清熱退黃灌腸方對新生兒黃疸代謝標志物的影響及其作用機制*

馬圓圓，顏佳佳，阮為勇△，步偉全，蘇 婕

(1.南京中醫藥大學附屬中西醫結合醫院，江蘇 南京 210028；2.江蘇省宿遷市中醫院，江蘇 宿遷 223800)

新生兒黃疸是新生兒時期的常見癥狀，是因為膽紅素代謝異常引起血中膽紅素水平升高而導致皮膚、鞏膜及黏膜黃染。新生兒黃疸《活幼新書》中稱為“胎黃”、在《諸病源候論》中述為“胎疸”，其病機多為濕熱郁蒸，臨床上經過系統辨證后，論治用清熱利濕退黃，包括中藥或中成藥口服[1-2]，如茵梔黃口服液、茵陳蒿湯加減；灌腸[3]的中藥湯劑如茵陳蒿湯或各專家自擬湯劑；泡浴[4-5]、辨證推拿[6]、推拿四法[7]、新生兒撫觸[8]等。多篇已發表的文獻已經論證，中藥灌腸、泡浴等中醫外治法直接跳過了新生兒服藥困難的問題，安全、毒副作用較小，在此病的治療中得到廣泛的應用[9]。既往已有多名學者已經證實了灌腸方法對新生兒黃疸的療效確切，且本院也在清熱退黃灌腸方治療新生兒黃疸(濕熱郁蒸證)療效做過相關研究[10]、發表過相關論文[11]，在有效結論的基礎上，旨在采用代謝組學的方法，篩選出治療前后血漿差異代謝物，探究灌腸法可能的作用機制。且前期本課題組已用同樣的實驗方法，對比黃疸兒與健康新生兒2組間血漿代謝物的差異，初步闡釋了新生兒黃疸(濕熱郁蒸證)的代謝方面的紊亂，為本試驗打下了基礎。

1 資料與方法

1.1 資料

1.1.1 病例來源 本課題入組的20例新生兒是因病理性黃疸在本院NICU住院治療的足月兒，病例收集時間為：2020年05月至2021年1月。中醫診斷標準參照汪受傳，虞堅爾主編的《中醫兒科學》[12]中“胎黃”濕熱郁蒸證。西醫診斷標準參照《實用新生兒學》[13]中新生兒病理性黃疸章節。隨機將20例患兒分為治療組、對照組各10例，其一般資料無統計學差異。本試驗經過醫院倫理委員會批準者(批件號：2019LWKYZ004)，患兒家長知情同意并簽署同意書。

1.1.2 治療方法 對照組：根據病情所需，間斷藍光治療(浙江戴維醫療器械有限公司藍光治療箱)；雙歧桿菌乳桿菌三聯活菌片(0.5 g po tid，內蒙古雙奇藥業)、魯米那片(5 mg/kg·d，po tid，上海醫藥有限公司信宜制藥)。治療組：對照組治療的基礎上，予以本試驗的清熱退黃方灌腸。灌腸方草藥來自本院中藥房，成分具體如下：茵陳蒿9 g，大黃1 g，梔子5 g，雞內金8 g，黃柏3 g，茯苓5 g，丹參6 g，在本院制劑室煎熬至40 mL左右，待溫度降至37～40 ℃。新生兒先行清潔灌腸，繼而予5 mL/kg的灌腸方每日1次，連續使用5 d。

1.1.3 樣本采集 2組患兒均在治療前后分別采集血樣送檢，采全血2 mL于抗凝管內，進行血漿分離：3000 rpm室溫離心10 min，取上層樣本0.2 mL，裝在1.5 mL容量的離心管中。-80 ℃冷凍保存備用。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗步驟

1.2.1.1 代謝物的提取 ①取0.1 mL冷凍保存的樣本置于eppendorf管中，加入0.4 mL的80%甲醇水溶液。②離心。③取少許上清加質譜級水稀釋至甲醇含量為53%。④重復1次離心，收集上清，進樣 LC-MS 進行分析。⑤從每個實驗樣本中取等量液體混勻作為QC樣本。

1.2.1.2 色譜分析 色譜柱：HypesilGoldcolumn(C18)；Column temperature：40 ℃；flow rate：0.2 mL/min；正模式：流動相A：0.1%甲酸，負模式：pH9.0，流動相A：5 mM醋酸銨；流動相B均為：甲醇。

表1 色譜梯度洗脫程序

1.2.1.3 質譜方法 掃描范圍選擇 m/z 100～1500；ESI源的設置如下：電噴霧電壓：3.2 kV；鞘氣流速：40 arb；輔助氣流速：10 arb；Capillary Temp：320 ℃；極性：正或負；MS/MS二級掃描為data-dependent scans.

1.2.2 數據處理與分析 對質譜分析原數據進行歸一化處理、基線濾波、峰識別對齊、積分、保留時間校正，獲得所需的保留時間、質荷比、峰強的數據矩陣。因為每種標志物在液相色譜、質譜條件下均有其表現形式，故和大數據庫、標準品進行比對后，最終確定生物標志物。采用歸一化數據矩陣進行分析：主成分分析PCS、正交偏最小二乘判別法OPLS-DA分析。后者則將多變量、單變量兩種方法相結合，篩選出差異代謝物。結合HMDB、KEGG等數據庫再篩選一次，后對差異代謝物進行KEGG通路富集分析，研究對比2組治療后、治療組治療前后差異代謝物參與的最主要生化代謝通路和信號轉導通路，開展通路功能的研究。

2 結果

2.1 治療組差異代謝物篩選 進行OPLS-DA建模后，對模型中VIP≥1 且 T-testP<0.05進行差異代謝物篩選，數據歸一化后進行聚類分析，再結合人類代謝組學數據庫、京都基因和基因組百科全書進一步匹配注釋獲得代謝物準確信息，共篩選出差異代謝物17種。與治療前所有樣本相比，治療組治療后α-酮戊二酸等11種代謝物上調，肌酸酐等6種代謝物下調，見表2。

表2 治療組治療后與所有樣本治療前差異代謝物

2.2 治療組治療前后差異代謝物代謝通路分析 將所找到的差異代謝物通過KEGG通路富集，且超幾何檢驗P值小于0.05，共找到6種可能的代謝通路，為三羧酸循環、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝、氨基糖和核苷酸糖代謝、賴氨酸生物合成、D-谷氨酰胺和D-谷氨酸代謝、膽堿能突觸。

2.3 治療后治療組與對照組差異代謝物篩選 通過同樣的方法，治療后治療組與對照組共篩選出差異代謝物15種。與對照組相比，治療組中N-乙酰-L-天冬氨酸等10種代謝物上調，肌酸酐等5種代謝物下調，見表3。

表3 治療后治療組與對照組差異代謝物

2.4 治療后對照組與治療組對比代謝通路分析 用同樣的方法，共找到3條可能的代謝通路，為D-谷氨酰胺和D-谷氨酸代謝、膽堿能突觸丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝。

2.5 結果分析 治療組治療前后篩選出差異的代謝物17種，主要涉及氨基酸代謝、能量代謝等。代謝通路有6種，涉及的代謝物α-酮戊二酸、1-甲基組氨酸、膽堿等含量均較治療前上調。治療后治療組與對照組篩選出差異代謝物15種，同樣為涉及氨基酸代謝、能量代謝。代謝通路有3種，涉及的差異代謝物α-酮戊二酸、L-谷氨酸、膽堿等含量均為上調。說明中藥灌腸聯合西醫治療新生兒黃疸能夠促進氨基酸及能量合成、調節膽堿能通路，對黃疸患兒所發生的代謝紊亂起到調節作用。推測其因，可能與中藥灌腸藥調整患兒胃腸功能有聯系，使對其氨基酸等營養物質的吸收能力增強有關[14]。此外，膽堿能通路具有刺激胃腸蠕動功能[15]，可使患兒納乳增加，增加能量轉化來源，從而增強抗病能力。

3 討論

目前對于新生兒黃疸中醫治療方案眾多，常用的口服有茵梔黃口服液、清熱利濕祛黃類的中藥湯劑，外治法有中藥洗浴、中藥灌腸、推拿、穴位按摩等，均取得了一定的療效，相關療效類研究及文章較多。但對于中醫藥治療新生兒黃疸的代謝組學研究、中醫藥的治療機制，文章及相關成果卻較為稀少。代謝組學是一個目前研究較少的領域，它能測定多種小分子的濃度，并且適用于幾乎所有的生物基質，例如血液、腦脊液、尿液和組織。由于測定的是各種生理和病理過程的代謝最終產物，故代謝組學有可能提供基因組學、轉錄組學或蛋白質組學等領域無法收集到的信息。代謝組學可實現從微觀角度對清熱退黃灌腸方治療新生兒黃疸(濕熱郁蒸證)作用機制進行解析，為中醫藥治療新生兒黃疸研究提供借鑒，也可以為新生兒黃疸的辨證、治療等提供新的技術，值得推廣和應用。但本研究病例收集的樣本量有限，個體差異造成的影響暫不能排除，仍需進一步大樣本的驗證。同時，其他容易獲得的標本如尿液，也可以用本試驗的方法，對比尿液治療前后代謝組學的差異，對比尿液治療組與對照組代謝組學的差異，來驗證血漿代謝組學所得到的結論是否正確，本課題組也將對尿液代謝組學進行進一步研究，以期對新生兒黃疸(濕熱郁蒸證)的代謝組學的研究更加的完善、準確。