高效液相色譜-串聯質譜法檢測動物源性食品中9種抗病毒藥物殘留

宮艷超，趙 靖，崔 迎，吳國旭

（天津渤海職業技術學院環境與化工學院，天津 300402）

抗病毒藥物是一類用于預防和治療人和動物病毒感染的藥物，目前較常用的抗病毒藥物主要有核苷類（阿昔洛韋、奧司他韋、泛昔洛韋、嗎啉胍）、非核糖苷類（阿比多、三環胺類美金剛、金剛烷胺）、非核苷類（奈韋拉平）以及異環胺類（咪喹莫德）等[1-2]。由于抗病毒藥物對動物常見的病毒性流感疾病有一定的預防和治療效果，且價格低廉[3-4]，常被用在畜牧養殖業中。但是在使用過程中用量控制不好或者濫用會使這些抗病毒藥物在動物體內形成藥物殘留等問題，嚴重的還可能會使病毒菌株發生變異，危害人類健康[5-6]。目前抗病毒藥物多組分的檢測方法尚不完善，有必要建立一種方法快速檢測這些組分，加強抗病毒藥物在動物源性食品中的殘留監控。

現如今對食品的安全性要求較高，市場上以動物源為基質的食品品種繁多，所占市場份額也越來越大。加之近些年食品中獸藥殘留事件頻頻曝光，所以人們對這類特殊食品中的藥物殘留越來越重視，而抗病毒藥物的殘留檢測就是其中研究的熱點[7-9]。目前食品中抗病毒藥物殘留的檢測方法主要有酶聯免疫法[10-12]、高效液相色譜法[13-14]、液相色譜-串聯質譜法[15]等。由于大多數抗病毒藥物屬于強極性化合物，在常規反相色譜柱上保留性能不佳，強極性和高水溶性也給樣品前處理和色譜分離增加了難度。采用溶劑萃取的前處理方式處理動物源性食品，目標物回收率不理想。酶聯免疫法、高效液相色譜法較為常用，但由于儀器精度所限，檢測的靈敏度不高；常用的高效液相色譜-串聯質譜法雖靈敏度較色譜法有所提高，但檢測時流動相中需加入離子對試劑，會存在系統穩定性差以及容易出現高離子強度抑制待測物電離等問題[16]。親水交互作用色譜（Hydrophilic interaction chromatgraphy，HILIC）是一種組分分離模式介于正相色譜和反相色譜之間的色譜技術，適用于分析強親水性和強極性化合物，可解決樣品中多種強極性組分分離難的問題[17-18]。國內將親水交互作用色譜法應用于食品中抗病毒藥物檢測方面的研究較少，本研究通過式固相萃取凈化技術，結合親水色譜分離技術對強極性較難分離的9種抗病毒藥物組分進行提取后，通過親水交互作用色譜-串聯質譜法（HILIC-tandem mass spectrometry，HILIC-MS/MS）檢測動物源性食品中9種抗病毒藥物組分的殘留，克服了常規方法目標物難分離的缺陷，以期為此類藥物殘留的分析和監控提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

奈韋拉平（98.5%）、泛昔洛韋（99.2%）、阿比多（99.0%）、阿昔洛韋（99.0%）、咪喹莫德（99.5%）、美金剛（99.0%）、金剛烷胺（98.5%）、奧司他韋（99.2%）、嗎啉胍（98.5%） 標準品，上海安譜實驗科學科技有限公司；乙酸銨、三氯乙酸、偏磷酸 分析純，國藥集團化學試劑有限公司；甲醇、乙腈 色譜純，德國Merck公司；MCX、MAX以及PRiME HLB固相萃取小柱（規格均為100 mg/3 mL） 美國Waters公司；動物源性食品（牛肉干、豬肉脯、羊肉卷、雞肉腸、火腿腸、醬鹵肉、醬鴨翅、雞蛋、牛奶）

購買于當地超市。

Waters Xevo TQ-S三重四級桿液質聯用儀、ZIC-HILIC色譜柱（4.6 mm×150 mm，3.5 μm） 美國Waters公司；Inert Sustain Amide色譜柱（3.0 mm×150 mm，3.5 μm）、TSKgel Amide-80色譜柱（3.0 mm×150 mm，2 μm） 日本島津有限公司；Sielc ObeliscR色譜柱（4.6 mm×150 mm，5 μm） 美國Sielc科技公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 色譜柱的選擇 不同的親水色譜柱類型對抗病毒藥物組分分離效果不同，本研究參考相關文獻[19-20]，選擇4種色譜柱ZIC HILIC色譜柱（鍵合相為硅膠）、InertSustain Amide色譜柱（鍵合相為酰胺基）、TSKgel Amide-80色譜柱（鍵合相為酰胺基）以及Sielc Obelisc R色譜柱（鍵合相為含電荷的極性和非極性混合基團），比較分離9種抗病毒藥物組分的效果。

1.2.2 儀器條件 質譜條件：采用電噴霧離子源（ESI+源）；多反應監測模式；離子源溫度為200 ℃；脫溶劑氣流量為20 L/min；錐孔氣流量為2.0 L/min。

色譜條件：Sielc Obelisc R色譜柱，流速為0.2 mL/min，柱溫為30 ℃，進樣量為2.0 μL；流動相中A：10 mmol/L乙酸銨溶液（含0.1%甲酸），B：乙腈，梯度洗脫步驟如表1所示。

表 1 流動相梯度洗脫步驟Table 1 Mobile phase gradient elution step

1.2.3 樣品前處理 稱取2.0 g樣品至50 mL離心管中，加入20 mL提取液（20 mmol/L乙酸銨緩沖溶液、20 g/L三氯乙酸溶液，20 g/L偏磷酸-甲醇溶液，1%乙酸-乙腈溶液），使用2000 W功率超聲儀常溫下超聲10 min后離心2 min （5000 r/min），取10 mL上清液進固相小柱（MCX、MAX以及PRiME HLB）進行凈化，固相萃取過程按照上樣、淋洗、洗脫等步驟進行后，收集濾液過0.22 μm濾膜后上機測定。

1.2.4 標準曲線的繪制 稱取適量的9種抗病毒藥物標準品，用甲醇超聲溶解并配制成1000.0 ng/mL的中間儲備液，檢測前以流動相配制成0.1～50.0 ng/mL濃度范圍的標準混合溶液，經儀器進行分析，繪制標準曲線。

1.2.5 樣品檢測及方法的適用性 對10份不同品牌動物源性食品中9種抗病毒藥物組分殘留分別用現行標準方法（SN/T 4253-2015 出口動物組織中抗病毒類藥物殘留量的測定 液相色譜-質譜/質譜法）和本研究方法進行測定，并比較結果，分析方法的適用性。

1.3 數據處理

本試驗數據均重復5次，并利用SPSS 19.0進行方差分析，采用Origin 8.5和TBtools軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 色譜柱的選擇

結果如圖1所示，比較ZIC HILIC柱、TSKgel Amide-80柱、InertSustain Amide柱以及Sielc Obelisc R柱4款親水作用色譜柱發現，ZIC HILIC柱分離9種抗病毒藥物組分的效果不理想，目標組分出峰重疊，分離度較差（圖1a）；而TSKgel Amide-80柱在乙腈-1%甲酸為流動相等度洗脫模式下，可以實現部分抗病毒藥物組分的分離（圖1b）；在InertSustain Amide柱色譜柱上對9種組分的保留效果不好，在前2 min內有6種待測組分基本分離出峰，而阿比多、阿昔洛韋、嗎啉胍由于其極性較大，在此色譜柱上沒有保留，整體分離效果也較差（圖1c）；而Sielc Obelisc R色譜柱由于含電荷的極性和非極性混合基團，所以對9種組分的分離效果較好，出峰時間適宜，各組分也有較好的分離度（圖1d），不同鍵合固定相的色譜柱在分離目標物組分的過程中保留機制迥異，故本研究最終采用Sielc Obelisc R色譜柱。

圖 1 4種色譜柱的分離效果比較Fig.1 Comparison of purification of 4 kinds of chromatographic columns

2.2 質譜參數的選擇

本研究檢測的9種抗病毒藥物組分結構中均含有胺基基團，在離子化過程中易與H離子結合后帶有正電荷，所以在分析時采用正離子掃描模式對9種組分的混標溶液進行母離子和子離子的質譜掃描，并優化質譜參數，具體質譜分析參數見表2。

表 2 9種組分的質譜參數Table 2 Mass spectrometry parameters of nine components

2.3 流動相條件的優化

在流動相的選擇上比較了甲醇-水、乙腈-水、乙腈-10 mmol/L乙酸銨溶液、乙腈-10 mmol/L乙酸銨溶液（含0.05%甲酸）、乙腈-10 mmol/L乙酸銨溶液（含0.1%甲酸）和乙腈-10 mmol/L乙酸銨溶液（含0.2%甲酸）等不同流動相在Sielc Obelisc R親水色譜柱的分離效果。結果發現，流動相中含有一定比例的乙酸銨會維持流動相pH的穩定性，能改善峰形，減少拖尾，洗脫效果最好；并在乙腈-10 mmol/L乙酸銨溶液為流動相的基礎上比較發現，流動相中沒有甲酸存在的情況，9種抗病毒藥物組分的電離效果不理想，出現峰型不對稱性等情況，將流動相中的水更換為甲酸溶液后，流動相體系為酸性，待測組分電離更充分，分離情況得到改善。故又比較了流動相中甲酸溶液濃度分別為0.05%、0.1%和0.2%的情況下，各組分的檢測響應值。通過測定各組分的響應值發現，含0.1%甲酸流動相組成，各組分的響應值最高，因此本研究以乙腈-10 mmol/L乙酸銨溶液（含0.1%甲酸）為流動相，通過適度的梯度洗脫步驟，可以保證各個化合物有良好的峰形、分離度及響應強度，在Sielc Obelisc R親水色譜柱上分離9種抗病毒藥物組分的總離子流（total ion chromatography,TIC）圖見圖2。

圖 2 9種抗病毒藥物組分的TIC圖Fig.2 TIC diagrams of 9 kinds of antiviral drug components

2.4 提取溶劑的選擇

考慮到肉制品、奶制品、蛋制品等動物源性樣品中有大量蛋白和磷脂類物質，實驗所用提取液最好既能沉淀蛋白，又能降低基質效應。參考相關文獻[21-22]，本研究分別比較：提取溶液Ⅰ：20 mmol/L乙酸銨緩沖溶液，提取溶液Ⅱ：20 g/L三氯乙酸溶液（9:1，V/V），提取溶液Ⅲ：20 g/L偏磷酸-甲醇溶液（8:2，V/V），提取溶液Ⅳ：1%乙酸-乙腈溶液，分別添加了50 μg/kg的陽性樣品中的目標組分，比較各目標組分峰面積，分析不同類型的提取溶液對9種組分提取的影響。

由圖3可知，1%乙酸-乙腈的提取效果整體優于其他3種提取溶液，能夠有效提取9種組分，且不同提取溶液間提取效果差異顯著（P＜0.05）。這可能是由于在提取液偏酸性的環境中，目標組分在提取液中的分配系數較高，實現較滿意的提取效果[23]。結合上述流動相中乙腈作為樣液溶劑，為了減少溶劑轉化步驟，因此選擇1%乙酸-乙腈作為該方法的提取液。

圖 3 不同提取溶液對峰面積的影響Fig.3 Effects of different extraction solutions on peak area

2.5 固相萃取柱的選擇

動物源性食品提取液中雜質組分易對目標組分產生干擾[24]，本研究采用固相萃取法進行凈化提取液，比較了HLB、MCX、MAX共3款小柱對提取液的凈化效果，以各組分加標回收的峰面積為比較依據，結果如圖4所示。

圖 4 不同固相小柱對峰面積的影響Fig.4 Effect of different solid phase columns on peak area

由圖4可知，綜合比較來看HLB固相小柱的凈化效果最好，各組分的峰面積最高，與其他兩款固相小柱的效果大部分差異顯著（P＜0.05）。這是因為HLB固相小柱適用范圍廣，特異性不強，適合大多數化合物，而MCX和MAX固相小柱特異性強，對部分待測組分的保留性較差，所以使用HLB小柱回收效果較好[25]。且本研究采用了新型PRiME HLB固相萃取柱，樣品提取液采用通過式凈化方式，省去了活化和洗脫步驟，縮短實驗時間，提高了效率，故選擇PRiME HLB固相小柱。

2.6 方法的線性范圍與靈敏度

將9種抗病毒藥物組分的標準混合溶液以乙腈-10 mmol/L乙酸銨溶液（含0.1%甲酸）為流動相進行梯度洗脫，繪制標準曲線。結果如表3所示，9種組分在線性范圍內均具有較好的線性關系，依據色譜峰的信噪比（S/N）3倍確定檢出限（LOD），信噪比（S/N）的10倍確定定量限（LOQ），得到目標組分的LOD范圍為0.1～0.5 μg/kg，LOQ范圍為0.3～1.5 μg/kg，方法靈敏度高。

表 3 9種組分的回歸方程和決定系數Table 3 Regression equation and determination coefficients of nine kinds components

2.7 方法回收率與精密度

本研究加標回收樣品分別添加相對于9種抗病毒藥物組分定量限的低、中、高的三個水平混合標準品，每個結果測定5次，進行加標回收試驗（表4）。

表 4 方法的回收率及相對標準偏差（n=5）Table 4 Recoveries and relative standard deviations (RSD) of the method (n=5)

由表4可見，9種抗病毒藥物組分的加標回收率為82.3%～95.7%，RSD為3.2%～5.9%，說明本試驗檢測數據的準確度和精密度可靠。

2.8 實際樣品檢測及方法的適用性

在上述優化試驗條件下，對10份不同品牌動物源性食品中9種抗病毒藥物組分殘留進行了分析。檢測結果發現，9種目標物組分含量均未檢出，結果良好，符合國家標準要求。為驗證方法的適用性和可靠性，對陰性樣品進行加標處理后（加標2.0、10.0、50.0 μg/kg），分別用標準方法（SN/T 4253-2015）和本研究的方法進行測定，并比較結果，結果如表5所示。從表5的結果可以看出，本研究的方法所測定的結果與標準方法所能測定的組分結果在合理的誤差范圍內，表明本方法適用于動物源性食品中9種抗病毒藥物組分殘留的測定。

3 結論

本文通過4種HILIC機理色譜柱的比較、流動相的選擇以及樣品前處理條件的優化，建立了一種親水作用色譜-串聯質譜法檢測動物源性食品中9種抗病毒殘留的分析方法。樣品由1%乙酸-乙腈溶液進行提取，并經PRiME HLB固相小柱凈化處理后，可實現對9種待測組分的有效檢測。本方法有效解決了抗病毒組分在反相色譜柱上保留效果不佳、加標回收率低的檢測難點，與目前的國家標準和標準方法相比，在保證準確性好、靈敏度高的同時，盡可能省去了復雜的前處理，降低了檢測成本，提高了檢測目標種類和效率，可為動物源性食品中9種抗病毒藥物殘留的分析和監控提供技術支持。