拓撲異構酶Ⅱα蛋白在青年女性乳腺癌中的表達及其預后的關系*

林鳳村，李藝江，林延宗，黃建麗

(1.福建醫科大學附屬漳州市醫院腫瘤放療科，福建 漳州 363000；2.廈門大學附屬第一醫院普通外科，福建 廈門 361000)

世界衛生組織下屬的國際癌癥研究機構(IARC)發布的《2020全球癌癥報告》顯示，乳腺癌一躍成為全球第一大癌，并且呈年輕化趨勢。第15屆St.Gallen國際乳腺癌大會提出根據乳腺癌患者的臨床病理特征和分子分型，對個體治療方案進行相應的“增和減”，從而最大限度避免治療不足或治療過度，實現“量體裁衣”的個體化治療，從而提高乳腺癌的治療效果[1]。目前，中國女性乳腺癌的發病率呈顯著上升且日益年輕化的趨勢，加強對乳腺癌分子水平研究，尋找預后分子至關重要[2]。DNA拓撲異構酶Ⅱα(TopoⅡα)在DNA的復制、重組和轉錄等過程中發揮重要作用。既往研究證實，TopoⅡα與乳腺癌患者對蒽環類藥物的反應性有關，其蛋白高表達的患者對蒽環類藥物更敏感，療效更好[3]。然而，在蒽環類藥物廣泛使用的背景下，TopoⅡα對青年乳腺癌患者的預后影響尚存爭議。國內外相關臨床研究十分有限，并且缺乏長期隨訪報道。因此，本研究納入50例<35歲的青年乳腺癌患者，檢測其癌組織中TopoⅡα蛋白的表達，通過10余年的長期隨訪，分析其與患者無病生存期(DFS)、總生存期(OS)之間的關系，為預測青年乳腺癌患者的預后提供參考。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2004年8月至2009年1月福建醫科大學附屬漳州市醫院診治的青年(<35歲)乳腺癌患者共131例。納入標準：(1)經2位高年資病理科醫師分別閱片后確診為原發性乳腺癌；(2)施行過根治手術，包括乳腺癌根治術和改良根治術；(3)完整的術后病理資料，免疫組織化學檢測項目包括激素受體(HR)、雌激素受體(ER)、孕激素受體(PR)、人表皮生長因子受體2(HER-2)、增殖細胞核抗原Ki67、TopoⅡα蛋白；(4)術前未行放化療及內分泌治療；(5)術后符合2017版NCCN指南要求進行輔助化療6～8 周期，具體化療方案以蒽環為主或聯合紫杉醇的方案(包括AC，EC，TAC，AC-T等)，無法耐受蒽環類的心臟毒性者選用不含蒽環類的聯合化療方案(包括TC，CMF等)。排除標準:(1)確診時即已發生遠處轉移；(2)局部復發病例、雙側乳腺癌、病理結果為DCIS；(3)失訪病例；(4)術后未符合2017版NCCN指南的要求進行輔助化療。

經篩選，最終納入50例患者進行研究，患者中位年齡32歲。其中，浸潤性導管癌31例，浸潤性小葉癌9例，單純癌5例，髓樣癌3例，黏液癌2例。腫瘤分期方面，I期患者8例，Ⅱ期患者26例，Ⅲ期患者 16例。收集的臨床病理資料包括腫瘤大小(T分期)、淋巴結轉移(N分期)、TNM分期、HR、ER、PR、HER-2、Ki67和分子分型。主要研究終點為DFS，定義為確診日期起至復發轉移或由于疾病進展導致患者死亡的時間間隔；次要研究終點為OS，定義為確診日期起至死亡或末次隨訪時間(2020年11月19日)；中位隨訪時間為159個月(131～195個月)。本研究已獲得醫院倫理委員會批準。

1.2免疫組織化學檢測

1.2.1HR、ER、PR、HER-2表達及分子分型的判斷標準 (1)HR、ER、PR表達：以ER或PR表達 < 10%為(-)，≥ 10%為(+)[4]，ER或PR其中一個陽性，即為HR陽性；(2)HER-2表達：由于大部分患者未進行Fish檢測，故定義HER-2 +或-為HER-2表達(-)，HER-2呈2+和3+為HER-2表達(+)[5]；(3)Ki67表達：≤ 14%定義為低表達，> 14%定義為高表達[6]；(4)分子分型：根據St Gallen共識分為luminal A、luminal B、HER-2過表達和三陰性乳腺癌。

1.2.2TopoⅡα蛋白測定 將所有標本固定于甲醛中，以石蠟包埋，連續切片并脫蠟水化，PBS液洗滌。置于緩沖液中，持續加熱，冷卻后用抗原修復。用PBS液沖洗后滴加稀釋的一抗，并采用PBS代替一抗作為陰性對照，相同條件下已知陽性切片作陽性對照。PBS液洗滌后滴加二抗并孵育。棄去PBS液，滴加新鮮配制的 DAB 顯色液，進行閱片。TopoⅡα單克隆抗體購自福州邁新生物技術開發公司。結果判定：TopoⅡα蛋白位于細胞核上，呈黃棕色顆粒狀。隨機計數視野中500個癌細胞，統計陽性細胞的百分數。定義著色癌細胞 < 25%為低表達，≥ 25%為高表達[7-8]。

1.2.3隨訪 50例患者均經密切隨訪，無失訪病例。2年內每間隔3個月隨訪1次，之后每間隔6個月隨訪1次。隨訪方式包括調取來診記錄、影像材料和電話隨訪等。末次隨訪日期為2020年11月19日。

1.3統計學處理 應用SPSS22.0統計軟件進行數據分析，采用χ2檢驗(Pearson法、連續性校正法及Fisher確切概率法)分析TopoⅡα蛋白表達與臨床病理特征的關系，相關性分析采用Spearman分析法。采用Kaplan-Meier法繪制患者生存曲線，用log-rank檢驗分析各亞組之間生存率的差異。多因素分析采用Cox比例風險回歸模型。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1TopoⅡα蛋白在青年女性乳腺癌組織中的表達 50例患者中，42例患者TopoⅡα蛋白表達呈陽性，其中I期8例，Ⅱ期20例，Ⅲ 期14例；浸潤性導管癌25例，浸潤性小葉癌9例，單純癌4例，髓樣癌3例，黏液癌1例。

2.2TopoⅡα蛋白表達與臨床病理特征的關系 TopoⅡα蛋白表達僅與增殖細胞核抗原Ki67呈正相關(r=0.533，P=0.002)，與患者腫瘤大小(T分期)、淋巴結轉移、TNM分期、分子分型、ER、PR、HER-2均無關(P>0.05)，見表1。

表1 TopoⅡα蛋白表達與青年女性乳腺癌患者臨床病理特征的關系

續表1 TopoⅡα蛋白表達與青年女性乳腺癌患者臨床病理特征的關系

2.3復發和轉移情況 隨訪至2020年11月19日，50例患者中有23例發生復發、轉移，轉移部位依次為骨、肺、肝、腦。其中淋巴結轉移情況、HR狀態、ER、PR、分子分型、TNM分期和TopoⅡα蛋白表達均與DFS有關(P=0.014，P=0.002，P=0.001，P=0.020，P=0.001，P=0.026，P=0.003)，見表2，即TopoⅡα蛋白陽性、無淋巴結轉移、ER或PR陽性、病理類型為luminal A型、I/Ⅱ期患者的DFS較長。

表2 青年女性乳腺癌患者DFS的單因素分析

2.4TopoⅡα蛋白表達與DFS和OS的關系 TopoⅡα蛋白表達與患者的DFS顯著相關(χ2=9.105，P=0.003)，見圖1。TopoⅡα蛋白陽性者與陰性者相比DFS更優，其1、3、5、10年DFS分別為95.2%：87.5%、76.2%：37.5%、66.7%：12.5%、64.3%：12.5%，差異有統計學意義(χ2=9.105；P=0.003)。見表2。

圖1 青年女性乳腺癌患者TopoⅡα蛋白表達的無病生存曲線

2.5TopoⅡα蛋白陽性者與陰性者比較 TopoⅡα蛋白陽性者與陰性者1、3、5、10年OS分別為97.6%：100%、81.0%：62.5%、73.8%：50.0%、73.8%：50.0%，差異均無統計學意義(χ2=1.652,P=0.199)。見圖2、表3。

圖2 青年女性乳腺癌患者TopoⅡα蛋白表達的總生存曲線

表3 青年女性乳腺癌患者OS的單因素分析

續表3 青年女性乳腺癌患者OS的單因素分析

2.6多因素Cox比例風險回歸模型分析 將單因素生存分析中影響DFS(P<0.05)的因素(淋巴結轉移、激素受體、分子分型、TNM分期、TopoⅡα蛋白表達)納入多因素COX回歸模型進一步分析，結果表明：TopoⅡα蛋白陰性、HR陰性、TNM分期較晚(Ⅲ期)是影響青年乳腺癌患者DFS的獨立危險因素[風險比(HR)=0.272,95%CI:0.110～0.674,P=0.005；HR=0.225,95%CI:0.090～0.567,P=0.002；HR=3.027,95%CI:1.280～7.157,P=0.012]。見表4。

表4 青年女性乳腺癌患者DFS的多因素分析

2.7青年女性乳腺癌患者OS的多因素分析 將單因素中影響OS(P<0.05)的因素(淋巴結轉移、HR、分子分型、TNM分期)納入多因素COX回歸模型進一步分析，結果表明：淋巴結轉移、HR陰性、TNM分期較晚(Ⅲ期)是影響OS的獨立危險因素 (HR=5.531,95%CI:1.149～26.620,P=0.033；HR=0.135,95%CI:0.042～0.431,P=0.001；HR=4.856,95%CI:1.596～14.771,P=0.005)。見表5。

表5 青年女性乳腺癌患者OS的多因素分析

3 討 論

乳腺癌已經成為全球發病人數最多的惡性腫瘤，在中國惡性腫瘤中發病率與病死率均位居前列[9]。20世紀70年代以來，蒽環類藥物在乳腺癌化療領域展現出的優勢已受到學者們的重視，時至今日仍作為乳腺癌經典化療方案的重要組成部分。但隨著研究的深入，乳腺癌分子層面的差異對蒽環類化療效果的影響越來越受關注[10]。其中，不得不提的就是TopoⅡα蛋白。它是一種存在于細胞核內，可調節DNA空間變化的關鍵酶，其通過改變核酸上磷酸骨架的構象，使得DNA雙螺旋中的1條或2條鏈暫時斷裂，從而完成了超螺旋狀態與解旋狀態之間的相互轉換[11]。蒽環類藥物插入TopoⅡα與DNA 結合處，干擾DNA斷端的重新連接，使其無法修復，達到抑制腫瘤細胞分裂增殖的作用。TopoⅡα蛋白表達缺失常常引起蒽環類藥物耐藥，而高表達者則對蒽環類藥物敏感[12]。

謝閔等[13]報道，TopoⅡ在三陰性乳腺癌中陽性率高達91.30%，而在非三陰性乳腺癌中陽性率為71.40%。李梅芳等[14]研究發現，青年組乳腺癌患者的TopoⅡα蛋白表達較中年組和老年組患者高，青年乳腺癌患者(≤ 40歲)、中年組(42～64歲)和老年組(≥ 65 歲)的TopoⅡα蛋白陽性率分別為51.6%、36.9%和33.7%。李鐵靈等[15]則報道了在青年乳腺癌(<40歲)患者中，TopoⅡα蛋白陽性表達率為45.2%。縱觀以上幾項研究結果，受檢測儀器、觀察人員、陽性界值、實驗操作流程等因素的影響，TopoⅡα蛋白表達率存在一定的差異。在本研究中，TopoⅡα蛋白陽性表達率高達84.0%。相較中老年患者而言，青年患者TopoⅡα蛋白呈高表達趨勢[16]，這可能與TopoⅡα蛋白大多表達于細胞增殖分裂期，而青年患者癌細胞增殖迅速有關。Ki-67亦與細胞增殖密切相關，被認為是一種能有效評估腫瘤細胞增殖活性的重要分子[17]。國外研究發現，TopoⅡα蛋白表達與Ki-67顯著相關，TopoⅡα蛋白表達增高的腫瘤更具增殖潛能[18-20]。況麗平等[21]認為，乳腺癌患者的TopoⅡα蛋白和 Ki-67在乳腺癌的發生、發展中具有相互協同的作用，可作為判斷乳腺癌預后的重要指標。本研究中，TopoⅡα蛋白與Ki-67表達呈顯著正相關，進一步證實了兩者之間的聯系。乳腺癌患者，尤其是癌細胞增殖更加旺盛的青年患者中，TopoⅡα蛋白與Ki-67共同反映細胞增殖活躍程度。因此，對TopoⅡα蛋白高表達患者進行術后輔助化療，殺滅更多處于增殖期的腫瘤細胞，使其快速進入G0期，理論上能達到更好的腫瘤控制。此外，筆者認為青年女性乳腺癌患者TopoⅡα蛋白表達與其他臨床病理特征(腫瘤大小、TNM分期、激素狀態、淋巴結轉移等)并不相關，這與國內王云翔等[12]的報道一致，預示著TopoⅡα蛋白并未通過產生不良的腫瘤生物學行為從而影響患者預后。

本研究發現,HR陰性、TNM分期較晚的青年乳腺癌患者更容易發生復發和轉移，這一現象在所有年齡段患者中普遍存在。而TopoⅡα蛋白表達對青年患者復發、轉移的影響具有其特殊性：一方面，TopoⅡα蛋白高表達的青年患者細胞增殖旺盛，理論上更容易發生腫瘤的復發和轉移；另一方面，高表達TopoⅡα蛋白的乳腺癌組織對蒽環類化療藥具有更高的反應性，可取得更好的化療效果。綜合來看，在蒽環類化療藥物廣泛應用的背景下，TopoⅡα蛋白的表達對乳腺癌患者的復發、轉移到底產生怎樣的影響，目前仍存在爭議。中山大學腫瘤中心一項最新研究發現：在434例luminal型早期乳腺癌患者中，TopoⅡα蛋白過表達患者無遠處轉移生存期縮短，進一步亞組分析表明缺少輔助化療是TopoⅡα蛋白過表達者預后變差的危險因素之一[4]。NIELSEN等[22]研究了在接受蒽環類化療的乳腺癌患者中，TopoⅡα基因過表達患者復發率、病死率明顯下降，而表達缺失患者預后不良；SCHINDLBECK等[23]則通過免疫組織化學檢測乳腺癌患者(118例均接受EC、EC-CMF、FAC/FEC等含蒽環類方案化療)TopoⅡα蛋白的表達，中位隨訪42個月，結果提示TopoⅡα蛋白表達陽性者的OS比陰性者長(P=0.033)；還有部分學者認為TopoⅡα蛋白表達與預后的關系和乳腺癌分子分型有關，即在HER-2過表達型乳腺癌中，TopoⅡα蛋白陽性組較陰性組5年DFS和OS均明顯延長；而在三陰性乳腺癌中，結果恰恰相反，TopoⅡα蛋白陽性組5年DFS率低于陰性組(P=0.044)[12]。在涉及青年乳腺癌患者的研究中，李鐵靈等[15]報道：62例年齡<40歲乳腺癌患者在輔助蒽環類化療下，其TopoⅡα表達陽性者OS和DFS均長于 TopoⅡα陰性者，研究者認為蒽環類化療藥物的使用，可以改善TopoⅡa陽性青年乳腺癌患者的生存。一項針對256例浸潤性乳腺癌患者的研究則顯示，TopoⅡα高表達患者雖然OS和DFS有所縮短，但與低表達者相比，差異無統計學意義[24]。本研究長期隨訪(中位隨訪期達159個月)結果表明，TopoⅡα陽性表達的青年乳腺癌患者，其DFS較陰性者明顯延長。同時，多因素分析也提示TopoⅡα表達是影響DFS的獨立預后因素。因而，對腫瘤細胞增生活躍的青年乳腺癌患者，術后使用蒽環類化療，可以在一定程度上降低TopoⅡα蛋白陽性患者的局部復發率，延長DFS，提高患者的生活質量。而在OS方面，TopoⅡα蛋白表達的高低對患者的OS沒有產生影響，意味著TopoⅡα蛋白表達狀態不影響青年乳腺癌患者的遠期預后，這也與SHEEN-CHEN等[25]的結論相符。他們對94例乳腺癌患者進行研究后，發現TopoⅡα蛋白表達與患者5年生存率無關，無法成為乳腺癌OS的預測因素。筆者認為，影響OS的主要因素還是取決于腫瘤的臨床病理狀態。淋巴結有轉移、HR陰性、TNM分期較晚的患者OS大大縮短，這些均是影響患者預后的獨立危險因素，而TopoⅡα蛋白表達與這些因素未顯示出相關性。因此，它對OS的影響也就十分有限。

在乳腺癌治療中，TopoⅡα蛋白表達能否影響乳腺癌的預后一直存在爭議，并且針對青年乳腺癌患者這一特殊群體，TopoⅡα表達的研究數據也十分有限。本研究嚴格篩選了50例年齡<35歲的青年女性乳腺癌患者，通過免疫組織化學進行TopoⅡα蛋白的檢測，經過長達10余年的隨訪，得出結論：TopoⅡα高表達的青年乳腺癌患者有更長的DFS，而OS不受其表達高低的影響。揭示了TopoⅡα蛋白在青年女性乳腺癌患者行蒽環類化療時的重要預測作用，能夠更好地指導臨床用藥，從而造福更多的青年患者。本研究同樣存在一定的不足，例如：樣本量較少；未檢測基因擴增及mRNA表達；未對HER-2進行FISH檢測，研究結果有待于大樣本前瞻性實驗的進一步證實。相信對TopoⅡα的深入研究，將會為青年乳腺癌患者的個體化治療開辟新的途徑并帶來新的希望。