甘露醇對缺血再灌注大鼠腦保護作用的機制研究

羅志中，馮 凱，羅雅琪

(1.河北省唐山市人民醫院心內科，河北 唐山 063000；2.華北理工大學附屬醫院重癥醫學，河北 唐山 063000；3.承德醫學院臨床醫學系，河北 承德 067000)

腦梗死是人類死亡的主要原因，由中風引起的后遺癥相關殘疾也是該病危害人類的重要因素[1]。約80%的腦梗死患者是由大腦動脈阻塞引起的缺血性腦梗死，其導致缺血腦部的功能障礙和細胞死亡[2]。當然通過再灌注可恢復血液拯救缺血組織，但再灌注本身會導致組織損傷，即腦缺血再灌注損傷[3]。近年來，隨著缺血性腦梗死血管內治療的進展，腦缺血再灌注損傷相關的神經保護策略日益嚴峻。腦缺血再灌注損傷的生理病理過程包括氧化應激、炎癥及神經元凋亡等[4-5]。甘露醇作為降低顱內壓的常用藥物，在臨床應用中已得到認可。據報道，甘露醇對腦損傷患者的視神經也具有保護作用[6]。本研究旨在探究甘露醇對缺血再灌注腦損傷大鼠神經缺損、炎癥氧化應激及神經元凋亡的調控及潛在機制。

1 材 料 與 方 法

1.1一般資料

1.1.1實驗動物來源 60只雌性SD大鼠(6～7 周)，(250±30) g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司。在 23～25 ℃、光照黑夜各半、50%濕度的環境下飼養。手術前大鼠禁食12 h。

1.1.2藥物、試劑及儀器 20%甘露醇注射液(國藥準字H32025228)購自江蘇恒瑞醫藥股份有限公司；鼠腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)酶聯免疫吸附試驗(enzymelinked immunosorbentassy，ELISA)檢測試劑盒、鼠白細胞介素6(interleukin-6，IL-6)ELISA 檢測試劑盒、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性檢測試劑盒、丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量檢測試劑盒均購自北京索萊寶科技有限公司；MAPK信號通路激活劑鹽酸二甲雙胍(S1950)購自美國Selleck公司；TdT介導的dUTP末端標記法(terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick end labeling，TUNEL)細胞凋亡檢測試劑盒、蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin，HE)染色試劑盒、2,3,5-氯化三苯基四氮唑(2,3,5-triphenyltetrazolium chloride，TTC)染色液購自上海碧云天生物技術有限公司。

1.2方法

1.2.1模型大鼠的建立 戊巴比妥腹腔注射麻醉大鼠，頸部中線切開，剝離頸部總、外、內動脈。在近心端的總動脈做切口，塞入尼龍線栓，穿入頸內動脈，阻斷大腦動脈供血2 h。拉出栓塞線，恢復血流，制作腦缺血再灌注模型。假手術組大鼠僅做分離頸總、外、內動脈分離，不做血管栓塞處理。待大鼠麻醉蘇醒后，進行神經功能缺損評分。

1.2.2大鼠分組與處理 將60只大鼠隨機分為4組，每組15只，設為假手術組、模型組、甘露醇組、甘露醇+二甲雙胍組。假手術組、模型組大鼠的處理同方法部分1.2.1。除假手術組外，其余大鼠均需進行造模。甘露醇組：大鼠在造模后，尾靜脈注射15 mL/kg的20%甘露醇，6 h/次，給藥24 h，4次。甘露醇+二甲雙胍組：甘露醇尾靜脈注射給藥的基礎上，給予二甲雙胍腹腔注射250 mg/kg，1次/d。假手術組、模型組大鼠：尾靜脈注射等量的生理鹽水。24 h后，進行神經功能缺損檢測。結束后，眼眶后靜脈叢采血，3 000 r/min，取血清，-20 ℃保存。

1.2.3指標的測定

1.2.3.1大鼠神經功能缺損評分 依照Zea-Longa 5分評分標準[7]對大鼠神經缺損程度進行評分，分值越高缺損越嚴重。

1.2.3.2腦組織含水量檢測 斷頭法處死大鼠，摘取腦組織，稱重(g)，記錄為腦濕重。110 ℃烘烤48 h，稱重，記錄為腦干重。腦組織含水量(%)=(腦濕重-腦干重)/腦濕重×100%。

1.2.3.3腦組織梗死率測定 斷頭法處死大鼠，快速摘取腦組織，置于預冷的PBS中，-20 ℃冰箱保存30 min，剔除嗅球、小腦。切成2 mm的切片組織，進行1%TTC染色，37 ℃避光5 min。肉眼可見白色梗死區，再用4%多聚甲醛固定。Image J測量梗死面積、大腦總面積。腦梗死率(%)=梗死面積/總面積×100%。

1.2.3.4海馬組織HE染色 取甲醛固定的海馬組織，制作石蠟切片。操作步驟按照HE染色試劑盒說明書要求操作，染色、固定、封片，200倍顯微鏡下觀察海馬神經元變化。

1.2.3.5ELISA實驗檢測血清TNF-α、IL-6、SOD、MDA 按照鼠TNF-α ELISA檢測試劑盒、鼠IL-6 ELISA 檢測試劑盒、SOD活性檢測試劑盒、MDA含量檢測試劑盒的說明書要求操作，檢測血清TNF-α、IL-6、SOD、MDA。

1.2.3.6TUNEL檢測腦組織神經元凋亡率 按照一步法TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒說明書中的石蠟切片處理腦組織。末端轉移酶：生物素-dUTP按照1∶10的比例配置生物素標記液。用生物素標記液標記組織切片，37 ℃避光孵育1 h。洗滌后，進行顯色。鏈霉親和素工作液孵育30 min，洗滌，DAB顯色液。洗滌，用蘇木素染色液進行核染，洗滌。最后用乙醇脫水，二甲苯透明，封片。400倍顯微鏡下觀察神經元的凋亡情況，拍照。陽性的凋亡神經元為棕黃色，使用Image J圖像分析軟件計算陽性細胞數、總細胞數，取平均值。總凋亡率(%)=腦組織凋亡率-陽性細胞數/總細胞數×100%。

1.2.3.7WB實驗檢測腦組織p-p38、p-ERK1/2、p38、ERK1/2蛋白表達 RIPA裂解液充分裂解研磨的腦組織，提取總蛋白，并BCA定量，沸水變性。十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)試劑盒展開蛋白電泳。配置10%的分離膠，8.2%的濃縮膠，灌膠。用變性蛋白上清上樣，45 V電泳2.5～3 h，蛋白條帶至濃縮膠下緣，調整電壓至120 V電泳1～2 h至條帶跑到分離膠下緣1 cm處。0 ℃預冷轉膜儀，蛋白濕轉至PVDF膜，期間維持系統在0 ℃。結束后，將膜用封閉液37 ℃封閉處理2 h。用電泳液漂去浮沫，浸入一抗溶液，4 ℃孵育過夜。漂洗后，轉入二抗溶液，37 ℃孵育1.5 h。漂洗，電化學發光液顯色，凝膠成像系統顯影，曝光。Image J軟件分析條帶的灰度，用蛋白條帶的相對灰度值表示蛋白的表達量。

1.3統計學方法 應用SPSS 23.0統計分析軟件處理數據。計量資料比較采用單因素方差分析、SNK-q檢驗和獨立樣本t檢驗。P<0.05為差異有統計意義。

2 結 果

2.1四組大鼠神經功能缺損評分 與假手術組相比，模型組大鼠神經功能缺損顯著升高，腦組織含水量顯著升高，腦梗死率顯著升高(P<0.05)；與模型組相比，甘露醇組大鼠神經功能缺損、腦組織含水量、腦梗死率均顯著降低(P<0.05)；與甘露醇組相比，甘露醇+二甲雙胍組大鼠神經功能缺損、腦組織含水量、腦梗死率均明顯升高(P<0.05)，見表1。

表1 大鼠神經功能缺損及腦梗死情況Table 1 Neurological deficit and cerebral stroke in rats

2.2四組大鼠海馬組織病理變化 假手術組大鼠神經元排列整齊，緊致，結構完整，而模型組神經元之間間隙增大，排列疏松、神經元變形，核仁殘缺。與模型組相比，甘露醇組大鼠神經元有明顯恢復，核仁染色有明顯恢復，細胞間排列明顯緊致。與甘露醇組相比，甘露醇+二甲雙胍組神經元的上述病理變化明顯嚴重。見圖1。

圖1 大鼠海馬組織(HE染色 ×100)

2.3四組大鼠血清炎癥、氧化應激因子的變化 與假手術組相比，模型組大鼠血清TNF-α、IL-6、MDA均顯著升高，SOD顯著降低(P<0.05)；與模型組相比，甘露醇組大鼠血清TNF-α、IL-6、MDA均顯著降低，SOD顯著升高(P<0.05)；與甘露醇組相比，甘露醇+二甲雙胍組大鼠血清TNF-α、IL-6、MDA均升高，SOD降低(P<0.05)，見表2。

表2 大鼠血清炎癥、氧化應激因子變化Table 2 Changes of serum inflammatory and oxidative stress factors in rats

圖2 大鼠腦組織神經元凋亡情況

2.4四組大鼠腦組織神經元凋亡變化 與假手術組相比，模型組大鼠腦組織神經元凋亡率顯著升高(P<0.05)；與模型組相比，甘露醇組大鼠腦組織神經元凋亡率顯著降低(P<0.05)；與甘露醇組相比，甘露醇+二甲雙胍組大鼠腦組織神經元凋亡率升高(P<0.05)，見圖2。

2.5四組大鼠腦組織MAPK信號通路活性變化 與假手術組相比，模型組大鼠腦組織p-p38、p-ERK1/2蛋白表達顯著升高(P<0.05)；與模型組相比，甘露醇組大鼠腦組織p-p38、p-ERK1/2蛋白表達顯著降低(P<0.05)；與甘露醇組相比，甘露醇+二甲雙胍組大鼠腦組織p-p38、p-ERK1/2蛋白表達升高(P<0.05)，見表3、圖3。

表3 大鼠腦組織MAPK信號通路活性Table 3 Activity of MAPK signaling pathway in rat brain tissue

圖3 MAPK信號通路關鍵基因的蛋白表達

3 討 論

甘露醇在臨床治療中多用于降低顱腦血壓，但是也有學者認為過量使用會加重患者的顱內壓及腦損傷[8-9]。Huang等[10]在創傷性腦損傷患者的臨床觀察中發現，20%甘露醇、10%高滲鹽水可降低創傷性腦損傷的顱內壓、升高血清鈉含量，升高血清滲透壓。Patil等[11]報道，20%甘露醇、3%高滲鹽水、10%甘露醇混合10%甘油組、對創傷性腦損傷患者的低血容量、低鈉血癥或腎功能衰竭均有療效，但是，在神經功能方面僅20%甘露醇有效。王琴等[12]在研究中發現，甘露醇聯合丁苯酞治療能夠降低急性腦梗死患者的氧化應激反應，改善神經功能和生活質量。因此本研究猜測甘露醇可能對腦損傷引起的神經功能障礙具有一定的作用。本研究建立了缺血再灌注腦損傷大鼠模型，模型大鼠的神經功能缺損、腦組織含水量、腦梗死率均升高，血清TNF-α、IL-6、MDA升高，SOD降低，腦組織神經元凋亡率升高，說明缺血再灌注腦損傷大鼠模型制造成功。20%甘露醇治療的大鼠神經功能缺損、腦組織含水量、腦梗死率均明顯下降，炎癥、氧化應激反應也受到抑制，神經元凋亡情況得到改善，這些實驗說明甘露醇對缺血再灌注腦損傷的具有保護作用。

近兩年，國內外很多研究均報道，MAPK信號通路的抑制在腦損傷后大腦的抗炎、抗氧化應激及自我修改中發揮積極的有益功能[13-14]。王明程等[15]在研究中發現，缺血再灌注損傷小鼠腦組織內MAPK信號通路關鍵基因p-JNK、p-ERK1/2、p-p38的蛋白表達上調，該通路被異常激活；異丙酚處理后的模型小鼠腦組織p-JNK、p-ERK1/2、p-p38的表達受到抑制，小鼠的學習與記憶能力得到恢復。本研究發現，MAPK信號通路基因p-p38、p-ERK1/2在缺血再灌注腦損傷大鼠腦組織中表達升高，這與該通路在腦部損傷相關疾病中異常激活的實驗結果相吻合。甘露醇治療后，大鼠腦組織中p-p38、p-ERK1/2的表達明顯受到抑制，而二甲雙胍能夠明顯減弱甘露醇對p-p38、p-ERK1/2的抑制作用，上調MAPK信號通路的活性。此研究結果說明甘露醇可抑制缺血再灌注大鼠腦組織MAPK信號通路的活性，二甲雙胍作為MAPK信號通路激活劑可再次激活缺血再灌注大鼠MAPK信號通路。重要的是，二甲雙胍再次激活MAPK信號通路后，甘露醇治療的模型大鼠神經功能缺損、腦組織含水量、腦梗死率又明顯加重，炎癥、氧化應激反應也升高，神經元凋亡再次升高，這說明了MAPK信號通路在甘露醇保護缺血再灌注大鼠腦損傷中的重要性。

綜上所述，甘露醇可減輕缺血再灌注損傷造成的神經功能缺損、腦組織的水腫、梗死及炎癥氧化應激和神經元的凋亡，保護腦損傷，這種作用與抑制MAPK信號通路有關，為腦血管損傷疾病的臨床治療提供參考。