g）、芳樟醇氧化物Ⅱ（7.38 μg/g）、順-己烯-1-醇（2.30 μg/g）、己烯醛（1.89 μg/g）等化合物也在超過80%的樣品中發現且大部分含量較高，表明這些揮發性成分是構成筠連早白尖紅茶香氣的重要成分。Chen等[27]發現芳樟醇氧化物I、II和III、E,E-2,4-壬二烯醛、4,5-二甲基-3-羥基-2,5-二氫呋喃-2-酮、1-辛烯-3-酮、E,E-2,6-壬二烯醛和雙（2-甲基-3-呋喃基）二硫化物是陜西漢中紅茶的主要香氣化合物；Kang等[28]發現己烯醇、1-辛烯-3-醇、苯甲醇、芳樟醇、脫氫芳樟醇、苯乙醇、己醛、苯乙醛、2-壬酮、β-月桂烯、檸檬烯、2-戊基呋喃、庚酸和甲基吡嗪是祁門紅茶的主要香氣化合物，這與筠連早白尖紅茶存在一定差異；而Wang等[29]對云南滇紅的研究發現芳樟醇、香葉醇、芳樟醇氧化物II、反-橙花叔醇、氧化芳樟醇III和氧化芳樟醇I、苯甲醛、苯乙醛、β-環檸檬醛、水楊酸甲酯、β-紫羅蘭酮是主要香氣化合物，這與本研究結果高度相似。推測可能是由于筠連早白尖紅茶在加工工藝上與云南滇紅有更好的一致性，其差異則可能來自原料及生態環境的不同。

本實驗在春季樣品中均檢測到茉莉酮（0.95 μg/g），而夏秋季樣品均未檢出。茉莉酮是由鮮葉中不飽和脂肪酸如亞麻酸經脂質氧化形成的環狀揮發性芳香化合物，具有濃郁的茉莉花香[30]，雖然其在樣品中含量不高，但其香氣閾值低，推測其對紅茶整體香氣仍有一定影響。以上結果表明，筠連早白尖紅茶香氣化合物組成與云南滇紅比較一致，表現出明顯的花香和果香，但不同季節樣品之間存在差異，尤其是春季樣品具有極高含量的醇類和酯類，整體香氣組成與夏秋樣品明顯不同。

2.2 不同季節筠連早白尖紅茶香氣成分的PLS-DA

為了更好地進行三個季節紅茶風味識別，以筠連早白尖紅茶揮發性化合物為X變量，季節屬性為Y變量，利用SMICA14.1軟件進行PLS-DA分析，所建立的PLSR模型提取3個主成分可以解釋82%的原始變量，說明該模型能夠成功地反映樣品的整體信息。以第一主成分和第二主成分為橫縱坐標建立樣品和揮發性化合物的相關性得分圖和載荷圖（圖3），15個茶樣的相似度在95%的置信區間內，各茶樣表現出明顯的聚類趨勢，未發現離群樣本點，說明建立的PLS-DA模型可對15個茶樣進行分類。由圖3A可以看出，春季茶和夏秋兩季茶可以在主成分1上明顯區分，夏季和秋季茶在主成分2上具有一定的區分度，但不能完全進行區分。各主成分的載荷值代表該主成分對該類物質反映程度的大小，由圖3B可知，香葉醇、水楊酸甲酯、橙花醇、苯乙醛等物質在第一主成分的載荷值較大，芳樟醇氧化物Ⅰ和Ⅱ、2,4-庚二烯醛在第二成分上的載荷值較大。

圖 3 PLS-DA模型樣品得分圖（A）和因子載荷圖（B）Fig.3 PLS-DA model samples score plot (A) and factor loading plots (B)

通過PLS-DA 的變量投影重要度（variable importance for the projection，VIP）分析可知（表2），香葉醇、芳樟氧化物Ⅰ、苯乙醛、橙花醇、水楊酸甲酯、芳樟醇氧化物Ⅱ、2,4-庚二烯醛、芳樟醇、苯乙醇、苯甲醛的VIP值均＞1，是不同季節筠連早白尖紅茶相互判別的主要特征標志物。付靜[31]發現香葉醇、水楊酸甲酯、β-芳樟醇、苯乙醇、苯甲醛和苯乙醛是不同季節陜西工夫紅茶的主要呈香物質組分，其中春季茶香葉醇含量能達到40%以上，夏秋季茶則呈明顯降低趨勢，而水楊酸甲酯和芳樟醇類在春季茶中含量較低，從夏季開始則有增加趨勢，說明通過檢測紅茶中香葉醇、水楊酸甲酯、β-芳樟醇、苯乙醇、苯甲醛和苯乙醛的含量可以區分不同季節樣品，這與本文的研究結果相似；黃浩等[32]研究發現保靖黃金1號工夫紅茶的秋季茶香氣指數最高，夏、春季茶次之，不同季節的標志差異性化合物為水楊酸甲酯、苯甲醛、月桂烯、2,6-二甲基-3,7-辛二烯-2,6-二醇、1-乙基-2-甲酰吡咯、藏紅花醛、反-橙叔醇、苯乙烯、2-辛烯-1-醛、反-2-癸烯醛、苯乙醇、反-芳樟醇氧化物（吡喃型）、反-2-壬烯醛，則與本文研究結果存在一定差異，這可能是由于茶葉品種以及工藝不同導致的。

表 2 PLS-DA分析中關鍵香氣成分的VIP值、P值和香氣特征Table 2 VIP value, P value and aroma characteristics of key aroma components in PLS-DA analysis

為更好地了解10種關鍵香氣成分分別在不同季節筠連早白尖紅茶中的分布情況，將10種香氣成分在樣品中的含量進行單因素方差分析，發現不同季節茶樣中香葉醇、水楊酸甲酯、苯乙醛具有極顯著差異（P＜0.01），芳樟醇氧化物Ⅰ和Ⅱ、橙花醇、芳樟醇具有顯著差異（P＜0.05），而苯乙醇、2,4-庚二烯醛和苯甲醛無顯著差異（P＞0.05）。

2.3 關鍵特征標志物在不同季節筠連早白尖紅茶中的聚類分析

本實驗將VIP＞1且差異顯著的7種關鍵特征標志物在不同季節樣品中的相對含量分布情況進行分層聚類并繪制熱圖，如圖4所示，顏色由黃色到紅色，代表相對含量由低到高。苯乙醛和橙花醇聚為第一種香氣類型，主要表現為玫瑰花香和水果甜香，平均相對含量在秋季樣品中最高，夏季次之，春季樣品中含量最低，但苯乙醛在夏季樣品中平均相對含量也較高，與秋季樣品無顯著性差異（P＞0.05）；香葉醇單獨聚為第二種香氣類型，前文已討論到其只在春季樣品中出現且相對含量較高，主要表現為玫瑰花香；水楊酸甲酯和芳樟醇聚為第三種香氣類型，主要表現為花果香、檸檬香、冬青味、薄荷味，在春季樣品中平均相對含量最高，秋季最低，但芳樟醇在夏季樣品中平均相對含量也較高，與春季樣品無顯著性差異（P＞0.05）；最后是芳樟醇氧化物Ⅰ和芳樟醇氧化物Ⅱ聚為第四種香氣類型，主要表現為花果香和檸檬香，在夏季樣品中相對含量最高，秋季最低。

圖 4 7種關鍵香氣成分在不同季節早白尖紅茶中相對含量熱圖Fig.4 Heat maps of seven key aroma components in Zaobaijian black tea samples harvested in different seasons

綜上所述，苯乙醛、橙花醇和香葉醇可以作為區分春季和夏秋兩季茶樣的特征標志物，特別是橙花醇可以進一步區分秋季和夏季茶樣，表明筠連早白尖秋季紅茶更突出玫瑰花香和水果甜香；在此基礎上，芳樟醇氧化物Ⅰ和Ⅱ可以作為進一步區別夏、秋兩季茶樣的特征標志物，表明筠連早白尖夏季紅茶更突出花果香和檸檬香。值得注意的是，本實驗發現部分關鍵特征標志物即使在同一季節的不同早白尖紅茶樣品中分布也存在較大差異，比如芳樟醇，在春季和夏季樣品中均是低海拔茶園含量顯著高于高海拔茶園含量，推測可能是由于海拔差異（海拔高度相差超過500 m），海拔差異會帶來氣候條件的差異，進而影響茶葉初級、次級代謝物，研究發現[9]與高海拔茶葉相比，低海拔茶葉含有更多的丙氨酸、異亮氨酸和蘋果酸等，這也成為影響茶葉香氣成分的重要因素[34]，具體影響規律還有待進一步研究。

3 結論

本研究對不同季節筠連早白尖紅茶香氣成分進行研究，共鑒定出44種香氣化合物，筠連紅茶香氣成分與云南滇紅香氣成分具有一定的相似性，表現出明顯的花香和果香特征。但不同季節筠連早白尖紅茶揮發性風味物質具有顯著差異，通過PLS-DA 的變量投影重要度分析明確了10種主要特征香氣成分，可以明顯區分春季與夏秋兩季茶樣。其中，苯乙醛、橙花醇和香葉醇可以區別春季與其它兩季茶樣；在此基礎上可通過芳樟醇、芳樟醇氧化物Ⅰ和Ⅱ對夏、秋兩季樣品進行進一步區分，進而實現以筠連早白尖紅茶樣品的香氣成分來對原料采收期進行溯源，并為筠連早白尖紅茶的開發提供了理論依據，為地方優質紅茶品牌塑造提供參考；也為今后進一步探索筠連早白尖紅茶關鍵香氣成分形成機制，以及繼續研究茶園海拔、加工工藝、采收年份等因素對筠連早白尖紅茶香氣成分的影響奠定基礎。