甘草多糖的抗氧化及降血糖作用研究

王 晴，洪 葉，柳振宇，林長青

（延邊大學，醫學院，吉林延吉 133000）

甘草（Glycyrrhiza uralensisFisch.）又名國老、甜草，為豆科甘草屬多年生草本植物[1]。目前，已經從甘草中分離出大量的生物活性物質，如香豆素類、揮發油類、皂苷類、多糖類等[2]。多糖是一類結構多樣的大分子，由單糖殘基通過糖苷鍵相互連接而成的聚合物[3]。甘草多糖是一種酸性吡喃多糖，內部有小氣泡狀孔洞。研究發現，甘草多糖因其具有抗氧化[4]，調節免疫活性[5]，抗菌[6]，抑制腫瘤生長[7]，抗炎[8]，生物制藥[9]等特性而備受關注。另有研究指出，甘草多糖可以抑制α-葡萄糖苷酶的活性，有助于緩解高血糖[10]。

1型糖尿病（T1DM）的發展受多重因素的影響，其中遺傳和環境因素最為主要[11]，在世界范圍內，患病人數激增，已引起越來越多學者們的重視。T1DM的發病原因主要由于體內胰島素分泌不足，不能將攝入的物質及時分解，使得機體內糖代謝失調，最終導致血糖升高，引發糖尿病。T1DM的發病機制復雜，不僅是單一的異常血糖代謝疾病，更是全身代謝紊亂疾病，它已嚴重影響人們的生活質量。近年來，隨著T1DM患者數量的增加，治療藥物也越來越多。但目前市面上的降糖藥物主要以西藥為主，西藥具有很多的副作用，長期服用會造成內分泌失調，產生較強依賴性，甚至會誘發癌變等[12]，因此更加青睞對藥食兩用的中藥資源在降血糖方面的開發。

但目前有關甘草多糖的報道多集中在甘草多糖的提取工藝以及純化研究[13-14]，對于甘草多糖對降血糖的作用還鮮有報道。實驗擬研究甘草多糖的抗氧化及降血糖作用，旨在開發出更多甘草產品，為臨床治療糖尿病提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

甘草 市售，產自甘肅，2020年9月收獲，規格為二等甘草；6周齡C57BL/6小鼠 雄性，無特定病原體（SPF）級，50只，體重（25±2）g，長春億斯實驗動物中心，合格證書：SCXK（吉）2018-0007。符合《延邊大學實驗動物倫理守則》，獲得延邊大學實驗動物倫理委員會批準；DPPH自由基（DPPH·）清除能力檢測試劑盒、ABTS自由基（ABTS+·）清除能力檢測試劑盒、總膽固醇（Total Cholesterol, TC）、甘油三酯（Triglyceride, TG）、高密度脂蛋白（High-density lipoprotein, HDL-C）、低密度脂蛋白（Low-density lipoprotein, LDL-C）試劑盒 北京索萊寶科技有限公司；鏈脲佐菌素（Streptozotocin, STZ） 99.9%，美國Sigma公司；鹽酸二甲雙胍緩釋片 北京太洋藥業有限公司；超氧化物歧化酶（Super Oxide Dismutase, SOD）活性檢測試劑盒、過氧化氫酶（Catalase,CAT）檢測試劑盒、總谷胱甘肽 （Glutathione, GSH）檢測試劑盒、脂質氧化（Malondialdehyde, MDA）檢測試劑盒 上海碧云天生物技術有限公司。

HH-4型四孔數顯恒溫水浴鍋 江蘇科析儀器有限公司；DHG-9070A型立式鼓風干燥箱 上海一恒科學儀器有限公司；XL-10B型扣壓搖擺式粉碎機

杭州旭眾機械設備有限公司； SuPerMax 3100型多功能酶標儀 上海閃譜生物科技公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 甘草多糖提取及純化 將甘草烘干，粉碎后過40目篩，參照張光輝等[15]的方法并稍作改動，甘草:水比為1:20（g/mL），提取時間3 h，提取溫度80 ℃，浸提兩次，合并提取液，用85%乙醇醇沉24 h，取沉淀，用氯仿-正丁醇除去提取物中蛋白，凍干成粉，4 ℃保存備用。取甘草多糖粗提物，用分子量為3500 Da的透析袋透析24 h，過DEAE-52纖維素柱，分別用水、0.1 mol/L NaCl、0.2 mol/L NaCl進行洗脫，速度為1 mL/min，再過葡聚糖凝膠G-200柱子，用蒸餾水進行洗脫，速度為1 mL/min，旋蒸濃縮，并凍干成為甘草多糖。

1.2.2 甘草多糖的多糖含量測定 采用苯酚硫酸法[16]測定多糖含量，稱取標準葡聚糖10 mg于250 mL容量瓶中，加水至刻度，分別吸取0、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9 mL，各以蒸餾水補至1.0 mL，加入1 mL 6%苯酚，5.0 mL濃硫酸，30 ℃水浴30 min，486 nm測吸光度，以葡聚糖濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標繪制標準曲線。稱取樣品1 mg，溶于1 mL水中，按上述方法進行測定，并根據標準曲線計算多糖含量。

1.2.3 甘草多糖的抗氧化性測定

1.2.3.1 DPPH·清除率的測定 根據王秋丹等[17]方法并稍作改動，稱取5 mg甘草多糖，溶于5 mL蒸餾水中，原液濃度為1000 μg/mL，將原液按梯度稀釋為800、400、200、100、50 μg/mL，以VC作為對照組，樣品組：取不同濃度樣品液1 mL于5 mL離心管中，并加入3 mL DPPH溶液，樣品對照組：樣品液加3 mL甲醇溶液吸光度為Aj，空白對照組：1 mL甲醇溶液加3 mL DPPH溶液吸光度為A0。3500 r/min離心20 min，在517 nm處測吸光度，按公式（1）進行計算。

式中：Ai：樣品組吸光度；Aj：樣品對照組吸光度；A0：空白對照組吸光度。

1.2.3.2 ABTS+·清除率的測定 準確稱取干燥至恒重的ABTS標準品180 mg，加入50 mL蒸餾水，加入33 mg過硫酸鉀，室溫避光放置12～24 h備用。用蒸餾水稀釋并調節至405 nm照射吸光度OD值調節在0.70±0.02范圍內。

樣品溶液的制備：用蒸餾水配制1000、800、400、200、100、50 μg/mL的甘草多糖提取液、VC溶液作對照，取不同濃度樣液30 μL加入配好的ABTS溶液270 μL，酶標儀于405 nm處測定吸光度值Ai，等體積蒸餾水代替ABTS溶液做空白對照組Aj，蒸餾水替代樣品作為對照組A0。每個樣品濃度平行三次實驗，取平均值。ABTS+·清除率按公式（2）進行計算。

式中：Ai為30 μL甘草多糖溶液加入270 μL ABTS溶液于405 nm處的吸光度；Aj為30 μL甘草多糖溶液加入270 μL蒸餾水于405 nm處的吸光度；A0為30 μL蒸餾水加入270 μL ABTS溶液于405 nm處的吸光度。

1.2.4 甘草多糖的降血糖作用研究

1.2.4.1 動物分組及給藥 50只C57BL/6小鼠，分為5組，每組10只，正常組（灌胃蒸餾水200 mg/kg·BW），模型組（灌胃蒸餾水200 mg/kg·BW），甘草多糖低劑量組（甘草多糖200 mg/kg·BW），甘草多糖高劑量組（甘草多糖400 mg/kg·BW），陽性組（二甲雙胍200 mg/kg·BW），劑量設定通過前期預實驗而定。動物適應性喂養1周，除正常組外，其他組別連續5 d腹腔注射STZ（30 mg/kg·BW）建立T1DM模型，每天上午9:00進行灌胃，連續灌胃8周，實驗期間對所有小鼠的體重進行記錄，造模成功后每兩周對小鼠進行隔夜禁食，禁食不禁水，次日采用尾尖取血測定空腹血糖值（FBG）并記錄。

1.2.4.2 小鼠口服糖耐量測定 參照王秋丹等[17]的方法進行口服糖耐量（OGTT）實驗，在實驗最后一天灌胃1 g/kg·BW葡萄糖溶液，分別于灌胃0、30、60、90 min使用尾尖取血測定小鼠血糖值。

1.2.5 小鼠TC、TG、HDL-C、LDL-C測定 實驗結束后，眼球取血，室溫靜置2 h，3000 r/min離心10 min，將離心后的上清液吸至1.5 mL離心管中，即為血清，按試劑盒要求取上血清行各項指標的測定。

1.2.6 小鼠SOD、GSH、CAT、MDA測定 小鼠解剖后，將肝臟取出并稱重，按肝臟：生理鹽水為1:3的比例制備成組織勻漿，并按試劑盒說明書依次加入反應液，測定肝臟組織中SOD、GSH、CAT、MDA活性及含量。

1.3 數據處理

使用SPSS 23.0軟件對數據進行統計學分析和顯著性差異分析，結果以均值±標準偏差表示，P＜0.05表示有顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 甘草多糖的含量

多糖的標準曲線方程為y=10.1741x+0.0237（R2=0.9901），計算出多糖含量為690 mg/g。

2.2 甘草多糖對DPPH·、ABTS+·的清除能力

圖1為甘草多糖在不同濃度下對DPPH·、ABTS+·的清除能力，在50～1000 μg/mL范圍內，甘草多糖對DPPH·、ABTS+·的清除能力呈現劑量依賴性升高，且在1000 μg/mL濃度下達到最高，對二者的清除能力分別為82.84%±0.80%，85.52%±2.27%，但均與VC有極顯著性差異（P＜0.01）。甘草多糖清除DPPH·和ABTS+·的IC50值為162.8 μg/mL和74.3 μg/mL，可見甘草多糖有著良好的抗氧化性。

圖 1 甘草多糖對DPPH·、ABTS+·的清除能力Fig.1 The scavenging capacity of Glycyrrhiza polysaccharide on DPPH·, ABTS+·

2.3 甘草多糖對小鼠體重、FBG的影響

體重減輕以及FBG升高是糖尿病的典型特征[18]。表1為T1DM小鼠體重，在實驗結束時，與正常組相比，模型組小鼠的體重顯著降低（P＜0.05），但經高、低劑量的甘草多糖灌胃后的T1DM小鼠體重下降得到緩解，且高劑量組與低劑量組間無顯著性差異（P＞0.05），高劑量組與陽性組間無顯著性差異（P＞0.05）。表2為T1DM小鼠FBG，經8周的灌胃后，各小鼠的FBG差異顯著（P＜0.05）。與模型組相比，灌胃了甘草多糖的T1DM小鼠的FBG顯著下降（P＜0.05），在第8周時，甘草多糖高劑量組與低劑量組和陽性組間均無顯著性差異（P＞0.05）。這表明，甘草多糖能夠緩解T1DM小鼠體重的下降，并控制其FBG的升高，具有一定的治療糖尿病的潛力。

表 1 T1DM小鼠體重（g）Table 1 Body weight of T1DM rats (g)

表 2 T1DM小鼠空腹血糖值（mmol/L）Table 2 Fasting blood glucose of T1DM rats (mmol/L)

2.4 甘草多糖對T1DM小鼠OGTT的影響

OGTT能夠反映機體對葡萄糖的耐受能力。由圖2所示，在灌胃葡萄糖后，小鼠血糖含量在30 min內急劇升高，在30 min時血糖均達到了最高值，隨后呈現下降趨勢，且高劑量組的糖耐量極顯著優于模型組（P＜0.01）。經甘草多糖灌胃后，可能調節了T1DM小鼠體內對葡萄糖的攝取及利用，從而降低了其FBG水平，提高了機體的OGTT水平。可見，甘草多糖能夠提高T1DM小鼠對葡萄糖的耐受能力。

圖 2 甘草多糖對T1DM小鼠OGTT的影響Fig.2 Effect of Glycyrrhiza polysaccharide on OGTT of T1DM rats

2.5 甘草多糖對小鼠TC、TG、HDL-C、LDL-C的影響

機體中TC、TG、HDL-C、LDL-C能夠反映機體對脂代謝的調控能力。圖3為甘草多糖對T1DM小鼠血脂水平的影響，與正常組相比，模型組中TC、TG、LDL-C水平極顯著升高（P＜0.01），HDL-C水平極顯著降低（P＜0.01），甘草多糖高劑量組TC、TG、HDL-C、LDL-C分別為2.79±0.36、0.98±0.12、1.28±0.23、1.67±0.29 mmol/L，可見經其治療后能夠極顯著降低TC、TG、LDL-C的水平（P＜0.01），極顯著提高HDL-C的水平（P＜0.01）。這可能由于甘草多糖在體內水解吸收后，參與了T1DM小鼠的脂代謝反應，從而改善了異常血脂水平。由此能夠說明甘草多糖具有調節脂代謝的作用。

2.6 甘草多糖對T1DM小鼠氧化指標的影響

在上述實驗中已證明甘草多糖在體外具有良好的抗氧化性，實驗進一步在體內實驗中測定其是否具有調節相關氧化酶的作用。SOD是生物體系中抗氧化酶系的重要組成成員，GSH是機體內廣泛存在的一種重要的過氧化物分解酶，CAT促使過氧化氫分解為分子氧和水，使細胞免于遭受H2O2的毒害，MDA是一種由脂質過氧化反應的產物[19]。圖4為甘草多糖對T1DM小鼠SOD、GSH、CAT、MDA水平的影響，結果顯示，模型組中SOD、GSH、CAT、MDA水平分別為224.3 U/mg、121.5 μmol/g、50.2 U/mg、16.4 nmol/mgprot，與正常組相比均有極顯著性差異（P＜0.01），經甘草多糖高劑量組治療后，SOD、GSH、CAT、MDA水平為425.4±16.37 U·mg-1、169.3±13.28 μmol·g-1、61.6±3.16 U·mg-1、7.5±0.83 nmol/mg prot，與模型組相比有極顯著性差異（P＜0.01），且趨于陽性組。這是由于T1DM小鼠體內不能分泌足夠的胰島素，間接導致體內氧化應激相關酶水平發生顯著變化，經甘草多糖治療后可有效改善這些指標的水平。由此證明，甘草多糖不僅在體外具有抗氧化作用，在體內也具有調節抗氧化酶的作用。由此推測，甘草多糖可能是通過改善T1DM小鼠機體內的氧化應激水平從而起到降血糖作用。

圖 3 甘草多糖對T1DM小鼠TC、TG、HDL-C、LDL-C的影響Fig.3 The effect of Glycyrrhiza polysaccharide on TC, TG,HDL-C, LDL-C in T1DM mice

圖 4 甘草多糖對T1DM小鼠SOD、GSH、CAT、MDA的影響Fig.4 The effect of Glycyrrhiza polysaccharide on SOD、GSH、CAT、MDA in T1DM mice

3 討論與結論

正常情況下，機體氧化還原系統處于動態平衡，當機體處于應激、病理狀態時，會產生·OH、DPPH·等強氧化自由基[20]。植物多糖可通過直接或間接清除自由基，或是提高抗氧化酶活性或降低氧化酶活性起到抗氧化作用。本實驗中，顯示在甘草多糖清除DPPH·和ABTS+·的IC50值分別為162.8 和74.3 μg/mL。可見，甘草多糖在體外具有良好的抗氧化性。

本實驗又進一步研究了其對T1DM小鼠的降血糖作用以及體內抗氧化性。糖尿病的典型癥狀為“三多一少”，對葡萄糖的耐受能力減弱，因此選取體重、FBG以及OGTT作為基礎測定指標，結果顯示，經甘草多糖治療后的T1DM小鼠體重下降緩慢，FBG也明顯下降，OGTT有所提高。胰島素代謝失調會引發血脂異常，體內胰島素的缺乏導致攝入的脂肪等不能被利用，使得機體內脂肪加速分解，脂肪分解所產生的游離脂肪酸（FFA）進入肝臟生成TG和酮體，會間接導致TC、HDL-C、LDL-C發生變化，最終導致體內血脂異常[21-22]。T1DM會導致機體內異常脂代謝情況的發生[23]，其中甘油三酯水平顯著升高為1型糖尿病最為突出的脂代謝紊亂表現[24]。結果顯示，甘草多糖能夠改善T1DM小鼠的異常脂代謝情況。其原因可能是T1DM小鼠對葡萄糖利用失調，脂肪分解增加，從而產生了大量的游離脂肪酸，組織吸收脂肪酸的能力降低，FFA大量釋放到血液和肝臟中[25]，導致TC、TG、LDL-C的含量增多。糖尿病患者機體內氧自由基含量增多，過多的氧自由基與脂質相互作用產生過氧化反應生成MDA。GSH在體內既是重要的抗氧化劑又是自由基清除劑，能夠與體內過多的自由基結合，從而將過多的有害物質清除，排泄出體外[26]。CAT與SOD在機體中具有較強的抗氧化能力，在體內能夠抑制氧自由基的生成，能夠減少氧自由基對細胞造成的傷害，并且能夠降低MDA的生成量[27]。在本試驗中，與正常對照組相比，T1DM小鼠血清的MDA濃度極顯著增加（P＜0.01），而SOD、GSH、CAT濃度極顯著降低（P＜0.01），表明T1DM小鼠出現了氧化應激反應。與正常對照組小鼠相比，甘草多糖治療后能夠顯著抑制這些標志物的變化。

本文結果說明甘草多糖具有良好的抗氧化活性以及降血糖作用，認為其對1型糖尿病的降血糖作用可能是通過改善異常脂代謝以及機體氧化應激從而發揮作用，該研究可為甘草多糖在1型糖尿病的治療方面提供新的思路，后續可對甘草多糖的降血糖機制以及在細胞層面進行深入研究。