生長因子與增生性玻璃體視網膜病變相關性的研究進展

王資懿，吳靈丹，陳 潔，徐柒華

0引言

增生性玻璃體視網膜病變(proliferative vitreoretinopathy，PVR)是指視網脫離復位術及玻璃體切除術后視網膜表面及玻璃體后廣泛纖維增殖膜收縮、牽拉而引起的再次視網膜脫離，是眼球穿通傷及玻璃體切除術后的主要并發(fā)癥，已成為致盲的主要原因之一。目前PVR的發(fā)病機制尚未完全闡明。視網膜色素上皮(RPE)細胞的上皮-間質轉化(EMT)、增殖、遷移受到廣泛關注，近年來大量研究顯示生長因子及其受體在RPE細胞的EMT過程以及PVR發(fā)展的增生期發(fā)揮重要作用[1-2]。本文將對近年來促PVR發(fā)展的生長因子的研究結果作一綜述，為進一步研究PVR的防治提供新思路。

1 PVR與生長因子

PVR的特征是RPE細胞進行EMT后遷移、增殖與分泌的細胞外基質形成具有收縮能力的纖維膜，最終牽拉視網膜造成視網膜脫離[3]。在PVR的發(fā)展過程中，有五個步驟是非常重要的，分別是血-視網膜屏障的破壞、細胞遷移、細胞增殖、細胞外基質重塑的膜形成和增生膜的收縮[4]。根據這五個步驟，可以大致將PVR病程可分為三個階段，即炎癥期、增生期及瘢痕期[5]。其中增生期是RPE細胞及成纖維細胞在多種細胞因子(生長因子、白細胞介素及黏附分子等)調控下遷移和增殖的過程。

近年來有研究表明，RPE細胞具有自分泌細胞因子的能力，許多生長因子在PVR患者的玻璃體或者視網膜下液中過度表達，這種環(huán)境有利于細胞的存活、轉分化、遷移、增殖和細胞外基質的形成[4]。在此基礎上提出了炎癥介質假說，假說認為這些生長因子的異常表達驅動PVR，并最終導致視網膜上膜的形成及其隨后的收縮[6-8]。目前研究已經發(fā)現的與PVR發(fā)病有關的細胞因子包括血小板衍生生長因子(PDGF)、血管內皮生長因子(VEGF)、轉化生長因子-β(TGF-β)、表皮生長因子(EGF)及成纖維細胞生長因子(FGF)等[1,9]。正常情況下，這些生長因子相互協(xié)調共同維持細胞的穩(wěn)態(tài)，但當血-視網膜屏障被破壞，這種平衡即被打破，RPE細胞受到生長因子的刺激發(fā)生EMT、遷移及增殖等過程。

2 PVR與PDGF

2.1PDGF促進PVR發(fā)生發(fā)展的機制眼外傷及視網膜裂孔后,眼內血-視網膜屏障被破壞，PDGF從血小板α顆粒釋放出來,啟動并加速組織創(chuàng)傷修復,誘導受損的上皮細胞與內皮細胞分裂增殖，促進血管的形成與再生，部分RPE細胞在PDGF的刺激下向成纖維細胞和肌成纖維細胞轉化即發(fā)生EMT過程，轉化后的RPE細胞可分泌細胞外基質成分與增殖的細胞形成纖維膜，隨后α平滑肌肌動蛋白(α-SMA)介導細胞外基質成分的收縮[10]，最終增殖膜的收縮引起牽拉性的視網膜脫離。因此PDGF及其對應的受體(PDGFR)促進PVR增生膜的發(fā)生發(fā)展以及增殖膜收縮所引起的視網膜脫離。

2.2PVR患者中PDGF/PDGFR的表達增多Cui等[11]和Robbins等[12]證實PVR增生膜中PDGF和PDGFR的表達水平均顯著增高，即PDGF和PDGFR可以通過RPE和神經膠質細胞分泌，隨后的研究表明PVR患者玻璃體腔及血清中PDGF的水平也顯著升高[13]。動物實驗發(fā)現，對照組玻璃體中無法檢測到PDGF，而在模型兔的玻璃體中觀察到PDGF，尤其是PDGF-C的過表達，此外，PDGFR-α可觸發(fā)PVR形成的關鍵步驟，而PDGF-C可以激活PDGFR-α和PDGFR-αβ，因此PDGF-C及其受體PDGFR-α被認為在PVR的形成中起著更為重要的作用[14]。研究人員發(fā)現，即使PDGF在PVR的增生期過表達，但PDGFR-α仍然介入了PVR收縮期增殖膜的收縮運動[15]。在動物模型中，缺乏PDGFR基因的動物具有較低的PVR發(fā)展?jié)摿Γ^表達PDGFR基因，大大增加了PVR的發(fā)展?jié)摿6]，因此PVR的發(fā)生主要取決于PDGF受體的活化程度，而不是PDGF的濃度[2]。PEGFR-α也可由EGF、FGF、胰島素和HGF等非PDGF分子激活，非PDGF試劑能間接激活PDGFR-α是其他生長因子也能促進PVR發(fā)生發(fā)展的最重要方法[16-17]。PDGFR通過組裝成二聚體來防止PDGFR-α的間接激活，而二聚體卻被非PDGF激活，進而激活PDGFR-α[18]。

2.3抗PDGF治療AG1295是特異性的PDGF受體酪氨酸激酶阻斷劑，研究發(fā)現，AG1295主要通過選擇性抑制PDGF-β受體的酪氨酸激酶磷酸化及其下游的信號傳導通路，阻斷PVR的發(fā)展,并且無明顯的細胞毒性，但它的治療作用僅表現在PVR的早期，一旦增殖膜形成，AG1295并不能拮抗其收縮[19]。與AG1295不同，AG1296針對PDGF-α受體，在PVR的增生期及收縮期均可產生抑制效果，這與PDGF-α受體調控收縮期信號傳導有關[20]。目前RNA干擾技術在視網膜增殖性疾病的基因治療方面已獲得了較好的進展，通過研究證實PDGFR-α mRNA抑制劑可抑制人視網膜色素上皮細胞增生，對實驗性PVR形成有抑制作用[21]，為PVR的治療提供了新的方向。

3 PVR與VEGF

3.1VEGF促進PVR發(fā)生發(fā)展的機制當PVR發(fā)生時，眼內細胞增生及增殖膜新生血管形成過程中VEGF起著重要作用，VEGF與其受體(VEGFR)結合引起RPE細胞與神經膠質細胞的移行，分裂和增殖[22]。許多臨床研究和動物實驗中發(fā)現，PDGFR-α是導致PVR發(fā)生的重要介質，而VEGF在間接激活PDGFR-α途徑起重要作用。VEGF可以間接激活PDGFR-α，從而競爭性阻斷PDGF依賴性結合，進而繞過PDGF介導的受體下調，增加病變的持久性[23]，同時PDGFR-α在細胞表面存留時間延長，增加了非PDGFs激活PDGFR-α的機會，這一過程會促進EGF、FGF、IGF-1和其自身受體結合，介導下游信號通路產生氧自由基以間接激活PDGFR，從而導致RPE等多種細胞的增殖[24]。實驗發(fā)現，玻璃體內TP53蛋白的抑制反應是介導PVR發(fā)生所必需的，TP53含量的下降可以降低細胞凋亡和衰老的速度，加速增殖和收縮進程。與直接激活PDGFR-α的細胞中TP53少量下降相比，由VEGF間接激活的PDGFR-α的細胞中TP53的水平急劇下降，加速了PVR發(fā)展進程[25]。由于VEGF可以促進表達VEGFR細胞的活力，因此，VEGF介導的間接激活PDGFR-α途徑可能不是VEGF促進PVR發(fā)展的唯一途徑。研究發(fā)現，通過VEGF經典途徑，即對VEGFR的激活，對PVR發(fā)展的貢獻很小，即大多數VEGF通過激活PDGFR-α而不是VEGFR，來促進玻璃體內細胞活動的發(fā)生[18]。

3.2PVR患者中VEGF/VEGFR的表達增多PVR患者眼內液中VEGF含量不僅增高，而且與其發(fā)展變化的程度密切相關，在PVR患者的視網膜前膜及前房液中發(fā)現VEGFR的存在[13，18]。研究表明[26]，VEGF-A在PVR患者眼中表達升高，并且發(fā)現VEGF-A可以促進PVR患者和兔的玻璃體的生物活性。Ni等[13]研究發(fā)現PVR患者血清及玻璃體中VEGF水平較正常人升高。

3.3抗VEGF治療雷珠單抗是一種VEGF單克隆抗體,可以抑制多個VEGF亞型。研究發(fā)現，開放性眼外傷后注射雷珠單抗可以顯著降低玻璃體內VEGF含量，也能進一步減少間接激活PDGFR的途徑、增加PDGFR的直接激活，進一步降低PDGF的含量，從而在早期起到對PVR的抑制作用[24,27]。康柏西普是一種新一代抗VEGF融合蛋白，可以降低VEGF濃度抑制病理性血管生成，在年齡相關性黃斑變性的治療中也取得了一定進展[10]，研究發(fā)現，在行玻璃體切除術治療PVR時，聯合使用康柏西普可以降低術后復發(fā)率[28]。用阿柏西普和抗VEGF藥物可在多種疾病模型中安全有效地保護兔眼免受PVR侵害[18]。玻璃體腔注射抗VEGF藥物后，抑制了VEGF促進細胞增殖和新生血管生成的功能，改善了視網膜各層細胞排列。但有研究發(fā)現[29]，因為PVR是一種多細胞因子參與的復雜的增生性玻璃體視網膜病變，因此應用抗VEGF藥物并不能有效的降低玻璃體腔內TGF-β的濃度，反而可能刺激其增高。進而可以考慮聯合應用抗VEGF藥物以及TGF-β抑制劑降低外傷后玻璃體腔相關細胞因子的含量和抑制RPE細胞的EMT過程。

4 PVR與TGF-β

4.1TGF-β促進PVR發(fā)生發(fā)展的機制在PVR患眼中，RPE細胞發(fā)生增殖、遷移及EMT，在此過程中RPE細胞逐漸失去上皮細胞的表型特征，而獲得間充質細胞形態(tài)，這個過程是PVR發(fā)展的核心。研究發(fā)現，在培養(yǎng)的ARPE-19細胞中加入TGF-β2，細胞形態(tài)轉變?yōu)樗笮危尸F間充質細胞形態(tài)，并且隨 TGF-β2 濃度的增加形態(tài)改變更加明顯[30]，因此研究人員指出PVR進展與RPE細胞中TGF-β誘導的EMT有關[31-33]，其主要途徑有：(1)TGF-β2促進N-Cadherin分子的表達上調，該分子是一種Ca2+依賴的細胞黏著糖蛋白，對于生長發(fā)育過程中細胞的選擇性聚集具有至關重要的作用，主要介導同型細胞間的黏附。研究表明在一定濃度范圍內TGF-β2以劑量依賴的方式誘導N-Cadherin蛋白及mRNA的表達上調[30，34]。(2)TGF-β2與熱休克蛋白47(HSP47)的協(xié)同作用促進EMT過程的發(fā)生。HSP47是膠原蛋白特異性分子伴侶，其表達增加有助于細胞外基質的累積。研究證實，HSP47表達的增加促進了TGF-β2介導的ARPE-19細胞EMT進程以及細胞外基質的積累，因此加速了視網膜前膜(PRM)的形成[34]。(3)TGF-β2通過調節(jié)miRNA的含量來調控EMT過程。miRNAs在細胞的分化、增殖、代謝和凋亡等方面發(fā)揮重要作用。在TGF-β2介導的EMT過程中，據報道共有304個miRNA發(fā)生了變化，其中119個上調，185個下調，這提示miRNA可能與RPE細胞中的EMT相關。其中，miRNA-29b的表達下調超過80%[35]，Cao[35]觀察證實，TGF-β2不僅可以在RPE細胞中誘導EMT，而且對miRNA-29b的表達具有雙向作用，在低濃度(0～5μg/L)TGF-β2誘導時miRNA-29b含量下調，且表現出時間依賴性，在高濃度TGF-β2誘導時miRNA-29b含量上調[30]。(4)TGF-β2通過抑制Na+-K+-ATP酶β1亞基的表達來調控RPE細胞的EMT和纖維化過程。TGF-β2信號激活后，發(fā)現誘導EMT過程的生物標志物過表達，如纖連蛋白，α-SMA壓力和肌動蛋白纖維，而β1亞基低表達，β1亞基表達的減少可能有助于間充質細胞形態(tài)和EMT生物標志物的誘導，這表明Na+-K+-ATP酶β1亞基的缺乏可能是RPE細胞中TGF-β2介導EMT的潛在誘因[36]。(5)TGF-β1通過激活轉化生長因子β激活激酶1(TAK1)來調控PVR進程。TAK1是有絲分裂原激活蛋白(MAP)激酶家族的一員，參與了TGF-β信號轉導的非典型途徑，TAK1是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，被TGF-β1迅速激活，隨后激活其他MAP激酶，如p38等[36]。研究發(fā)現被激活的TAK1還可以通過作用于Smad7的表達來調節(jié)TGF-β誘導的Smad信號激活[37]，因此激活的TAK1不僅可以調節(jié)TGF-β1的非典型級聯的激活，而且調節(jié)典型級聯的Smad2/3激活。綜上所述，TGF-β與TAK1之間是相互作用的，兩者形成正反饋，協(xié)同促進PVR持續(xù)發(fā)展[38]。除了促進RPE細胞的上皮-間質轉化過程，TGF-β還可以促進細胞外基質的合成，形成增殖膜的細胞間質成分，此外其在增殖膜的收縮運動中也發(fā)揮了不可忽視的作用[39]。

4.2PVR患者中TGF-β的表達增多在臨床患者及實驗動物模型中，玻璃體內TGF-β2的表達水平與PVR的嚴重程度呈正相關。Hoerster等[40]報道了在PVR的兔模型中，房水和玻璃體中的TGF-β1和TGF-β2表達水平升高。另外，Kon等[41]觀察到人類玻璃體PVR樣品中TGF-β2明顯升高，TGF-β被認為在PVR膜的形成和收縮中起著至關重要的作用。此外，Dvashi等[38]表明TGF-β1通過TAK1的激活在RPE的EMT中起關鍵作用。由于PVR中TGF-β的異常表達以及TGF-β抑制劑預防纖維化反應的功效，因此認為TGF-β可能與PVR的發(fā)展有關，并建議將TGF-β作為候選靶標用于PVR治療。但是，該假設仍需要在更精確的系統(tǒng)中得到驗證[8]。

4.3抗TGF-β治療Rojas等[42]強調Smad7與PVR的發(fā)展有關，被認為是治療PVR的新靶標。TGF-β抑制劑Smad7的上調可抑制RPE細胞的纖維化過程,吡非尼酮通過阻斷人類PRE細胞ARPE-19中Smads的核易位而抑制了TGF-β1誘導的纖維化[43]。Cinar等[44]發(fā)現，依帕替林可通過下調TGF-β2誘導的轉錄因子Twist、Snail和ZEB1的表達，明顯抑制TGF-β2誘導的細胞遷移，并可通過調節(jié)細胞周期和促進凋亡，抑制TGF-β2誘導的RPE細胞增殖，從而抑制RPE細胞的增殖和EMT進程，Fuchs等[22]發(fā)現，多種miRNAs可抑制TGF-β2信號通路，其中miR-302d和miR-93可以抑制TGF-β誘導的ARPE-19細胞EMT轉變和VEGFA的分泌，miRNA-29b同樣可能成為臨床治療PVR的新途徑[35]。在體外，TGF-β2促進EMT進程、膠原蛋白的產生和細胞的纖維化，核心蛋白聚糖拮抗TGF-β并具有獨立的抗纖維化特性，因此，核心蛋白聚糖作為抗纖維化劑，可能是抑制由TGF-β2誘導的RPE纖維化的有效候選藥物[45]。

5 PVR與EGF

5.1EGF促進PVR發(fā)生發(fā)展的機制EGF是一種由53個氨基酸殘基組成的耐熱單鏈低分子多肽,其受體(EGFR)是一種廣泛分布于人體各組織細胞膜上的多功能糖蛋白，屬于受體酪氨酸激酶。EGF與EGFR結合后，催化一系列生化反應，促進靶細胞的DNA合成及有絲分裂。Chen等[46]發(fā)現，EGF通過磷酸化EGFR和降低總EGFR水平來促進ARPE-19細胞的活力和增殖，PVR疾病進程中的氧化應激可通過降低EGFR信號通路影響RPE細胞活力，這些結果顯示，EGF誘導的EGFR信號通路可能在PVR疾病中發(fā)揮重要作用。此外，EGF還被發(fā)現通過激活下游信號級聯調控細胞骨架重構、影響整合素表達和誘導上皮-間充質轉化來縮短體外培養(yǎng)的RPE細胞的劃痕愈合時間[47]。

5.2PVR患者中EGF/EGFR的表達增多研究發(fā)現，PVR患者玻璃體腔和視網膜下液中EGF的基因和蛋白表達顯著增強[9]。EGFR在PVR膜早期也有高表達[48]，提示EGF/EGFR可能參與了PVR增殖膜的形成。

5.3抗EGF治療EGF被廣泛應用于EMT體外模型的建立上，Ren等[49]在兔RPE細胞培養(yǎng)過程中加入姜黃素干預，發(fā)現姜黃素下調RPE細胞中EGF的表達，并顯示出時間效應和劑量效應關系，在動物實驗中發(fā)現，與對照組相比，姜黃素組玻璃體混濁更低，增殖膜更薄，PVR等級和視網膜脫離發(fā)生率更低，因此他們認為，姜黃素通過下調EGF抑制RPE細胞增殖，從而有效抑制PVR的起始和疾病的發(fā)展。Yang等[50]發(fā)現，褪黑素通過激活AKT/mTOR通路抑制了EGF誘導的ARPE-19細胞的增殖和遷移。研究發(fā)現，荷花堿通過p38 MAPK以及PI3K/AKT通路抑制EGF介導的RPE細胞的EMT進程[51]。

6 PVR與其他生長因子

FGF是一種促進內皮細胞遷移和平滑肌細胞增殖的細胞因子，能夠促進新血管的形成，修復損害的內皮細胞。薛曉輝[52]研究發(fā)現，在原發(fā)性和外傷性PVR中bFGF的含量均高于對照組，且其水平與病變程度呈正相關。在外傷性PVR中bFGF的表達含量高于原發(fā)性PVR，表明其表達對外傷性刺激更為敏感，主要引導外傷后引發(fā)的病變。外傷后炎癥反應刺激視網膜玻璃體，巨噬細胞等免疫細胞的表達引起堿性成纖維細胞因子活化，進而促使相關細胞因子大量增殖，刺激PRE細胞遷移、增殖，產生視網膜前膜。Lumi等[53]發(fā)現在PVR患者血液中FGF2核苷酸的含量明顯增多，他們認為具有成纖維細胞表型特征的巨噬細胞通過產生的FGF2介導纖維化，FGF2促進了RPE細胞的增殖和EMT進程。

結締組織生長因子(CTGF)對成纖維細胞具有趨化及促有絲分裂作用，隨后發(fā)現按不同的細胞類型，CTGF還具有促細胞增殖、遷移及分化等作用。研究發(fā)現，CTGF可能通過PI3K/AKT信號通路促進PVR中EMT進程和ECM的合成[54]。Daftarian等[55]發(fā)現CTGF由RPE細胞釋放，可在增殖膜中檢測到。玻璃體內注射CTGF中和抗體導致PVR模型增殖膜厚度、膠原纖維和肌成纖維細胞密度的減少，因此CTGF抑制可能是PVR的潛在治療靶點。

7總結與展望

綜上所述，PVR的發(fā)病機制極為復雜，具體機制仍不十分明確。多種生長因子在PVR的發(fā)生及發(fā)展過程中發(fā)揮著重要的作用。PVR的研究盡管已經取得了一些進展，但是PVR的治療與預防仍是臨床上的難題，手術治療仍是目前唯一有效的治療方法，手術可以去除增生的PRM，但是不能抑制細胞增殖，導致治療后的復發(fā)率高。研究PVR的形成機制和研制有效的替代治療是目前亟待解決的問題。本文通過對PVR發(fā)生發(fā)展中的生長因子及拮抗生長因子治療PVR的進展進行綜述，以期為PVR的發(fā)生機制及治療與預防提供新思路。