微生物混合感染性角膜炎動物模型研究進展

李玉婷，李 妍，王 嵐，胡竹林

references for the further development and research of animal models of the disease.

0引言

微生物角膜炎(microbial keratitis,MK)是細菌、真菌、病毒、寄生蟲或多種感染因子混合感染人或哺乳類動物眼部引起創傷或感染的角膜疾病[1]。MK是單側角膜失明的重要原因之一[2]，在熱帶地區，真菌性角膜炎(fungal keratitis,FK) 約占所有MK的40%[3]，我國FK的致病菌主要為兩種，分別是鐮刀菌屬(25.5%)和曲霉菌屬(10.3%)[4]；而在溫帶地區，細菌性角膜炎(bacterial keratitis,BK)更為常見[5]，致病菌中比例最大的是表皮葡萄球菌占34.5%，其次是肺炎鏈球菌占13%，最后是金黃色葡萄球菌占10.2%等[6]。由兩種以上微生物引起的角膜混合感染相對少見，其可能是合并感染，也可能是繼發于現有微生物的二次感染。最近一份關于角膜感染的報告指出，存在混合感染的現象，細菌和真菌混合感染的比例占1.9%，而細菌和棘阿米巴原蟲的混合感染要更多一些，占比為15.8%[7]。另外，一些病例報告里面，對于不同種的細菌和真菌，分別進行了混合感染的相關介紹，例如表皮葡萄球菌和鐮刀菌屬[8]、真菌和革蘭陽性球菌[9]、假單胞菌和煙曲霉菌[10]等。混合感染性角膜炎引起的角膜炎癥會損害角膜上皮和角膜深層，嚴重時會引起角膜穿孔[11]，進一步導致視力下降，甚至視力喪失，有的患者需要摘除眼球或剜除眼內容物，才能防止病變進一步擴散至全身，因此，及時有效地治療對控制病變的發展十分重要。由于混合感染性角膜炎的病理機制尚不明確，建立動物模型對于探索其發病機制具有重要意義。與此同時，動物模型的建立也有助于該病的預防、診斷和治療等。本文對近年來國內外微生物混合感染性角膜炎動物疾病模型制備方法進行總結。

1實驗動物的選擇

在醫學研究方面，建立動物模型是非常有必要的，可以幫助人類對疾病進行預測、預防，進而提前進行干預、治療，控制疾病的發生發展。因此在研究許多重大疾病的時候，需要建立相應的動物模型，但缺乏合適的動物模型一直是全球各個國家關注并需要攻克的難題，人們也在不斷建立和完善各類疾病動物模型[12]。建立模型的時候，對于動物的挑選，需要根據菌種的相關特征及實驗需求，找到最為合適的實驗動物。

目前研究中使用的動物主要有兔、鼠、猴[13]。與人類的角膜相比，兔角膜要更大一些，易于手術操作，在手術過程中及術后，也可以更細致的觀察到角膜局部的變化，而且兔的結膜是紅色的，其前房出現的纖維蛋白更容易被發現、觀察；同時，可以獲得較多的實驗標本，還可以獲得更多具有實用性的疾病參數，兔子中有兩個國家的品種使用較為廣泛，一個是新西蘭的白兔，一個是荷蘭的帶紋兔[14-15]。但從免疫學觀點看，實驗用兔并不是完全沒有缺點的，存在一定的局限性，它的繁殖發生在較為親近的群體當中，存在組織相容性，由于不是近交系動物，很難確定其免疫遺傳背景[16]，這些都會給實驗造成不確定性和穩定性差。小鼠的角膜與人類相比較小，無論是在手術操作方面，還是在取材方面，都沒有兔眼簡便，而且不利于微生物混合感染大體形態學的觀察。雖然小鼠缺陷很明顯，但也不能忽視它的優勢。因為小鼠不僅具有較多的近交系品系，還具有較多的遠交系品系，特別是近年來廣為人知的轉基因研究，轉基因后獲得的小鼠，可以對一些特殊因子進行針對性分析，同時提供生物制劑，除了BALB/c小鼠外，還有C57BL/6品系小鼠，它們都是實驗中經常用到的品系類型。兩類小鼠進行比較后發現，第一類小鼠更加敏感一些，針對細菌感染的程度更高[17]，實驗上更為常用。猴屬于靈長類動物，猴眼的各層組織結構特別是角膜，與人眼極其相似，實驗人員發現，用猴子造模能更好地模擬疾病的發生發展及轉歸[18]。但是因為猴子價格昂貴，在實際工作中操作不便，不能進行大規模、大批量的實驗，也不能獲得較多的實驗標本，故猴子造模應用較少。近年來，樹鼩(tree shrew)模型越來越得到人們的關注。樹鼩不僅體型小、生殖周期短、壽命短，飼養成本也低，是現代生物醫學研究中最有望替代靈長類動物的一類實驗動物[19]。樹鼩角膜大小適中，角膜各層結構和人類角膜較相似[20]，而且與嚙齒類相比，與人類親緣關系更近[21]，作為造模動物來說，是角膜疾病較為理想的造模動物。但樹鼩研究歷史較短，無特異性抗體，缺乏特異性強的診斷試劑，因此其實驗結果的特異性、可靠性不高，還有待進一步研究。其他還有用豚鼠、貓等動物作為模型。

因為實驗動物大多數為近親交配，這與遠系繁殖的人類就有較大差異。另外根據實驗動物的不同，在解剖上也存在不同的特征，其他還包括組織成分、功能組件的差別，如人的角膜直徑大約為11～12mm，而兔的角膜直徑為13mm，鼠的角膜直徑2.2～3.5mm，樹鼩則為8～9mm[22-23]，四者進行對比，人類的角膜厚度最厚，眨眼間隔時間較短，只有2.8s，但兔子和小鼠的眨眼間隔時間，是人類的10倍不止，達到30s；另外，只有兔子眼表有一層瞬膜，而人類沒有，這會造成眼表觀察時的各種差異[24]。所以，不管動物在某些方面的特征與人類有多么相近，依然不能完全替代人類，實驗造模的時候還是存在差異。選擇好適合的動物類型后，需要先適應性飼養7d左右，使用放大鏡或手電筒檢查動物雙眼是否存在眼疾，進行相關實驗操作的時候，需要給予實驗動物一定的關愛，且不違背動物倫理[25]。

2菌株的選擇

建立混合感染性角膜炎動物模型要根據流行病學調查結果或實驗要求，選擇臨床常見混合感染菌種，以便動物模型能廣泛應用于臨床，促進臨床混合感染性角膜炎的防治進展。

細菌和真菌是角膜混合感染最常見的類型。被報道較多的有葡萄球菌屬、曲霉菌屬及鐮刀菌屬[3, 26-28]。許多疾病中都描述了細菌與真菌之間的相互作用，包括真菌和革蘭氏陽性菌，如戈登鏈球菌和白色念珠菌[29]、金黃色葡萄球菌與新型隱球菌[30]以及金黃色葡萄球菌和煙曲霉[31]。其中，Granillo等[31]在研究中發現，金黃色葡萄球菌在混合生物膜中抑制了煙曲霉的生長。最近一份關于感染性角膜炎的報告指出，在所有3183例病例中，有2.39%的病例為細菌和真菌混合感染[32]。Ahn等[8]進行了一項歷時8a(2000/2007年)的關于細菌和真菌性混合感染角膜炎的回顧性研究，報告稱混合感染最常見的微生物組合是鐮刀菌(fusarium)和表皮葡萄球菌(staphylococcus epidermidis)占39%。革蘭氏陽性菌在細菌中最常見(占細菌培養總數的79%)，其中表皮葡萄球菌占比最大，達到了45%，其次是草綠色鏈球菌(streptococcus viridans)占11%。真菌中，絲狀真菌(filamentous fungi)占主導地位(占所有真菌培養物的 79%)，其中最常見的是鐮刀菌屬占56%，其次是念珠菌種(candida)占12%。結合以往的病例報道發現，臨床上細菌真菌混合感染較為常見，但是在建立FK動物模型時，因為實驗動物普遍對真菌不易感，常常需要對實驗動物進行免疫抑制，而免疫抑制會加重細菌的感染，因此免疫抑制可能會對建立細菌真菌混合感染動物模型產生一定影響。

實驗結果除了具有真實可靠性以外，還需要具備可重復性，進行動物模型制作時，盡可能選用權威微生物種保存機構(如American Tissue Culture Collection，ATCC；中國科學院微生物研究所等)保存的標準菌株，最好選用臨床混合感染性角膜炎患者的分離標本。

3操作方法

3.1菌液配制在實驗開始前24h或48h，將菌種接種于營養瓊脂斜面進行活化，細菌菌株如化膿性鏈球菌，接種于血瓊脂培養基[33]，如果是大腸埃希菌，接種于中國藍培養基[34]，37℃下恒溫培養1～2d；真菌菌株一般接種于沙保氏培養基(sabouraud dextrosee agar，SDA)或馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基(potato extrose agar，PDA)30℃溫度或室溫條件下培養72h；挑取生長良好的菌落振蕩培養，配制微生物混懸液。細菌濃度大多數情況下為1×108～1×1010CFU/mL[35]；關于真菌菌液濃度，國內外報道的結果不一，濃度從106～1010CFU/mL不等[36-38]。Wu等[39]利用鼠制作真菌感染模型的過程中發現，角膜上皮損傷后，真菌接種至少需要102CFU/mL才能引起角膜感染；隨著菌液濃度的增加，角膜的感染成功率提高，而一次接種達到106CFU/mL就足以使所有角膜感染真菌。

菌液配制并不是統一的標準，需要根據微生物的具體功能進行調節，例如對肺炎鏈球菌進行培養時，選擇羊血瓊脂培養基，還要加入5% CO2[40]。不同菌種間毒力、致病性有所區別，且存在相互拮抗抑制的可能，混合感染時不同菌液的濃度選擇對實驗的成功至關重要。

3.2微生物接種方法

3.2.1角膜表面劃痕法二十世紀七十年代初期，Gerke等[41]首次提出用角膜表面劃痕法通過小鼠制作綠膿桿菌模型，此方法一經推出，就獲得了眾多學者的支持和嘗試。該方法在不劃破基質侵入前房的前提下，使用無菌25～30G注射針頭在角膜表面劃出長度為1mm左右的3～5道平行的傷口，選擇吸液管將菌液(一般為5μL)接種于小鼠的角膜表面[42-43]。此方法優點：易于操作，感染需要的時間較短，同時對于病原微生物和角膜傷口而言，可以促進它們之間的相互作用；缺點：感染率偏低。另外菌液流動性較好，較早滴加的菌液可快速彌散于受損角膜，可能對后滴加的菌種造成影響，降低后者的侵襲性。因此，此方法需進行改進，例如進一步明確所接種病原微生物的種類以及固定或麻醉實驗動物的時間，以增加病原微生物的感染率。

3.2.2基質內注射法到了二十世紀七十年代中后期，Kupferman等[44]提出了角膜基質內注射模型。用微量注射器定量抽取適量(一般為5μL)的菌液，選擇角膜近中心處進針，針尖進入至角膜實質層下1/3，形成白色菌斑，直徑范圍在5～6mm。優點：該方法操作方便，具有良好的重復性。對于感染具有難度的菌株，例如真菌感染，也能起到相應的效果，具有較高的感染率；缺點：此方法的感染過程在一定程度上破壞了實驗動物角膜的正常結構，與人角膜自然感染過程存在較大差異，所以此法更多是用來判斷角膜炎藥物療效和探究診斷方法。

3.2.3角膜接觸鏡法隨著配戴隱形眼鏡的人數不斷增多，角膜接觸鏡引發的角膜感染也越來越常見，學者們結合角膜表面劃痕法，提出了角膜接觸鏡法。即對于實驗動物的角膜直徑進行標記，使用角膜環鉆，將上皮去除，戴上角膜接觸鏡，并滴入適量菌液，或在培養基上將角膜接觸鏡與適當濃度(多為108CFU/mL)菌液一同培養24h，溫度保持在30℃，然后戴在損傷角膜表面。縫閉眼瞼，完成接種后的48h，再拆除縫線，用裂隙燈進行觀察。有關研究表明，低氧性損傷是發生感染的前提，隱形眼鏡相關角膜感染最有可能是由于低氧透接觸鏡導致的[45]。所以，在建立模型的時候，如果想將角膜感染率提高，可以通過建立缺氧模型來實現。此方法的優勢為：將病原微生物感染角膜的過程盡可能地進行了模擬和還原，不僅提高了感染率，還能對發病過程及機制進行研究；缺陷則是操作具有一定的難度，需要更多的時間，對于實驗動物的麻醉時間及實驗操作人員，有比較嚴格的要求。

3.2.4“微口袋”法為了建立混合感染模型，Ponce-Angulo等[46]采用了一種稱為“微口袋”的新技術，他們使用的方法是在接種金黃色葡萄球菌及鐮刀菌前，預先用環磷酰胺和甲基強的松龍聯合處理實驗用小鼠(分別于接種前5、3、1d肌內注射80mg/kg甲基強的松龍及150mg/kg環磷酰胺)，制造出免疫低下的動物模型。每個微口袋的長度為2mm，用針頭在角鞏膜緣制造一個病變，操作時要小心謹慎，以免角膜穿孔和改變眼睛的內部結構，將細菌和真菌細胞以相同濃度1×105CFU/mL同時接種到角膜組織中，閉合動物瞼裂幾秒鐘，保證角膜里面菌液的分布是均勻的。針刺的程度不一，會造成不同程度的創傷，傷及角膜基質可能會影響混合感染的自然病程，不同個體間的感染病變也可能因為創傷程度不同而變化，使動物模型的穩定性不佳，此法還有待進一步的研究。

4感染成功后的鑒定方法

造模后需要對實驗動物進行診斷及鑒定診斷，看角膜是否有微生物感染，是單一菌種感染還是混合感染；同時還需要鑒定感染病原菌，確定是哪種病原微生物導致的感染。

4.1病原學培養檢測對于感染性角膜炎來說，微生物學是主要診斷方法，臨床上常用的基本診斷工具依次有：涂片、培養和敏感性測定，是檢測角膜感染的“金標準”[47]。主要目的是對真菌、細菌及阿米巴原蟲進行分離、培養及鑒定。不同菌種檢測操作方法如下：(1)馬鈴薯葡萄糖斜面培養基的真菌培養：標本接種后，待菌落生長，利用膠帶法和小培養法，對真菌種屬進行鑒定。(2)血平板、巧克力平板的細菌培養：標本接種于兩種平板后，放在營養肉湯中，等待細菌增長，任意兩種培養基培養陽性后，分離出單個菌落，然后鑒定出細菌的種類。(3)阿米巴培養：標本接種后，添加50μL大腸桿菌菌液共同培養，利用斜面鏡觀察，找到阿米巴滋養體或者包囊為陽性。

平板培養的優點:可選擇混合感染的菌種適宜的平板,刮取角膜組織進行平板培養后，可在平板上觀察到不同的微生物生長，是較為直觀的鑒別方法，同時可進一步分離純化菌種進行鑒定。但由于混合感染的病原菌生長周期各不相同，如細菌真菌混合感染，細菌生長相對較快，真菌生長相對緩慢，培養時長增加等因素，會影響平板培養的陽性檢出率。

4.2角膜涂片染色細胞學檢查首先，取材部位為動物模型角膜病灶處，及時涂片，使用甲醇原液進行固定，時間一般為60～120s，然后用稀釋吉姆薩染液染色后直接鏡檢，經濟快捷、可反復操作、準確率高，并可鏡下直接檢測有無真菌或細菌感染，協助早期確定診斷，目前是我國快速診斷感染性角膜炎的主要檢測技術[48]。除了以上染色方法，還可以選擇熒光染液對真菌進行熒光染色檢測，在熒光顯微鏡下可以觀察到真菌的長絲狀藍色或者藍紫色高亮熒光[49]。

該法方便快捷，可以迅速對感染性角膜炎做出診斷；但當取材部位不準確或有所遺漏時，涂片也會呈假陰性結果。因此，需要掌握正確的取材方法，注意刮取不同的角膜病灶處，進行染色、鏡檢、觀察。

4.3角膜激光共焦顯微鏡檢查麻醉或處死動物后，將激光掃描攝像頭的位置調節好，使激光光束位于角膜病變區域。利用非連續手動掃描模式，對病灶區進行掃描。優點是可以對感染性角膜炎的病原體影像如真菌菌絲，阿米巴包囊、空囊、滋養體，快速進行診斷[50]。但是共焦顯微鏡屬于形態學檢測[51]，大部分感染性角膜炎在共聚焦顯微鏡下的主要特征是出現炎癥細胞，因此若是細菌混合感染，或真菌、阿米巴感染癥狀不典型，則無法區分。

4.416SrRNA基因序列分析法提取病原菌的DNA，采用通過引物經PCR擴增16S rRNA基因片段，然后對擴增片段進行測序。此方法特異性高，可以用于感染性角膜炎檢測尤其是不清楚感染病原菌及排除其他病原菌同時感染的情況[52]。

但是混合感染若不進行純化，擴增時不同菌種的引物不同，可能會導致擴增失敗或導致鑒定錯誤。同一菌種采用通用引物進行擴增，結果出現雙峰，對鑒定結果也會產生影響。為了避免鑒定失敗，可先將菌種平板培養后分離純化，再進行測序，或進行高通量測序。

5小結

綜上所述，微生物混合感染性角膜炎逐漸增多，嚴重威脅著人類的眼部健康，必須給予重視。為了更好地研究人類微生物混合感染性角膜炎的發病機制，就需要掌握一系列感染成功率高、疾病發生發展過程與人角膜混合感染的過程相似、一致性強的動物模型制作的方法。但目前存在較多的問題和困難，需要進一步的嘗試和克服，以保證動物實驗研究的成果客觀、可信、可重復，能夠為探索該病的發病機制和指導臨床提供重要的基礎，降低其致盲率，為感染性眼科疾病做出巨大貢獻，并讓研究能夠更進一步。