調控miR-181d-5p表達對宮頸癌細胞增殖、凋亡、侵襲的影響

仝亞坤，趙丹丹，安國靜

(1.河北省石家莊市第三醫院婦產科，河北 石家莊 050011；2.河北省石家莊市第四醫院婦產科，河北 石家莊 050035；3.河北中石油中心醫院婦產科，河北 廊坊 065000)

宮頸癌是全世界女性常見的癌癥，隨著預防和治療概念和知識的發展迅速，人類乳頭瘤病毒(human papilloma virus，HPV)已被確定為導致宮頸癌的主要因素[1-2]。雖然在大多數宮頸癌病例中發現了HPV感染[3]，但疾病進展需要遺傳和表觀遺傳學改變, DNA甲基化和組蛋白修飾引起的表觀遺傳改變在宮頸癌中已被廣泛研究，非編碼RNA，尤其是microRNA也在宮頸癌的發生發展中發揮重要作用[4-5]。MiR-181d是一種對腫瘤具有調控作用的microRNA，可通過調節胞內磷脂酰肌醇激酶(intracellular phosphatidylinositol kinase，PI3K)/蘇氨酸蛋白激酶(threonine protein kinase，AKT)途徑抑制胃癌細胞增殖和轉移[6]，還可以通過調節KNAIN2基因的表達對胰腺癌的發生起抑制作用[7]，同時也可以通過調控IGF1/PI3K信號通路對膠質瘤細胞周期發揮干預作用[8]。由此可見miR-181d是多種腫瘤的分化、增殖、凋亡調控的重要調控分子，但其在宮頸癌中的作用尚不清晰。細胞硫酰化限速酶(sulfation rate-limiting enzyme，PAPSS2)/蛋白聚糖(proteoglycans，VCAN)是調控腫瘤細胞遷徙的重要信號通路，PAPSS2基因的甲基化/羥甲基化修飾也與宮頸癌的總體生存率顯著相關[9], VCAN也可以作為癌癥的獨立風險預測標志物[10]， miR-181d是否可以通過PAPSS2/VCAN信號通路對宮頸癌細胞發揮調控作用有待深入研究，因此本研究擬通過細胞實驗探究轉染miR-181d-5p對宮頸癌增殖、凋亡和侵襲的影響，分析是否會引發PAPSS2/VCAN表達的變化，并通過裸鼠荷瘤實驗在體內證實miR-181d-5p對宮頸癌生長的影響，為miR-181d-5p在宮頸癌細胞中發揮的作用提供分子機制和理論基礎。

1 材 料 與 方 法

1.1材料 人宮頸癌細胞系Hela購自國家模式與特色實驗細胞資源庫/國家科技資源共享服務平臺(上海)。8周齡雌性SPF級裸鼠20只，(20±2)g，購于中生北動(北京)科技發展有限公司，使用許可證號：SYXK(京)2019-0051，飼養條件為：溫度(22±2)℃，濕度(55±5)%，12 h黑暗/12 h光照，自由飲水飲食，適應性飼養1周后隨機分組。

1.2主要器材及試劑 MTT Assay試劑盒(Cell Proliferation)(ab211091)、Annexin V-FITC Apoptosis Staining/Detection Kit(ab14085)購于美國abcam公司；Lipofectamine TM 3000 Reagent轉染試劑購自于美國Thermo Fisher Scientific 公司；miR-181d-5p質粒及NC 質粒由吉瑪基因有限公司合成；細胞培養皿等試驗耗材購于美國BD公司，倒置顯微鏡購于德國蔡司公司；Western blot電泳儀器購自美國BIO-RAD公司；流式細胞分析儀FACS Calibur購于美國BD公司。

1.3方法

1.3.1細胞培養及質粒轉染方法 人宮頸癌細胞Hela細胞培養條件:生長培養基DMEM(gibico，貨號:11995040)+10% FBS(gibico 貨號: 16000-044)+1% P/S(gibico，貨號15140-022);培養條件：空氣 95%；CO25%;溫度37 ℃，培養密度：1×106cells/培養皿；換液及傳代：每隔1 d更換培養液，2～3 d傳代，傳代比例為1∶3～4。轉染條件：按照LipofectamineTM 3000說明書對細胞進行轉染NC質粒和miR-181d-5p質粒，轉染6～8 h后更換完全培養基，CO25%;溫度 37 ℃培養。人宮頸癌細胞Hela細胞分為對照組、NC組和miR-181d-5p組。

1.3.2裸鼠荷瘤 將處于對數生長期的人宮頸癌細胞Hela以PBS調整細胞密度為1×107個/mL的細胞懸液。將細胞懸液用1 mL無菌注射器接種于20只裸鼠左側背部皮下，每只裸鼠注射0.2 mL。隨機分為對照組(n=10)和miR-181d-5p組(n=10)。對照組注射野生型Hela細胞，miR-181d-5p組注射轉染miR-181d-5p的Hela細胞，7 d后測量腫瘤體積，建模成功的判斷標準:皮下瘤塊體積≥0.5 cm3，腫瘤生長達不到標準的進行裸鼠不進入實驗，成瘤后每3 d用游標卡尺測量皮下瘤塊的長短徑，計算瘤體積=長徑×短徑×短徑1/2[11]，連續21 d，繪制2組裸鼠腫瘤生長曲線及每只裸鼠腫瘤生長曲線。

1.3.3MTT實驗 將消化后的細胞用完全培養基重懸，接種于96孔培養板；細胞密度為103～104個/孔，每孔培養基總量200 mL，37 ℃、5%CO2培養箱中培養。嚴格按照MTT操作說明進行實驗，加入2 g/L的MTT液(50 μL/孔)，繼續培養3 h，吸出孔內培養液后，加入DMSO液(150 μL/孔)，將培養板置于蕩器上振蕩10 min，使結晶物溶解，酶標儀檢測各孔OD值(波長=570 nm)，每孔設置3個副孔，進行檢測。

1.3.4細胞凋亡實驗 將各組細胞用不含乙二胺四乙酸的胰酶消化后， 800 r/min 4 ℃離心5 min收集細胞。用預冷的PBS洗滌細胞2次，800 r/min 4 ℃離心5 min。收集細胞加入100 μL 1×Binding Buffer重懸細胞。嚴格按照試劑盒要求加入5 μL Annexin V-FITC和10 μL PI Staining Solution，輕輕混勻，反應條件為：避光、室溫10～15 min；加入400 μL 1×Binding Buffer，混勻后放置于冰上；樣品在1 h內用流式細胞儀檢測。

1.3.5Transwell侵襲實驗 按照Transwell說明在培養板下室加入300 μL完全培養基(含有FBS的培養基)，37 ℃，5 %CO2培養24 h。擦去Matrigel凝膠和聚碳酯膜上表面的細胞，小心取出上室做好標記，用棉簽擦去上室面細胞，取2 mL固定液加入孔板，放入Transwell，固定10～15 min，PBS清洗2次，每次5 min；在孔板中加入1 mL染色液，使Transwell浸泡在液體中， 10 min后棄掉染色液，加入1 mL調色液A，加一滴調色液B，溫和混勻；用PBS清洗1次，用刀片取下膜，放在載玻片上，加1～2滴封片液，蓋上蓋玻片，隨機選取3個視野進行計數顯微鏡下觀察。

1.3.6Western blot 檢測蛋白表達 取出生長對數期的細胞，加入1 mL RIPA提取裂解液制成蛋白提取液，使用BCA法測定蛋白濃度。加入5×SDS的蛋白上樣緩沖液煮沸后，用1.5 mL EP管分裝后保存于-80 ℃冰箱備用。將樣品分別加入不同的泳道進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，濃縮膠電壓80 V，10 min,分離膠電壓120 V，1.5 h, 轉至PVDF膜，用5%BSA封閉。加入特異性一抗PAPSS2(1∶3 000，ab155585，abcam，英國)，VCAN(1∶5 000，ab177480，abcam，英國)，GAPDH(1∶10 000，ab16663，abcam，英國)于4 ℃冰箱過夜。TBST洗膜3次，加入特異性的羊抗兔二抗(1∶2 000)，孵育1 h。TBST洗膜3次，采用ECL化學發光液曝光顯影，使用photoshop圖像分析軟件系統進行半定量分析。

1.4統計學方法 應用SPSS 25.0統計軟件分析數據。計量資料比較采用兩獨立樣本t檢驗、單因素方差分析和SNK-q檢驗。P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1miR-181d-a-5p對人宮頸癌細胞Hela細胞活力的影響 與對照組和NC組比較，miR-181d-5p組細胞增殖受到顯著抑制，并且隨著時間的增加抑制作用進一步增強，差異有統計學意義(P<0.01)，NC組與對照組差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 miR-181d-a-5p對人宮頸癌細胞Hela細胞活力的影響Table 1 Effect of miR-181d-a-5p on the viability of human cervical cancer Hela cells

2.2miR-181d-5p對人宮頸癌Hela細胞凋亡的影響 miR-181d-5p對人宮頸癌Hela細胞具有顯著的促進凋亡作用，流式結果表明,與對照組和NC組比較，miR-181d-5p組細胞凋亡顯著升高，差異有統計學意義(P<0.01)，NC組與對照組差異無統計學意義(P>0.05)。見圖1，表2。

表2 miR-181d-a-5p對人宮頸癌細胞Hela細胞凋亡的影響Table 2 Effect of miR-181d-5p on apoptosis of human cervical cancer Hela cells

圖1 miR-181d-5p對人宮頸癌細胞Hela細胞凋亡的影響

2.3miR-181d-5p對人宮頸癌細胞Hela遷移和侵襲能力的影響 Transwell 結果表明，miR-181d-5p對宮頸癌細胞侵襲具有顯著的抑制作用，與對照組和NC組比較, miR-181d-5p組細胞侵襲數量顯著降低，差異有統計學意義(P<0.01)， NC組與對照組差異無統計學意義(P>0.05)。見圖2，表3。

圖2 miR-181d-5p對人宮頸癌細胞Hela侵襲能力的影響

表3 miR-181d-a-5p對人宮頸癌細胞Hela細胞侵襲數量的影響Table 3 Effect of miR-181d-a-5p on the invasion number of human cervical cancer Hela cells

2.4miR-181d-5p對人宮頸癌細胞Hela細胞PAPSS2/VCAN信號通路的影響 與對照組和NC組比較，miR-181d-5p組PAPSS2和VCAN蛋白表達均有降低趨勢，差異有統計學意義(P<0.01)，NC組與對照組差異無統計學意義(P>0.05)。見圖3，表4。

2.5miR-181d-5p對裸鼠腫瘤生長的影響 兩組裸鼠荷瘤后精神狀態均較好、活動頻繁、飲食飲水量正常。荷瘤第7天對小鼠進行篩選，各組有5只裸鼠腫瘤體積≥0.5 cm3且大小均一，超腫瘤體積未達到實驗標準者未入組本試驗。miR-181d-5p組裸鼠腫瘤體積顯著低于對照組裸鼠，miR-181d-5p組裸鼠平均生長受到顯著抑制，在第21天時腫瘤質量顯著低于對照組小鼠，差異有統計學意義(P<0.01)。見表5。

圖3 miR-181d-5p對Hela細胞PAPSS2/VCAN蛋白的影響

表4 miR-181d-a-5p對人宮頸癌細胞Hela細胞PAPSS2/VCAN信號通路蛋白的影響Table 4 Effect of miR-181d-a-5p on PAPSS2/VCAN signaling pathway proteins of human cervical cancer Hela cells

表5 miR-181d-5p對裸鼠腫瘤生長的影響Table 5 Effect of miR-181d-5p on tumor growth in nude mice

3 討 論

子宮頸癌是女性癌癥死亡的主要原因之一。在世界范圍內，子宮頸癌是女性第四常見的惡性腫瘤，估計每年新增53萬例，死亡27萬例,全世界約85%的宮頸癌死亡發生在不發達國家或發展中國家，低收入和中等收入國家的病死率是發達國家的18倍[12-13]。HPV感染是宮頸癌發生的主要病因。高危型HPV感染和HPV基因組整合到宮頸上皮細胞的宿主染色體是宮頸病變腫瘤進展的關鍵早期事件[14]。高浸潤性宮頸癌發生發展中伴隨這基因組和表觀基因組的調控，是由高危型HPV引起的，通常先于上皮內瘤變的一個長階段。在侵襲之前，HPV宿主細胞中發生表觀基因組改變，如microRNA表達失調，在肝癌中經常被觀察到[15]， MiR-181d-5p在多種組織中具有調控作用，如可通過PI3K/AKT途徑促進PC12細胞的神經軸突生長[16], 同時miR-181d-5p和miR-409-3p在膠質母細胞瘤中的協同調控作用[17],miR-181d-5p可以通過調控骨保護素抑制破骨細胞的生成[18]，但MiR-181d-5p在宮頸癌發生中的機制和作用方式仍不完全清楚。本研究通過人子宮頸癌細胞轉染MiR-181d-5p證實，MiR-181d-5p可以抑制子宮頸癌細胞的增殖能力，增加細胞凋亡比例，提示MiR-181d-5p對腫瘤細胞的增殖發生干預和調控作用。

本研究通過Transwell實驗證實MiR-181d-5p可以顯著抑制腫瘤細胞的侵襲，因此關注了腫瘤細胞侵襲相關的重要信號通路PAPSS2/VACN信號通路在此過程中的變化。PAPSS2在腫瘤細胞的侵襲中發揮重要作用，PAPSS2的升高導致細胞中硫酸化修飾增加，破壞細胞外基質(extracellular matrix, ECM)的內穩定性。不平衡的ECM觸發上皮-間充質轉化程序并促進細胞遷移和轉移[19]。VCAN屬于硫酸軟骨素蛋白多糖組，是細胞外基質的主要成分之一，通過直接或間接與細胞和分子相互作用，與細胞因子、生長因子、細胞表面和基質蛋白及其蛋白核心形成合適的細胞外微環境，從而誘導腫瘤侵襲和轉移,在細胞黏附、存活、增殖、遷移和ECM組裝中發揮重要作用[20]。本研究通過Western blot 實驗證實，轉染miR-181d-5p的細胞 PAPSS2蛋白和VCAN蛋白的表達水平顯著降低，提示出宮頸癌胞外基質功能的紊亂，干預了細胞黏附相關的信號通路，從而抑制了腫瘤細胞的侵襲能力。同時通過建立裸鼠荷瘤模型進一步證實了MiR-181d-5p在體內的作用，MiR-181d-5p組小鼠的腫瘤生長顯著受到抑制，生長曲線顯著低于對照組，并且腫瘤質量降低，提示出MiR-181d-5p對腫瘤生長具有顯著的抑制作用，進一步驗證了細胞學實驗的結論。

綜上所述，miR-181d-5p具有抑制子宮頸癌細胞增殖、促進子抑制宮頸癌細胞凋亡及并抑制侵襲的作用，其機制可能與抑制PAPSS2/VCAN信號通路活性相關，本研究將進一步通過臨床樣本進行驗證，探究PAPSS2/VACN蛋白在子宮頸癌組織和癌旁組織的表達，從原位上證實miR-181d-5p對宮頸癌的調控作用，而為臨床診斷提供理論基礎。