MALDI-TOF MS快速鑒定耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的應(yīng)用研究

曹云松 王亞萍 徐 陽 郭 普 汪華學(xué)

耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(Methicillin-resistant toStaphylococcusaureus，MRSA)是院內(nèi)感染的主要病原菌之一。1961年Jevons等[1]在英國首次發(fā)現(xiàn)MRSA至今，其感染率和檢出率逐年上升，波及全球。由于抗生素種類日益增多及不合理使用，導(dǎo)致院內(nèi)感染的MRSA常具有多重耐藥性和高致病性，臨床治療較為困難，MRSA已成為感染醫(yī)學(xué)中最受關(guān)注的問題之一[2-3]。因此對于重癥感染患者，快速、準確的檢出MRSA有助于合理選擇抗菌藥物、提高患者的生存率和控制院內(nèi)病原菌的傳播。傳統(tǒng)的表型鑒定耐藥菌的方法一般檢測周期較長，不能實現(xiàn)耐藥菌快速、自動化檢測的需要。以16S rRNA基因測序為代表的分子生物學(xué)鑒定方法具有較高的準確性和穩(wěn)定性，但由于其成本及技術(shù)要求，很難在實驗室之外廣泛應(yīng)用[4]。基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜(matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS)技術(shù)在臨床病原微生物鑒定方面已經(jīng)非常成熟，通過直接分析微生物的核糖體蛋白即可確定種屬，具有準確、高效、高通量等優(yōu)點[5-7]。近年來，MALDI-TOF MS 在耐藥菌檢測中的應(yīng)用逐漸增多,如MALDI-TOF MS用于檢測β-內(nèi)酰胺酶的腸桿菌科細菌[8]、鑒定耐碳青霉烯類抗生素的腸桿菌科細菌[9]，Giordano等[10]利用該技術(shù)對耐多粘菌素的肺炎克雷伯菌進行檢測。本研究應(yīng)用VITEK MS SARAMIS系統(tǒng)，通過分析MRSA與MSSA特征峰上的差異，分別建立MRSA與MSSA的SuperSpectra，并對新建數(shù)據(jù)庫進行驗證，明確MALDI-TOF MS技術(shù)能否實現(xiàn)對MRSA和MSSA的快速鑒別。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 標本及菌株來源 2020年7月至2021年9月在蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院微生物室收集患者送檢標本中分離出的金黃色葡萄球菌285株(相同患者同一部位的重復(fù)菌株取首次分離菌株)。臨床送檢標本中痰液75例(26.3%)、分泌物92例(32.2%)、膿液61例(21.4%)、全血32例(11.2%)、其他25例(8.7%)。儀器質(zhì)控菌株：大腸埃希菌ATCC 8739；質(zhì)控標準菌株：ATCC 43300(MRSA)、ATCC 29213(MSSA)，由國家衛(wèi)生健康委臨床檢驗中心提供。

1.1.2 主要儀器及試劑 頭孢西丁(Cefoxitin, FOX)藥敏紙片：英國 Oxoid 公司；VITEK MS質(zhì)譜儀、靶板、CHCA基質(zhì)液、VITEK Densichek 比濁儀：法國生物梅里埃公司；哥倫比亞血瓊脂平板、MH瓊脂平板：合肥天達試劑公司；DNA Marker DL2000、Taq masterMix：北京天根生化科技有限公司；PCR擴增儀和凝膠成像儀：美國Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1 菌株分離培養(yǎng)與種屬鑒定 嚴格按照《全國臨床檢驗操作規(guī)程》第4版操作要求，將收集的菌株接種于哥倫比亞血瓊脂平板，培養(yǎng)時間均為18～24 h，傳代分離至單個菌落。按照質(zhì)譜儀操作流程采用直接涂布法進行鑒定，用1 μL接種環(huán)挑取血平板上的單一菌落，均勻涂布在靶板上，并記錄點樣位置及對應(yīng)的菌株編號，最后挑取大腸埃希菌ATCC 8739菌落，均勻涂抹于校準孔位上，然后分別加1 μL CHCA基質(zhì)液，等待基質(zhì)液完全干燥后將靶板放入質(zhì)譜儀中進行檢測，選擇MALDI-TOF MS RUO模式，獲取菌株蛋白指紋圖譜，并與SARAMIS數(shù)據(jù)庫中的圖譜進行比對，以可信度百分比作為圖譜一致性的判斷標準，可信度百分比高于75%表示鑒定結(jié)果準確。

1.2.2 耐藥菌株初篩 采用頭孢西丁(30 μg)紙片擴散法對285株SA進行藥敏試驗，用游標卡尺測量SA對藥敏紙片的抑菌環(huán)直徑(以肉眼看不到抑菌環(huán)的邊緣有細菌明顯生長為標準)，結(jié)果按2021版CLSI M100 31th藥敏標準執(zhí)行，抑菌環(huán)直徑≤21 mm為耐藥菌株，≥22 mm為敏感菌株。

1.2.3 PCR檢測 采用煮沸法提取285株SA的基因組DNA，用作PCR反應(yīng)擴增的模板，參照研究[11]委托上海生物工程有限公司合成特異引物(引物序列mecA-F:5’-ACGAGTAGATGCTCAATATAA-3’；mecA-R:5’-CTTAGTTCTTTAGCGATTGC-3’)，對SA耐藥基因mecA進行檢測，PCR反應(yīng)體系(25 μL)：PCR Mixture 12.5 μL、上下游引物各1 μL、模板DNA 1 μL、超純水補足至25 μL，提取后的基因組DNA進行耐藥菌株擴增，PCR擴增陽性產(chǎn)物送至上海生物工程有限公司進行基因測序，所得結(jié)果上傳至GenBank數(shù)據(jù)庫進行比對分析。

1.2.4 SuperSpectra的構(gòu)建及驗證 利用VITEK MS SARAMIS軟件建立SuperSpectra，選擇60～70株MRSA圖譜(采用甲酸萃取法獲得圖譜)，選擇所有菌株共有的39～41個峰，峰的數(shù)量在80～230之間，和SARAMIS數(shù)據(jù)庫進行比對，分析MRSA特征圖譜重合率和特征峰質(zhì)荷比，創(chuàng)建得到MRSA SuperSpectra并激活用于鑒定。采用同樣的方法建立MSSA SuperSpectra并激活。選擇建庫以外的SA菌株，應(yīng)用新建的MRSA和MSSA SuperSpectra進行驗證，并與PCR結(jié)果進行比較，評價VITEK MS對MRSA和MSSA的鑒定價值。

2 結(jié)果

2.1 菌株鑒定及紙片擴散法結(jié)果 本實驗收集285株臨床菌株，經(jīng)VITEK MS質(zhì)譜儀確認均為SA，對所有菌株進行頭孢西丁藥敏紙片篩選，根據(jù)CLSI標準，其中153株為MRSA，頭孢西丁抑菌圈直徑 6～19 mm；132株為MSSA，頭孢西丁抑菌圈直徑 23～32 mm。

2.2 PCR結(jié)果 對285株金黃色葡萄球菌進行mecA基因擴增，結(jié)果提示結(jié)果153株MRSA均攜帶mecA基因，132株為MSSA均未攜帶mecA基因，部分電泳圖結(jié)果見圖1。

注：M為DNA Marker；-為陰性對照;+為陽性對照；1～8為菌株編號。

2.3 SuperSpectra結(jié)果 在153株MRSA菌株中選取65株，并加入ATCC 43300，共66株MRSA建立 SuperSpectra，特征峰納入標準：菌株分類值均>70%，最終保留40個MRSA的特征峰以保證每種質(zhì)量峰至少是80%的圖譜所共有，通過VITEK MS SARAMIS軟件對保留的特征峰與數(shù)據(jù)庫圖譜比較，確定波峰的權(quán)重值，得到MRSA SuperSpectra。在132株MSSA菌株中選取60株，并加入ATCC 29213，共61株MSSA，同樣的方法得到 MSSA SuperSpectra。設(shè)置誤差范圍error值<0.05，MRSA和MSSA SuperSpectra的特征圖譜重合率70%，其中MRSA的主要特征峰為3 036.0、3 875.3 Da，MSSA特有的峰為5 054.0 Da，這3個峰可以作為區(qū)別MRSA和MSSA 的主要特征峰。MRSA和MSSA的特征峰比較見圖2。

圖2 MRSA(藍色峰)和 MSSA(紅色峰) SuperSpectra 比較

2.4 菌株驗證結(jié)果 選擇建庫外的160株SA驗證新建MRSA和MSSA SuperSpectra 的鑒定準確率，結(jié)果顯示在表1中，經(jīng)PCR確認的88株MRSA中，VITEK MS鑒定正確率為89.8%(79/88)，5株被誤判為MSSA，4株未獲得結(jié)果；經(jīng)PCR確認的72株MSSA中，VITEK MS鑒定正確率為87.5%(63/72)，6株被誤判為MRSA，3株未獲得結(jié)果。見表1。

表1 PCR法與VITEK MS鑒定結(jié)果比較(株)

3 討論

重癥監(jiān)護病房(intensive care unit，ICU)是MRSA感染的高發(fā)科室，收治的危重患者由于基礎(chǔ)疾病多、免疫功能低下，重癥感染的發(fā)生率較高，往往需要長時間、大劑量廣譜抗生素治療，易導(dǎo)致病原菌耐藥性不斷增加[12,13]。本實驗共收集我院285株金黃色葡萄球菌菌株，篩選出153株MRSA，檢出率為53.7%(153/285)，分離率高于2020年全國細菌耐藥監(jiān)測結(jié)果31%[14]，但與郭普等[15]對本院的細菌耐藥監(jiān)測結(jié)果相似，2017年我院臨床分離的金黃色葡萄球菌中MRSA為54.7%。目前，臨床上治療MRSA的藥物極其有限，僅有萬古霉素、利奈唑胺、替考拉寧等少數(shù)抗菌藥物，而其首劑使用的時機和效果則有賴于耐藥菌的早期鑒定。因此，早期精準識別MRSA并分析其流行病學(xué)信息，可以有效控制院內(nèi)感染的暴發(fā)流行，對預(yù)防和治療MRSA引起的重癥感染有重要作用。

MALDI-TOF MS技術(shù)通過微生物蛋白質(zhì)指紋圖譜來進行耐藥菌的鑒定，由于多重耐藥的革蘭陰性桿菌的耐藥機制較為復(fù)雜，往往伴隨著細胞膜通透性改變、外排泵形成等多種機制協(xié)同作用，單純依靠蛋白質(zhì)特征峰度的改變往往很難準確對其鑒別。MRSA的耐藥機制相較于多重耐藥陰性桿菌略顯簡單，mecA基因是MRSA耐藥性的決定基因，通過PCR檢測mecA基因被認為是MRSA檢測的“金標準”[16,17]。夏雯等[18]通過PCR方法檢測某院ICU肺炎患者痰液標本中分離出的MRSAmecA基因攜帶率為100%。2016年，Koupahi等[19]比較了4種表型鑒定方法與PCR法檢測MRSA，結(jié)果發(fā)現(xiàn)頭孢西丁紙片擴散法和PCR檢測的結(jié)果一致，靈敏度和特異度均為100%，苯唑西林紙片擴散法的靈敏度為95.42%。因此，本研究采用了頭孢西丁紙片擴散法與PCR法篩選MRSA，且2種方法的鑒定符合率為100%。

目前，全球市場中基于MALDI-TOF MS技術(shù)的微生物鑒定主要是MALDI BioTyper系統(tǒng)和VITEK MS系統(tǒng)[20]。國外學(xué)者[21]最早利用質(zhì)譜儀對金黃色葡萄球菌進行快速區(qū)分，發(fā)現(xiàn)大多數(shù)質(zhì)譜峰為葡萄球菌所共有，部分為MRSA所特有，部分為MSSA所特有，且質(zhì)譜峰數(shù)量MRSA多于MSSA，由此發(fā)現(xiàn)質(zhì)譜儀具備區(qū)分MRSA和MSSA的能力。2014年，Lasch等[22]采用MALDI-TOF MS來分析MRSA和MSSA的特征峰，但最終結(jié)果未能直接發(fā)現(xiàn)兩者蛋白圖譜的差異。Hu等[23]在2015年報道MALDI-TOF MS可用于準確鑒定葡萄球菌屬，并發(fā)現(xiàn)MSSA的特征峰集中在3 279、6 485、6 555 m/z，MRSA的特征峰為3 299 m/z，MSSA 及MRSA的準確鑒定率分別為90.9%和83.3%，但該研究中采用的是MALDI Biotype系統(tǒng)及ClinProTools 3.0軟件。同樣，2018年Wang等[24]通過ClinProTools軟件分析出了MRSA在2 082～6 594 m/z范圍10個最特異性的峰值。這些報道均采用BioTyper系統(tǒng)進行檢測，利用聚類分析和統(tǒng)計學(xué)方法，需要對比多株細菌圖譜，不適用于臨床單個菌株的快速鑒定。本研究以PCR結(jié)果為“金標準”，利用VITEK MS系統(tǒng)比對分析MRSA和MSSA圖譜的差異，建立兩者各自的SuperSpectra并用于臨床鑒定。此方法可以在10min內(nèi)實現(xiàn)單個樣本的快速鑒定，具有高通量、敏感度高、特異度高等優(yōu)點，彌補了傳統(tǒng)的MRSA鑒定方法操作復(fù)雜、耗時長等缺點。通過SuperSpectra的差異發(fā)現(xiàn)質(zhì)荷比為3 036.0、3 875.3 Da為MRSA的主要特征峰，而質(zhì)荷比為5 054.0 Da為的MSSA的主要特征峰，新建SuperSpectra對MRSA和MSSA鑒定正確率分別為89.8%和87.5%，結(jié)果表明新建SuperSpectra可以快速區(qū)分MRSA和MSSA，可用于對本地區(qū)MRSA的快速篩選。本研究中的特征峰與文獻報道[23-24]不同，可能受到不同實驗條件及所收集菌株分布流行的地區(qū)差異，導(dǎo)致蛋白質(zhì)指紋圖譜的差異，從而影響特征性峰的變化。本研究所收集菌株均來源于同一家醫(yī)院，后續(xù)將進一步納入多中心不同來源的樣本進行分析，進一步驗證所建SuperSpectra的適用范圍。

有研究[25]表明培養(yǎng)條件和菌體蛋白提取方法會影響獲得的圖譜質(zhì)量，從而影響建庫的質(zhì)量控制，因此本研究建立SuperSpectra時盡可能統(tǒng)一培養(yǎng)條件并采用了VITEK? MS Plus手冊中的標準蛋白提取方法，但由于微生物生長環(huán)境不同及其他干擾因素，蛋白質(zhì)的特征峰會出現(xiàn)一定的誤差，因此建庫時設(shè)置特征峰error值<0.05是可接受的誤差范圍。本研究新建MRSA SuperSpectra在驗證過程中出現(xiàn)了4株未獲得結(jié)果的菌株，通過比較圖譜，4株耐藥菌在3 036.0 Da和3 875.3 Da處出現(xiàn)特征峰，而在5 054.0 Da處沒有特征峰，可能是由于這些菌株與SARAMIS數(shù)據(jù)庫中標準菌株的特征峰重合率更高，因而未被新建SuperSpectra識別。驗證過程中有5株MRSA，經(jīng)SuperSpectra鑒定為MSSA，可能是由于菌株來源、培養(yǎng)條件及抗菌藥物的壓力作用等因素，導(dǎo)致菌體蛋白的表達出現(xiàn)差異，建庫特征峰未能準確匹配，從而影響了鑒定結(jié)果。及時完善數(shù)據(jù)庫指紋圖譜可以提高鑒定的準確率及效率，因此SuperSpectra通過每年的更新，進一步增加具有地域分布特征的耐藥菌株和敏感菌株到數(shù)據(jù)庫中，以減少數(shù)據(jù)庫對未知菌株誤判和漏判的情況發(fā)生。

綜上所述，VITEK MS在新建SuperSpectra的基礎(chǔ)上，有助于快速鑒別MRSA和MSSA，且具有操作簡捷、準確、靈敏的優(yōu)點。